专利名称：一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法；更具体地说，涉及一种由猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因和泛嗜性逆转录病毒载体构成的重组病毒的制备方法。
背景技术：
在生命科学和生物技术领域中，对细胞系存在着广泛的需求。动 物细胞的短期培养比较容易，但要建立永生细胞系则有相当的难度。 将永生化基因导入体外培养的细胞中表达而诱导其获得无限增殖的能 力，是当前普遍采用的一种建系手段。在此过程中，携带并表达永生 化基因的载体称为细胞永生化载体。猿猴病毒40大T抗原(SV40T) 基因能诱导众多类型细胞发生转化，是目前最为常用和有效的永生化 基因之一，已广泛用于人类(杨梅英、叶常青、刘雷华，SV40T介导 的人胎儿永生化气管成纤维细胞系的建立，癌变*畸变*突变，1999， 11: 22-24)、哺乳动物(高峰、田玉科、杨辉等，猿肾病毒40大T抗 原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建，中华麻醉学杂志，2005， 25: 597-600)、昆虫(Tian Jian-xiao， Li Chang-you， Zheng Gui-ling， W a/. A new cell clone derived from 7Wc/zo/^/a m. Tn5Bl画4 cells. Entomologia Sinica, 2004， 11: 165-171)和甲壳动物(Tapay, L M, Lu, Y, Brock, J A， " a/. Transformation of primary cultures of shrimp (户ewaews外///*0 5/"\5) lymphoid (oak) organ with Simian virus-40 (T) antigen. Proc Exp Biol Med， 1995， 209: 73-78)等细胞的永生化研究中。 SV40大T抗原的持续表达对成功诱导靶细胞的永生化表型至关重要。迄今所使用的永生化载体有两种类型I类是非整合型载体，II 类是逆转录病毒载体；前者通过脂质体转染可进入任何类型的动物细 胞，但是所携带的永生化基因只能核外暂时表达而导致永生化效率低 下；后者则通过转导作用进入靶细胞，并与细胞基因组整合，从而保 证了永生化基因在靶细胞内稳定表达，所以具有较高的永生化效率。然而，病毒侵入靶细胞需由特定的细胞表面受体介导，因此导致II类 永生化载体对靶细胞具有选择性，从而限制了它的应用范围。泛嗜性逆转录病毒载体(Pantropic retroviral vectors)是一类病毒夕卜 壳由粘性肺炎病毒外壳糖蛋白(VSV-G)组成的逆转录病毒载体。 VSV-G通过与耙细胞的膜脂偶联以及膜融合介导病毒的侵入而无需 通过细胞表面的特异蛋白受体介导。因此，泛嗜性逆转录病毒具有极 其广泛的寄主范围(Burns, J C, Friedmann, T， Driever, W, " a/. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA， 1993, 90:8033-8037)，已成为基因转移系统的上佳选择。然而，迄今泛嗜性 逆转录病毒载体尚未在细胞转基因永生化研究中得到应用。 发明内容本发明的目的是提供一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方 法，以克服现有永生化载体的上述缺陷，能较好地解决I类永生化载 体的永生化效率低下和II类永生化载体的寄主范围狭窄的问题。一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其步骤包括(1) 以猿猴病毒40基因组或携带有SV40大T抗原基因的质粒为模板，PCR 扩增SV40T基因，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.l或SEQ ID N0.2所示；(2)通过DNA重组技术将SV40T基因定向插入逆转录病 毒载体的多克隆位点，构建携带SV40T基因的重组逆转录病毒载体； (3)将步骤(2)得到的重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞 进行重组泛嗜性逆转录病毒包装，培养48-72小时后收获含有重组病 毒颗粒的细胞上清液。本发明制备的永生化载体的优点是(1)寄主范围广泛，可进入 任何类型的动物细胞；(2)永生化基因可整合到靶细胞基因组中，得 到可遗传的、稳定的表达，从而保证了靶细胞的高效永生化转化；(3) 具有广谱转化效应，适用于众多类型细胞的永生化研究。
图1为一种通用的整合型细胞永生化载体的制备流程。图2为重组逆转录病毒载体(pLXRN-SV40T)的酶切鉴定图谱。 1、分子量标记；2双酶切后产生的载体片段(pLXRN， 6.4kb)和SV40T 基因片段(2.5kb) ; 3、重组逆转录病毒载体(pLXRN-SV40T)。图3为重组泛嗜性逆转录病毒的透射电镜照片。X20 000具体实施方式
本发明所用的材料含有SV40T基因(参见Genbank accession no: AF316139，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0.2所示，大小2,5kb) 的质粒pUCSV40-2895-l购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该 SV40T基因内部包含小T抗原编码序列(其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO.3所示)；质粒pLXRN (6.4kb)、 pVSV-G及GP-293细胞购 自美国Clontech公司；NIH3T3细胞由中国海洋大学海洋药物研究所 李静老师惠赠；限制性内切酶Sam//1 、 Z/zo I及LATaqDNA聚合酶 购自大连宝生物公司，T4 DNA连接酶购自美国Promega公司；DNA 产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代公 司；去内毒素质粒提取缓冲液购自北京博大泰克公司；DMEM培养基 购自美国GibcoBRL公司；引物由上海生工生物工程公司合成。通用的整合型细胞永生化载体的制备流程如图l所示。1、 PCR扩增SV40T基因以pUCSV40-2895-l质粒为模板，PCR扩增SV40T基因。上游引 物SP- 5'CGG04rCCACCATGGATAAAGTTTTAAAC3'含Baw^ I酶 切位点(以斜体表示)和起始密码子(以粗体表示)；下游引物 AP-5'CCGCrC04(7rTATGTTTCAGGTTCAGGG3'含JT/zo I酶切位点(以斜体表示)和终止密码子(以粗体表示)。扩增反应体系为50[Xl反应体系中含lxGC Buffer I ， 2.5mM Mg2+, 400pM dNTP， 0.5pM上 /下游引物，O.lpg质粒模板，2.5ULATaq酶；反应条件为94。C预变 性5min，然后94°C lmin， 58°C lmin， 72°C 3min共35个循环，最 后72'C延伸lOmin。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、DNA产物纯化试剂盒纯化后，-2(TC保存。PCR产物纯化操作按照DNA产物纯 化试剂盒使用说明进行，具体步骤如下1) 向PCR产物中加入500^1结合液，充分混匀。2) 混合液加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心l分 钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。3) 向吸附柱中加入700^1漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。4) 向吸附柱中加入500pl漂洗液，12000rpm离心l分钟，倒掉废液。5) 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗 液，并将吸附柱于室温彻底晾干。6) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置 悬空滴加30pl洗脱缓冲液，室温放置2分钟；12000rpm离心 1分钟收集DNA溶液。2、重组表达载体的构建用限制性内切酶Bam// I和Z/zo I分别对载体pLXRN和纯化的 SV40T基因进行双酶切反应。20ul酶切反应体系含lxK Buffer, 5am/fl 12U， X/ o I IOU，耙DNA分子lpg; 37。C水浴3小时。酶切产 物以1%琼脂糖凝胶电泳分离，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说 明回收SV40T片段和线性载体pLXRN，操作步骤如下1) 在紫外灯下，用刀片从琼脂糖凝胶中切下目的条带，放入干 净的离心管中，称取重量。2) 向胶块中加入3倍体积的溶胶液，5(TC水浴10分钟，其间不断 温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。3) 将上一步所得溶液加入吸附柱中，13000rpm离心30秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。4) 向吸附柱中加入700pl漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉废液， 将吸附柱重新放入收集管中。5) 向吸附柱中加入500nl漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉废液。 将吸附柱放回收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，并将吸附柱置于室温彻底晾干。 6)将吸附柱放到一个千净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30pl洗脱缓冲液，室温放置2分钟；13000rpm离心l分钟收 集DNA溶液。回收目的片段后，用T4 DNA连接酶将插入片段和线性载体(摩尔 比为3:1，共约120 ng)于16。C下连接过夜。10^il连接反应体系含SV40T 2jxl (约17ng)， pLXRN5|il (约100ng)， Ligase Buffer 1 pl， T4连接酶 0.33pl(lU)，双蒸水1.67pl。次日取5^il连接产物转化感受态细胞五.co// DH5a，涂布LB-Amp平板；37。C倒置培养15-18小时后，挑取Amp抗性 单菌落于5ml LB液体培养基中，37°C、 170rpm振荡培养过夜；TENS 法抽提质粒，操作步骤如下1) TENS的酉己制于100mlTE (pH7.6)中加入0.4g NaOH和0.5g SDS，充分溶解。2) 取1.5ml培养物于1.5ml EP管中，10000r/min离心IO秒钟，弃上 清。3) 漩涡震荡IO秒钟，使菌体重悬，加入300^1 TENS溶液，温 和振荡5-10秒，静置至微粘稠。4) 力Q入150nl 3M NaAc(pH5.2)混匀，4。C下12000r/min离心10mln。5) 取上清(约400pl)至另一EP管中，加入2倍体积预冷的无水 乙醇，混匀后-20。C下静置l Omin ， 4 。C下12000r/min离心1 Omin 。6) 弃上清，70%乙醇清洗两遍，自然干燥。7) 重悬沉淀于30^ilTE中，加入1.5pl RNaseA (10mg/ml)混匀， -201:保存。对所制备的质粒进行^"m//1I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳 分析(图2)，并对阳性重组子进行测序验证，测序工作委托英骏生物技 术有限公司进行。这样构建的重组载体命名为pLXRN-SV40T。 3、泛嗜性逆转录病毒的包装与滴度测定 振荡培养阳性重组子后，以下述方法抽提重组质粒 pLXRN-SV40T。1) 溶液的配制。溶液I :葡萄糖1.982g， lMTris-HCl (pH8.0) 5ml， 0.5MEDTA4ml，双蒸水定容至200ml，高压灭菌15min， 4。C保存；溶液II: 1MNaOH20ml， 10% SDS 10ml,双蒸水 定容至100ml，室温保存，现配现用；溶液III: 5M乙酸钟60ml， 冰乙酸11.5ml，双蒸水定容至100ml，室温保存。2) 收集3ml菌液的沉淀于1.5ml Eppendorf离心管中，加入100pl 溶液I ，震荡至彻底悬浮。3) 加入200pl溶液n ，立即温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂 解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上l-2分 钟。4) 加入150pl溶液in，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心10分钟。5) 转移上清至另一EP管中，加入等体积的饱和酚混匀，室温下 12000rpm离心5分钟。6) 小心吸取上清，转移至另一EP管中，勿将蛋白吸出。加入300pl 去内毒素缓冲液抽提两次，12000rpm离心5分钟。7) 加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，12000rpm离心 5分钟。8) 转移上清至另一EP管中，加入l/10体积的3MNaAc (pH5.2)和 2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20<€静置301^11。9) 12000rpm离心15分钟，弃上清，70%乙醇清洗一次，自然干燥。10) 加TE(pH8.0) 30^1，溶解沉淀；加RNaseA(10mg/ml) 3.5pl，混匀。11) 紫外分光光度计检测质粒浓度约为40pg/ml， -20^保存。 采用磷酸钙沉淀法将重组载体pLXRN-SV40T和包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞，包装重组泛嗜性逆转录病毒，操作步骤如下1)缓冲液的配制。2xHEPES缓冲盐溶液(HBS): NaC1 1.600g， KC1 0.074g， Na2HP04.2H2O 0.027g， Glucose 0.200g， HEPES l.OOOg，加双蒸水至100ml，用0.5mol/L NaOH调pH值至7.05，0.22nm过滤除菌，-2(TC保存；PBS缓冲液KC1 0.42g, KH2P04 0.20g， NaCl 8.00g， Na2HP04. 7H20 2.16g，加三蒸水至1000ml， 调pH值至7.2，高压灭菌，室温贮存。2) 转染前24小时，将GP-293以l-2xl()Scell/cn^的密度接种于培养 瓶中，置于C02培养箱中37"C培养。3) 每转染一瓶单层细胞，需制备如下磷酸钙-DNA共沉淀物将 220^1 DNA (110^1 pLXRN-SV40T禾口 110^1 pVSV-G)与250pl 2xHEPES缓冲盐溶液混于灭菌1.5mlEP管中，缓慢加入31^1 2mol/LCaCl2，温和混合30秒左右。于室温温育30min，其间 将形成细小沉淀。温育结束时，用吸液管将混合液吹打一次， 使沉淀物复悬。4) 吸出培养GP-293细胞的DMEM培养液，将磷酸钙-DNA悬液 加至细胞单层上，于室温下温育15min;然后再将原DMEM 培养液加回到培养瓶中，37°C、 C02培养箱中继续培养24小 时。5) 弃掉培养液，PBS清洗细胞单层一次，加入5ml预加温的新 鲜培养液，放入培养箱中继续培养24小时。6) 收集培养液上清，0.45pm醋酸纤维膜过滤，分装后-8(TC保存。 另取lml病毒液测定病毒滴度，测定方法如下1) 在实验的前一天将NIH3T3接种于6孔板中，每孔细胞密度为 0.5-lxl05 cell/cm2，置于(302培养箱中37°C培养。2) 感染前，将病毒液作10"， 10_2， l(T3， 10"， l(T5， 10'6倍稀释。 除去NIH3T3的培养液，分别吸取lml病毒稀释液，感染NIH3T3 细胞，同时加入凝聚胺(polybrene)，使其终浓度为8pg/ml。3) 感染48小时后进行G418 (400^g/ml)抗性筛选，筛选时间为l 周。4) 按如下公式计算病毒滴度病毒滴度(cfu/ml)=最大稀释倍 数的培养基中出现的克隆数目x稀释倍数这样制备的泛嗜性逆转录病毒(图3)即为通用的整合型细胞永生化载体，它的滴度为4-10xl(^cfu/ml，适合于后续的细胞转基因永生 化研究使用。4、泛嗜性逆转录病毒的浓縮如要制备更高滴度的病毒液，可将收获的病毒上清液于4。C下 20，000rpm离心1.5小时，将所得沉淀溶于1/100至1/200倍原上清液 体积的无血清DMEM培养基中，4。C静置3小时，重悬后分装，-80°C 保存。这样制备的泛嗜性逆转录病毒的滴度可高达0.4-2xl09 cfu/ml。SEQUENCE LISTING<110> 中国海洋大学<120> —种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法<130> 000<160> 3<170> Patentln version 3.5<210> 1<211> 2127<212> DNA<213> 猿猴病毒40 (SV40) <220><221> CDS<222> (1)..(2127)<223> SV40大T抗原基因CDS<400〉 1ttttaa3C3g3g3gg33tCtttgc3gctastggaccttct8ggtCttg￡L3603gg3gtgCCtgggggaatattcctctgatgatgcaaggag120tttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaatgaatactCtgt3C33g180aaaatggaag3tggagtaaa3tatgctC3tcaacctgactttggaggcttctgggatgca240sctgagattccascctatggtggg3gC3gtggtggaatgcctttaatgag300gaaaacctgttttgCtC3g3tctagtgatgatgaggctactgctgactct360caacattctactcctccaaaaaagaagagaaccccaaggactttccttca420gseit tgc 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1、一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其步骤包括(1)以猿猴病毒40基因组或携带有SV40大T抗原基因的质粒为模板，PCR扩增SV40T基因，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；(2)通过DNA重组技术将SV40T基因定向插入逆转录病毒载体的多克隆位点，构建携带SV40T基因的重组逆转录病毒载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞，培养48-72小时后收获含有重组病毒颗粒的细胞上清液。
2、按权利要求1所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其特 征在于所述歩骤(l)、 (2)中的SV40T基因序列的内部还可以包含如序列表 中SEQ IDNO. 3所示的SV40小T抗原基因序列；在此种情况下，SV40T基 因序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
3、 按权利要求l所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其 特征在于所述步骤(2)中的逆转录病毒载体为pLXRN、 pLNHX、 pLXSN、 pLNCX、 pLPCX、 pLHCX、 Retro-XTM Q Vector系列禾口 MSCV Retroviral Vector 系列中的任一逆转录病毒载体。
4、 按权利要求l所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其 特征在于步骤(3)之后，还包括对所收获的含有重组病毒颗粒的细胞上清液 进行超速离心而制备高滴度的病毒液。
全文摘要
本发明公开了一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法。首先，通过DNA重组技术将具有广谱转化效应的细胞永生化基因——猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因定向插入逆转录病毒载体中，构建重组表达载体；然后，将重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞，制备携带SV40T基因的重组泛嗜性逆转录病毒颗粒；所获得的重组泛嗜性逆转录病毒即为通用的整合型细胞永生化载体。该永生化载体能进入所有类型的动物细胞，并将所携带的SV40T基因整合到处于分裂期的靶细胞的基因组中，使其得到可遗传的、稳定的表达，从而保证了靶细胞的高效永生化转化。本发明为各种动物细胞的转基因永生化建系研究提供了一种有效的手段。
文档编号C12N15/867GK101215577SQ20081001364
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者宋珊珊, 丹 王, 王锡亮, 胡国斌 申请人:中国海洋大学