专利名称：一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域具体涉及一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法。
背景技术：
目前，农药残留已成为威胁食品安全的重大问题。加大农药残留检测力度，加强市场上 蔬菜水果等食品农药残留的监控显得非常迫切。农药残留分析传统上主要采用气相色谱、气 相色谱-质谱联用和高效液相色谱等技术，能较准确测出残留量，但需要大型仪器，前处理 操作繁琐，需受过专门训练的人员才可掌握，而且仪器不方便携带移动，很难适应现场简单 快速和大数量样品残留分析的要求。所以快速简便，成本低廉的速测技术检测蔬菜水果中农 药残留势在必行。近年来，国内这方面申请的专利很多，有利用抗原抗体的方法，如"用于
检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用"(200410041895. X)、有通过氧化发光和测定光谱 进行比色的方法，如"化学发光有机磷农药残留分析仪及其检测方法"(200510041791.3)、
"一种蔬菜有机磷农药残留的分析方法"(200410026892.9)、"蔬菜和水果中有机磷农药 残留量的快速测定方法"(200310119273. X)。也有与本项目相似利用酶抑制的方法，如"快 速检测有机磷农药残留的鱼酯酶试剂"(02115152. 0)、"一种定性检验有机磷的试剂的制 备及含量测定方法"(99109293.7)、"快速测定有机磷农药的植物酯酶片"(99114268.3)、
"残留有机磷农药快速测试盒及制造方法"(00135716. 6)、"快速检测痕量有机磷和氨基 甲酸酯农药的方法"(01144343. X)。但这些专利方法所用的植物酯酶或苯基一 (偶氮一 1 )
2 —醋酸萘酯与本项目所用的酶源或底物不同。
发明内容
本发明以新鲜母鸡或母鸭血中的乙酰胆碱酯酶为原料，通过有机磷农药对乙酰胆碱酯酶 的抑制作用，使酶的底物乙酸萘酯不能分解，从而加入固蓝B后的颜色变浅。最后通过颜色 的深浅达到判断样品中是否含有有机磷农药残留的目的。 本发明是如下实现的本发明提供一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法。 本发明所述的检测有机磷农药残留试纸的制备方法包括如下步骤(1)以新鲜母鸡或母 鸭血为原料制备乙酰胆碱酯酶；(2)乙酰胆碱酯酶固定于滤纸上；(3)将滤纸冷冻干燥后切 片。
上述步骤(1)中制备乙酰胆碱酯酶的方法是母鸡或母鸭的新鲜血液室温下凝固后，于
0 4。C冰箱放置过夜使血清析出，取其血清上清液，所得血清上清液再在16000r.p.m转速， 0 4'C下离心5rain，其上清液即为乙酰胆碱酯酶粗酶；然后将装有乙酰胆碱酯酶粗酶的三角 瓶放入冰水中，往粗酶液中缓慢搅拌加入饱和硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在55% 60 %的范围内；所得溶液于15000r.p.m， 0 4'C下离心8 min，弃去上清；沉淀再用蒸馏水溶 解，并装入分子量1万的透析袋，于4'C冰箱透析40小时，其间换液8次，然后将透析后 所得的酶液冷冻干燥，即为纯化的乙酰胆碱酯酶。
上述步骤(2)中将冻干的乙酰胆碱酯酶用蒸馏水配成浓度为0. 10 0. 40mg/mL，将滤纸 浸入酶液中，3分种后取出，置于冷冻真空干燥箱中进行冻干。
上述步骤(3)中用特定的打孔机将冻干的滤纸酶片打成直径5cm大小的园形小片，置于 带瓶塞的瓶中密封保存。
本发明所述的检测有机磷农药残留试纸使用方法有如下步骤(1)以50%甲醇配置氯化乙 酰胆碱底物液，浓度为2.0 mg/mL，以蒸馏水配置固蓝B显色液，浓度为1.0 mg/mL，用蒸 馏水将3%的溴水稀释为0.5 1.0%的浓度，用于增敏液；(2)检测时，先取定量蔬菜或水果 的提取液500u L加入倍比的0. 5 1. 0%的溴水静置10 15min，对照用蒸馏水500n L加入 倍比的0.5 1.0%的溴水静置10 15min;取2片上述已固定乙酰胆碱酯酶的酶片，分别加 入上述溴水处理过的样品提取液和对照各40 60wL，静置10min;再加入50 80uL氯化 乙酰胆碱底物液，静置10min; (3)加入30 50iiL固蓝B显色液，观察样品酶片与对照酶 片颜色深浅，如果颜色一致，表明没有农药残留，如果样品酶片比对照酶片颜色浅，表明有 农药残留。
本专利方法与现有专利和产品相比，试纸的制备方法简单，所用酶源丰富，成本低，使用更方便，是一种简单快速实用的有机磷农药残留测定产品。能适于现场对有机磷农药残留
快速测定。
具体实施例方式
实施列1:
用蒸馏水配置2. 0u g/mL的敌敌畏，取2支1. 5mL的印pdof离心管， 一支管中加入500 u L 2. 0u g/mL的敌敌畏和500 w L 0. 5%的溴水静置15min，另一支管中加入500u L蒸馏水 和500u L 0. 5%的溴水静置15min，取2片乙酰胆碱酯酶的酶片，分别加入上述溴水处理过 的敌敌畏农药液和对照各40u L，静置10min;再加入60y L氯化乙酰胆碱底物液，静置10min; 最后加入50yL固蓝B显色液，观察到加入敌敌畏的酶片近乎无色，而对照酶片显浅红色。 实施列2:
用蒸馏水配置1. 5u g/mL的甲胺磷，取2支1. 5mL的印pdof离心管， 一支管中加入500 uL 1.5y g/mL的甲胺磷和500uL 0.5%的溴水静置15min，另一支管中加入500y L蒸馏水 和500uL 0.5%的溴水静置15min，取2片乙酰胆碱酯酶的酶片，分别加入上述溴水处理过 的甲胺磷农药液和对照各60u L，静置10rain;再加入70p L氯化乙酰胆碱底物液，静置10min; 最后加入50nL固蓝B显色液，观察样品酶片与对照酶片颜色深浅，加入甲胺磷的酶片近乎 无色，而对照酶片显浅红色。 实施列3:
从蔬菜市场随机买回叶菜5份，取其中100g叶用蒸馏水100mL不断冲洗后，然后编号5 支1. 5mL印pdof离心管并各加入500" L不同叶菜冲洗液与500y L 0. 5%的溴水静置15min， 第6支管中加入500y L蒸馏水和500u L 0. 5%的溴水静置15min，取6片乙酰胆碱酯酶的 酶片，分别加入上述溴水处理过的叶菜样品冲洗液和对照各60y L，静置10min;再加入60 "L氯化乙酰胆碱底物液，静置10min;最后加入50uL固蓝B显色液，观察样品酶片与对 照酶片颜色深浅，4个样品的颜色与对照酶片一致近浅红色，其中一个样品的颜色比对照浅， 表明该样品含有农药残留，后又重复测试并用液相色谱确证该样品含有乙酰甲胺磷残留。
权利要求
1. 一种检测有机磷农药残留试纸的制备方法，其特征在于制备该试纸包括如下步骤(1)以新鲜母鸡或母鸭血为原料制备乙酰胆碱酯酶；(2)乙酰胆碱酯酶固定于滤纸上；(3)将滤纸冷冻干燥后切片。
2. 根据权利要求1所述试纸的制备方法，其特征在于上述步骤(1)中制备乙酰胆碱酯 酶的方法是母鸡或母鸭的新鲜血液室温下凝固后，于0 4。C冰箱放置过夜使血清析出，取其血清上清液，所得血清上清液再在16000r.p.m转速，0 4。C下离心5min，其上清液即为 乙酰胆碱酯酶粗酶；然后将装有乙酰胆碱酯酶粗酶的三角瓶放入冰水中，往粗酶液中缓慢搅 拌加入饱和硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在55% 60%的范围内；所得溶液于 15000r.p.m， 0 4。C下离心8 min，弃去上清；沉淀再用蒸馏水溶解，并装入分子量1万的 透析袋，于4'C冰箱透析40小时，其间换液8次，然后将透析后所得的酶液冷冻干燥，即 为纯化的乙酰胆碱酯酶。
3. 根据权利要求1所述试纸的制备方法，其特征在于上述步骤(2)中将冻干的乙酰胆 碱酯酶用蒸馏水配成浓度为0. 10 0.40mg/mL，将滤纸浸入酶液中，3分种后取出，置于冷 冻真空干燥箱中进行冻干。
4. 根据权利要求1所述试纸的制备方法，其特征在于上述步骤(3)中用特定的打孔机 将冻干的滤纸酶片打成直径5cm大小的园形小片，置于带瓶塞的瓶中密封保存。
5. —种如权利要求l所述的检测有机磷农药残留试纸的使用方法，其特征在于该使用方 法有如下步骤(1)以50%甲醇配置氯化乙酰胆碱底物液，浓度为2.0 mg/mL，以蒸馏水配 置固蓝B显色液，浓度为1. 0 mg/mL，用蒸馏水将3%的溴水稀释为0. 5 1. 0%的浓度，用于 增敏液；(2)检测时，先取定量蔬菜或水果的提取液500uL加入倍比的0.5 l.(m的溴水静 置10 15min，对照用蒸馏水500iiL加入倍比的0. 5 1.0%的溴水静置10 15min;取2片 上述已固定乙酰胆碱酯酶的酶片，分别加入上述溴水处理过的样品提取液和对照各40 60 PL，静置10min;再加入50 80uL氯化乙酰胆碱底物液，静置10min; (3)加入30 50 uL固蓝B显色液，观察样品酶片与对照酶片颜色深浅，如果颜色一致，表明没有农药残留， 如果样品酶片比对照酶片颜色浅，表明有农药残留。
全文摘要
本发明公开了一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法，制备方法包括如下步骤(1)以新鲜母鸡或母鸭血为原料制备乙酰胆碱酯酶；(2)乙酰胆碱酯酶固定于滤纸上；(3)将滤纸冷冻干燥后切片；使用时配置底物液、显色液和增敏液；其原理是利用增敏液处理后的有机磷农药对鸡或鸭血清中乙酰胆碱酯酶的抑制作用，使乙酰胆碱酯酶的底物乙酸萘酯不能分解，从而加入固蓝B后显示的颜色深浅不一致，达到判断样品是否含有有机磷农药残留的目的，本发明成本低，操作简便快速，能适于现场特异测定蔬菜、水果和食品中是否存在有机磷农药残留的方法。
文档编号C12Q1/46GK101299029SQ20081002843
公开日2008年11月5日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者元 彭, 赵肃清, 洪 黄 申请人:广西科学院