专利名称：阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法， 具体是一种阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazaii)是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏 阴性无芽孢杆菌，作为肠杆菌科的一种， 一直被称为黄色阴沟肠杆菌，直到1980 年才更名为阪崎肠杆菌。该菌是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人 和动物致病，所以称为"条件致病菌"。阪崎肠杆菌自然来源非常广泛，在水、土壤、 植物根茎、动物肠道甚至加工食品都可存在，其中婴儿配方奶粉是婴儿感染阪崎 肠杆菌的主要渠道。这种细菌对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫缺陷婴儿的危 害最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，可造成严重的神经 系统后遗症和死亡，感染死亡率高达20% 50% 。 1961年，英国首次报道2例由阪 崎肠杆菌引起的脑膜炎病例，以后相继在美国、希腊、荷兰、冰岛、加拿大、比 利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。2004年4月，我国安徽省阜阳地区 连续发生了与"劣质奶粉"有关的婴儿营养状况不良甚至导致死亡事件的报道，中国 疾病预防控制中心营养与食品安全所，特别关注了婴儿配方奶粉中的微生物安全 性问题，对从阜阳市场采集的87份婴儿配方奶粉进行了阪崎肠杆菌的分离鉴定， 从ll份样品中分离出ll株阪崎肠杆菌。婴儿配方奶粉样品中阪崎肠杆菌的污染阳 性率为12.6%。 2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估，将阪崎肠杆 菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方奶粉A类致病菌。
现有阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统生化鉴定、普通PCR、荧光定量PCR。目 前尚未见用环介导等温扩增方法检测阪崎肠杆菌的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法，以克服 现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)， 内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使耙DNA累积到10，考贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的阪崎肠杆菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1) - (4):
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 —1.0iJmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 —1. 0iJmol/L下游内引物 (BIP)、 0. 2—0. 3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2 — 0. 3Mmol/L下游外引物(B3)和 l一1.5mol/L甜菜碱； 上游内引物
5- tatgcgggatcgaaccgcaga-ggctatagctcagctggga -3 、
下游内引物
5- gctccaccatcacttcggagtg-ttcagcttgttccggattgt -3、 上游外引物5-tccgcaggagttgaagagg-3 、 下游外引物5-cagcagcgtgtctgtttca-3 、
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP =2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200腿ol/L pH8. 8的三羟基甲基 氨基甲垸一盐酸(Tris—HCl)、 100mm。l/L氯化钾(KCl)、 100醒ol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 20腿ol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /|jL;
(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有23iJL，其最佳组成为2. 5|jL
10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、 2萃10iJmol/L上游内引物(FIP)、 2.0|jL 10Mmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5|jL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5iJL10iJmol/L下游外引物(B3)、 1. 5|jL 100 mmol/L MgS04、 5yL 5M甜菜碱和7. 6|jL ddH20 (灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒检测阪崎肠杆菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(1)待检样品或细菌DNA的提取
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD柳/OD測在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/ijL范围内。
(2) 进行阪崎肠杆菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23ijL LAMP反应液的反应管中加入lijL待检模板DNA，和O. 5ijL的UNG
酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在上述反应管中加入llJL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60 — 65。C扩增反应45 — 90 min;
C. 将水浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5min后取出待检；
(3) 显色检测
在上述待检的每个反应管中加入1IJL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应
液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为阪崎肠杆菌。
本发明的试剂盒根据阪崎肠杆菌的18SrDNA基因的基本保守区的六个序列设计
了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为阪崎肠杆菌各不同 血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的阪崎肠杆菌的可靠 性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法 有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必 用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基 层医疗机构。
具体实施例方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例l
按下列配方制作阪崎肠杆菌的环介导等温扩增试剂盒 (1) LAMP反应液
含有2. 5|JL lOXThermopol反应缓冲液、1. 4jjL 25腿ol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、2.0|jL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 2. 0|jL 10iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.5|JL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5pL 10)Jmol/L下游外引物(B3)、 1. 5|JL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜碱和7. 6|jL ddH20。
其中所述的上游内引物
5- TATGCGGGATCGAACCGCAGA-GGCTATAGCTCAGCTGGGA -3 、
下游内引物
5- GCTCCACCATCACTTCGGAGTG-TTCAGCTTGTTCCGGATTGT -3、 上游外引物5- TCCGCAGGAGTTGAAGAGG -3 、 下游外引物5- CAGCAGCGTGTCTGTTTCA -3其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;
(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下(1) - (3)程序进行检测'
(1) 样品DNA的提取
检测菌种阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazaii)，菌种来源美国典型培养物保 藏中心，编号ATCC51329。
使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D26。/ 0D訓能够达到1.8，浓度达到20 ng/|jL0
(2) 进行菌样的环介导等温扩增反应
A. 在装有23nL LAMP反应液的反应管中加入lpL待检模板DNA，禾叩.5jjL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;
B. 在上述反应管中加入l |JL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65 。C扩增反 应l小时；
C. 将水浴调到80匸中止反应，3 min后取出待检；
(3) 显色检测
在上述待检的每个反应管中加入l IJL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应 液颜色变为绿色，说明待检样品为阪崎肠杆菌。 实施例2
按下列配方制作阪崎肠杆菌的环介导等温扩增试剂盒 (1) LAMP反应液
含有2.5|JL lOXThermopol反应缓冲液、1. OpL 10誦ol/L dNTP、 1.0 |jL 201Jmol/L上游内引物(FIP)、1.0iJL20 iJmol/L下游内引物(BIP)、0. 25 jjL 20|Jmol/L 上游外引物(F3)、 0. 25iJL20jjmol/L下游外引物(B3)、 0. 5 |JL 100腿ol/L MgS04、 12.5 |JL 2 mol/L甜菜碱和4)jL ddH20 (灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比同上。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料DNAGreen。按照以下(1) - (3)程序进行检测
(1) 样品DNA的提取
检测菌种阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazaii)，菌种来源美国典型培养物保 藏中心，编号ATCC29544。
使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D26。/ 0D28。 能够达到1.8，浓度达到20 ng/|jL。
(2) 进行菌样的环介导等温扩增反应
A. 在装有23ijL LAMP反应液的反应管中加入lpL待检模板DNA，禾口O. 5fjL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在上述反应管中加入llJL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65。C扩增反应1
h;
C. 将水浴调到8(TC中止反应，3 min后取出待检；
(3) 显色检测
在上述待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应 液颜色变为绿色，说明待检样品为阪崎肠杆菌。核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 <120〉阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法
<160〉 4 〈210〉 1 <211> 40 <212> DNA
〈213〉人工序列 〈221〉 prim一bind 〈222〉 (1)…(40) 〈400〉 1
TATGCGGGATCGAACCGCAGA-GGCTATAGCTCAGCTGGGA 40
<210> 2 〈211〉 42 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈221〉 prim一bind <222> (1)…(42) 〈400〉 2
GCTCCACCATCACTTCGGAGTG-TTCAGCTTGTTCCGGATTGT 42
〈210〉 3 〈211〉 19 〈212〉腿 <213〉人工序列 〈221〉 prim—bind <222〉 (l)... (19) 〈400> 3
TCCGCAGGAGTTGAAGAGG 19
〈210〉 4 〈211〉 19 〈212〉 DNA <213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (19) 〈■〉 4
CAGCAGCGTGTCTGTTTCA 19
权利要求
1.一种阪崎肠杆菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括下列(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L dNTP、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.0μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.0μmol/L下游内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游外引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；其中上游内引物5-TATGCGGGATCGAACCGCAGA-GGCTATAGCTCAGCTGGGA-3、下游内引物5-GCTCCACCATCACTTCGGAGTG-TTCAGCTTGTTCCGGATTGT-3、上游外引物5-TCCGCAGGAGTTGAAGAGG-3、下游外引物5-CAGCAGCGTGTCTGTTTCA-3、(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREENI或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的阪崎肠杆菌快速检测试剂盒，其特征是上述的 dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP =2:1:1:1。
3. 使用上述试剂盒检测阪崎肠杆菌的方法，其特征是依次包括下列步骤 (1) - (3):(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/ 0028。在1. 6-2. 0范围 内，浓度在10-100 ng/u L范围内；(2) 进行阪崎肠杆菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23uL LAMP反应液的反应管中加入luL待检样品模板DNA，和 0. 5uL的UNG酶，于恒温95 。C放置3 — 5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 然后在反应管中加入1PL Bst DNA聚合酶，并于恒温65 。C扩增反应 45 — 90 min;C. 将温度调到80 。C中止反应，3 — 5 min后取出待检；(3) 显色检测在待检的上述每个反应管中加入lwL显色剂，直接用肉眼观察颜色变 化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为阪崎肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增技术的阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒内有环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-TATGCGGGATCGAACCGCAGA-GGCTATAGCTCAGCTGGGA-3、下游内引物5-GCTCCACCATCACTTCGGAGTG-TTCAGCTTGTTCCGGATTGT-3、上游外引物5-TCCGCAGGAGTTGAAGAGG-3、下游外引物5-CAGCAGCGTGTCTGTTTCA-3和甜菜碱；检测阪崎肠杆菌的方法包括细菌DNA的提取、阪崎肠杆菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101319249SQ20081001675
公开日2008年12月10日 申请日期2008年6月10日 优先权日2008年6月10日
发明者刘云国, 姜英辉, 房保海, 楠 贺, 贾俊涛, 赵丽青, 颖 陈, 雷质文, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心