专利名称：：一种链霉菌及其在还原芳香酮中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物催化领域，特别是涉及一种链霉菌及其在还原大环刚性芳香酮，如取代苑酮中的应用。
背景技术：
：芳香醇或光学活性芳香醇是许多药物中间体、催化剂、分析试剂食品添加剂和先进光导材料的重要结构单元。目前，在化学上主要是通过芳香酮的还原获得。但在化学上其合成方法存在歩骤繁琐、产率低、成本高、环境污染严重等问题。原因在于芳香酮的刚性结构产生高的空间位阻，阻止了催化剂的接近。尤其对于一些刚性大环芳香酮的还原或立体选择性还原如取代芴酮在有机合成上仍是一个挑战性的课题。例如治疗抗疟药一本芴醇的合成过程中，虽然合成路线经过改进(钟景星等，中国专利1999,1029680)，但从2，7-二氯芴_4-氯乙酰芴(IV)到醇的还原过程中需要经过两步，其中易爆催化剂KB仏加氢还原，反应条件剧烈难以控制，而且三废严重和产率低。再比如，重要有机合成中间体一芴醇的合成过程中，需通过碱性煮沸的条件下来水解溴芴得到芴醇，反应.条件苛刻、产物分离困难(陈忠秀，化学试剂，2003,25(3),177178)。再比如光学活性芳香醇的合成就更加困难。虽然可通过不对称合成或还原后手性拆分等方法获得手性芳香醇，但这两种方法步骤繁琐，拆分设备昂贵，实现大规模的工业化生产困难。例如液晶材料制备过程中，除采用易爆催化剂NaBft还原中间产物芳香酮后，还需用半制备高效液相色谱拆分的方法，得到含有光学活性芳香醇结构的中间体化合物，仍然面临产率和立体选择性低等问题(RobertP.Lemieux等，J.AM.CHEM.SOC.2004(126)，1161-1167)。鉴于芳香醇类化合物的重要性及化学合成方法所面临的困难，采用生物催化技术制备芳香醇类化合物应是解决上述问题的一个重要途径。生物催化剂即生物酶或生物活细胞，具有高度的化学、区域和立体选择性，并能在温和的条件下进行，.如室温、中性或接近中性pH，避免或减少产物的分解、异构化、消旋和重排反应，以及产率高、能耗低、环境友好等多种优势(JohnM.Woodley，TrendsinBiotechnology,2008(26)，321-327;许建和等，生物加工过程，2008(6)，1-9)。
发明内容本发明的目的是针对芳香酮尤其是刚性大环芳香酮难还原的特点及化学方法条件苛刻、难以控制、产率和立体选择性低、存在环境污染等问题，通过科学方法筛选、驯化高效还原芳香酮菌株，以解决化学合成及工业上制备芳香醇及光学活性芳香醇的难题，同时解决环境污染等问题。本发明的技术方案是本发明所述的链霉菌具体的筛选驯化歩骤如下从卜.海郊区土壤中取少量土样，加入到液体大筛选培养基中进行摇床培养，温度28'C，转速170rpm，液体大筛选培养基配方是可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黄豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP040.05g，水1L，pH7.0-7.2;当培养基变得浑浊，进行转接分瓶稀释培养，在进行涂布固体筛选平板，将固体平板放入光照培养箱中培养，3CTC、培养4-5天，挑单菌落，固体筛选平板配方为可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，琼脂15g，水1L，pH7.0-7,2;然后将挑选的各个单菌体进行液体培养基扩大培养，离心(5000rpm，10min)收集菌体细胞；分别加入芳香酮一取代芴酮，筛选得到一株具有芳香酮还原活性的菌株，再将此菌株进行驯化，加入不同浓度(0.05rao1，0.1mo丄，0.2mol，0.4mol,0.8mol)的取代芴酮进行传代培养，使其能够耐受高浓度的取代芴酮底物，最后得到筛选驯化的菌株。经筛选驯化的菌株具有如下的微生物学特征在放线菌大筛选培养基上菌落茧白或灰白，表面平坦，菌丝发达，多分枝，无隔，呈杆状。能在大多数培养基上生长良好，气生菌丝和基内菌丝均以白色或白灰为主。明胶液化，牛奶凝固及淀粉水解、酪氨酸水解呈阳性，纤维素上不生长，不产生硫化氢，能利用大部分的受试碳源，全细胞氨基酸分析表明含有天冬氨酸，全细胞糖分析表明含有半乳糖。根据文献"伯杰细菌鉴定手册"(第八版)及基于16SrpNA(GeneBank登录号为EU216596)的系统进化分析和形态学特征，可初步定为链霉菌的一个新种，因此将其命名为Str印tomycessp.DUT003。己于2008年5月23日已在国家知识产权局专利局指定的保藏学.位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位简称CGMCC，保藏编号为2518，分类命名为Str印tomycessp.DUT003，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。本发明所述的链霉菌在还原芳香酮一取代芴酮中的应用具体操作为将湿重为10-100g/L的链霉菌悬浮在pH7.0-8.0的20mMTris-HCl或20mMHEPES缓冲液中，加入浓度为0.1-lmmol/L的芳香酮化合物一取代芴酮(氟芴酮、氯芴酮、溴莉酮、碘芴酮或甲基芴酮)，然后置于3(TC、转速170rpm的摇床巾，反应2-12h，获得相应的芳香醇或光学活性芳香醇，反应转化率为89-98%，立体选择性为83-100%;或者是将湿重为10-100g/L的链霉菌悬浮在pH7.0-8.0、含体积比5%助溶剂的20mMTris-HCl或20mMHEPES缓冲液中，加入浓度为0.l-10mmol/L的芳香酮化合物.一取代莉酮(氟芴酮、氯芴酮、溴芴酮、碘芴酮或甲基芴酮)，然后置于3(TC、转速170rpm的摇床中，反应2-12h，获得相应的芳香醇或光学活性芳香醇，反应转化率为89-98%，立体选择性为83-i00%，选用的助溶剂为DMSO，甲醇，乙醇.；乙腈'DMF，SDS，TritonX-100或Tween-20。应用链霉菌还原取代芴酮生成相应的芳香醇或光学活性芳香醇的反应通式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本发明的有益效果是本发明提供的链霉菌易于培养，能够高效还原芳香酮，尤其是大环刚性芳香酮如取代芴酮，产物为芳香醇及光学活性芳香醇，解决了化学合成和工业上合成芳香醇和光学活性芳香醇的难题，而且且反应条件温和，操作步骤简单，具有很高的立体选择性，无其它副产物产生，环境污染小，具有很好的工业应用开发前景。附图1为本发明所述的链霉菌的显微镜及电镜照片。具体实施例方式筛选、驯化链霉菌的步骤如下从上海郊区土壤中取样，作为菌源进行筛选、驯化培养。将少量土样，加入到液体大筛选培养基中进行摇床培养，温度28'C，转速170rpm;液体大筛选培养基配方是可溶性淀粉丄0g，葡萄糖20g，黄豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP(X0.05g，水1L，pH7.0-7.2。当培养基变得浑浊，进行转接分瓶稀释培养，在进行涂布固体筛选平板，将固体平板放入光照培养箱中培养，30'C、培养4-5天，挑单菌落。固体筛选平板配方为可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，琼脂15g，水1L，pH7.0-7.2。再将挑选的各个单菌体进行液体培养基扩大培养，离心(5000rpm，10min)收集菌体细胞，分别加入芳香酮一取代芴酮，筛选得到一株具有芳香酮还原活性的菌株，再将此菌株进行驯化，加入不同浓度的取代荷酮(0.05rao1，0.1mol，0.2mol,0.4mol，0.8mol)进行传代培养，是其能够耐受高浓度的取代芴酮底物，最后得到筛选驯化的菌株。并将该菌株于2008年5月23R保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏编号为2518。链霉菌菌株最适生长温度为20-37°C，最适生长pH为6-8。在大筛选固体培养基上菌落茧白或灰白，表面平坦，菌丝发达，多分枝，无隔，呈杆状。能在大多数培养基上生长良好，气生菌丝和基内菌丝均以白色或白灰为主。实施例1实施例2链霉菌的16SrDNA的扩增通过扩增该菌株的16SrDNA，得到了长度为1424bp的16SrDNA序列。PCR引物采用16SrDNA扩增通用引物，27f(5，-GAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3，)和1492r(5，-TACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3，)。用PCR仪进行扩增反应。反应体系为TaKaRaPCR10XBuffer,5ul;MgCl2(25mM),4u1;dNTPMixture(各2.5mM)，4ul;引物8f(20um)，0.25ul;引物1492r(20nm)，0.25ul;模板DNA，lul;TaKaRaTaq(5U/u1)，0.25u1;超纯水，Upto50wl。PCR反应条件为94°C5分钟，之后30个循环包括94"C1分钟，55-Cl分钟，72。C2分钟，最后在72r下延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过NCBI中Blast程序进行序列比对，表明该菌株与Str印tomycesrecifensis同源性达到99%。链霉菌的培养与收集步骤如下固体培养基配方为可溶性淀粉5g，葡萄糖5g，蛋白胨lg，酵母粉lg，牛肉膏lg，琼脂15g，水1L，pH7.0-7.2。液体培养基配方为可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黄豆粉25g，酵母粉4g，牛肉膏lg，NaCl2g，K2HP040.05g，水1L，pH7.0-7.2。基于液体培养基的体积，挑取固体培养基中菌落接种于液体培养基中，接种量为2%，培养温度为3(TC，摇床转速为200rpm，培养时间为4天。离心(5000rpm，10min)收集菌体，-2(TC保存，备用。链霉菌的生理生化特性见表1。链霉菌的培养特性见表2。表1链霉菌Str印tomycessp.DUT003的生理生化特性明胶液化+葡萄糖+牛奶凝固与胨化+乳糖+淀粉水解+蔗糖+纤维素水解鼠李糖+硫化氢产生—麦芽糖+酪氨酸水解+甘露糖+表2链霉菌Str印tomycessp.DUT003的培养特性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>蔗糖蔡氏琼脂——————实施例3链霉菌在生物催化还原芳香酮中的应用歩骤如下(1)将链霉菌置于pH为7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中，使其细胞浓度为50g(湿重)/L，加入芳香酮2-取代(氟、氯、溴、碘、甲基)芴酮，浓度为0.5mmo1/1，置于转速为200rpm、温度为3(TC的摇床中反应12h;U.(2)用HPLC监测反应的进程；(3)待反应完成后，加入等体积的乙酸乙酯萃取出有机化合物，过无水硫酸镁柱除去水份及部分杂质，4(TC减压浓縮，分离得到固体有机化合物一芳香醇取代芴醇。(4)硅胶柱层析分离得到纯的芳香醇化合物一取代芴醇，进行核磁和质谱鉴定，并测定旋光值和对应体过量值。实施例4链霉菌还原不同的芳香酮化合物-取代莉酮，步骤如下(1)将链霉菌置于pH为7.0-8.0的Tris-HC1缓冲液中，使其细胞浓度为50g(湿重)/L，加入芳香酮2-取代(氟、氯、溴、碘、甲基)芴酮，浓度为0.5mmo1/1，加入助溶剂〈5%(v/v)(有机溶剂DMSO或甲醇或乙醇或乙腈或DMF;表面活性剂SDS或TritonX-100或Tween-20)，置于转速为200卬ra、温度为30。C的摇床中反应，反应时间为12h。(2)用HPLC监测反应的进程色谱仪Agilent1100，色谱柱CromasilC18(250咖X4.6隱，5ym);流动相70。/。甲醇50min;流速0.8ml/min;检测波长254咖；柱温室温；进样体积10^1。(3)待反应完成后，加入等体积的乙酸乙酯萃取出有机化合物，过无水硫酸镁柱除去水份及部分杂质，4(TC减压浓縮，分离得到固体有机化合物一芳香醇取代芴醇。(数据见附表3)(4)硅胶柱层析分离得到纯的芳香醇化合物--取代芴醇，进行核磁和质谱鉴定，并测定旋光值和对应体过量值，数据见表3。'表3链霉菌Str印tomycessp.DUT003还原不同取代芴酮情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种链霉菌，该链霉菌于2008年5月23日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC2518，分类命名为Streptomycessp.DUT003。2、根据权利要求1所述的一种链霉菌，其特征在于，该链霉菌在放线菌大筛选培养基上28X:下，培养4-5天，菌落茧白或灰白，表面平坦，菌丝发达，多分枝，无隔，呈杆状，气生菌丝和基内菌丝以白色或白灰为主。3、应用一种链霉菌还原芳香酮的方法，其特征在于，将湿重为10-100g/L的链霉菌悬浮在pH7.0-8.0的缓冲液中，加入浓度为0.1-lmmol/L的芳香酮化合物一取代芴酮，然后置于30°C、转速170rpm的摇床中，反应2-12h。4、根据权利要求3所述的应用一种链霉菌还原芳香酮的方法，其特征在于，将湿重为10-100g/L的链霉菌悬浮在pH7.0-8.0、含体积比5%助溶剂的的缓冲液中，加入浓度为0.1-10mmol/L的芳香酮化合物一取代莉酮，然后置于30°C、转速170rpm的摇床中，反应2-12h。。5、根据权利要求3所述的应用一种链霉菌还原芳香酮的方法，其特征在于，所述的缓冲液为20mMTris-HCl或20mMHEPES。6、根据权利要求3所述的应用一种链霉菌还原芳香酮的方法，其特征在于，所述的芳香酮为氟芴酮、氯芴酮、溴芴酮、碘芴酮或甲基芴酮。7、根据扭利要求4所述的应用一种链霉菌还原芳香酮的方法，其特征在于，所述的助溶剂为DMSO，甲醇，乙醇，乙腈，DMF，SDS，TritonX-100或Tween-20。全文摘要本发明涉及生物催化领域，特别是涉及一种链霉菌(Streptomycessp.DUT003，保藏号为CGMCC2518)及其在还原大环刚性芳香酮，如取代芴酮中的应用。应用本发明的链霉菌能够高效还原芳香酮，尤其是大环刚性芳香酮如取代芴酮，产物为芳香醇及光学活性芳香醇，解决了化学合成和工业上合成芳香醇和光学活性芳香醇的难题，转化率可达89-98％，且产物具有高的立体选择性，ee值为83-100％。该链霉菌易于培养，还原反应条件温和，操作步骤简单，环境污染小，具有很好的工业应用开发前景。文档编号C12P7/02GK101418269SQ20081001351公开日2009年4月29日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者君杨,青杨,波谢,钱旭红,陶黎明申请人:大连理工大学