专利名称：黑曲霉发酵生产四草酸钾的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用黑曲霉发酵生产四草酸钾的方法，尤指 一种利用黑曲霉的分离纯化及黑曲霉液体发酵培养生产四草酸 钾的方法。
背景技术：
四草酸钾，化学名又称之为草酸三氢钾、乙二酸三氢钾、四
乙二酸钾；英文名为 potassium trihydrogen dioxalate dehydrate 或 potassium tetraoxalate ; 分子式为 KH3(C204)2'2H20 或 C4H3K08*2H20;分子量为254.19。纯品为无色晶体或白色粉末。 加热至IO(TC失水成无水物，更高温度时分解为碳酸钾和一氧化 碳等，能溶于水，微溶于醇。
国产分析纯的四草酸钾，目前的市场价位为120 150元 /Kg。进口优级纯的四草酸钾，市场价位为1568-1850元/Kg。
四草酸钾在工业上有广泛的用途，是制革、织物整理剂，媒 染剂，金属抛光、防锈处理剂，有机化工原料，催化剂，化学分 析的基准物和分析试剂，也用于感光材料的制备。目前四草酸钾 的制备，是由过量草酸与碳酸钾或氯化钾等钾盐进行化学反应制 得。化学反应生产四草酸钾，其副产物盐酸、草酸给环境带来污 染；过量的草酸增加了环境危害；使用碳酸钾、氯化钾作为反应 基质，在生产碳酸钾、氯化钾的同时给环境造成了二次污染，使 得四草酸钾的生产成本高。但利用微生物生产四草酸钾，还未见 报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中化学工 业合成四草酸钾的相对高成本、高环境污染的问题，提供一种黑 曲霉发酵生产四草酸钾的方法，使用马铃薯、蔗糖作为基本培养 基质，安全、无毒害，实现了四草酸钾的低成本、全能环保型生产。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是 一种 黑曲霉发酵生产四草酸钾的方法，该方法包括如下步骤
a、 黑曲霉的分离纯化选取皱边石杉植株的茎段，经流水
冲洗2-3小时—75%酒精消毒1-2 min — 0.01mol/L盐酸、 5%次氯酸钠、2.4 mmol/L柠檬酸依次冲洗一遍一5%次氯酸钠 消毒 10 12 min — 无菌水冲洗3-5次 一10%双氧水消毒 8-12 min —无菌水冲洗4~5次一无菌吸水纸上吸干表面水 —接种于PDA平板上一分离、纯化得到黑曲霉。
b、 黑曲霉的液体发酵培养每升PDA液体培养基，加入蔗 糖5 25 g， pH值调节至4.7 6.4，无菌状态下，接种黑曲霉 孢子，黑曲霉孢子加入量为1升PDA培养液加1% (体积)黑 曲霉孢子，孢子浓度为1 X 104 106 cfu/mL、培养温度为30 40 匸，转速为120 150转/分钟，通空气量为培养液总体积即PDA 培养液、蔗糖和黑曲霉孢子接种量的总和的30%，恒温发酵培养 72-100小时，过滤菌丝，发酵液浓縮至培养液总体积的1/20 1/15，析出结晶，超纯水洗涤4 5次，40 50。C烘干，得四草 酸钾产品。
本发明将黑曲霉的分离纯化与其液体发酵培养相结合，使用 马铃薯、蔗糖作为基本培养基质，安全、无毒害，每升PDA培 养基至少可生产1.22 g纯度达98%的四草酸钾白色粉末状产 品，实现了四草酸钾的全程、全能环保型生产；以目前国产分析 纯的四草酸钾市场价位为计算依据，可使四草酸钾的产出、投入 比达到40 50:1，其生产成本比现有技术大幅下降。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进 一 步说明。
首先，分离、纯化得到黑曲霉选取皱边石杉植株的茎段， 经流水冲洗2-3小时一75%酒精消毒1-2 min — 0.01 mol/L 盐酸、5%次氯酸钠、2.4 mmol/L柠檬酸依次冲洗一遍一5%次氯酸钠消毒10 12 min —无菌水冲洗3-5次一10%双氧水 消毒8-12 min —无菌水冲洗4 5次一无菌吸水纸上吸干 表面水一接种于PDA平板上一分离、纯化得到黑曲霉。
例一300 g新鲜马铃薯去皮，称取1 cm方块大小的马铃薯 200 g，加入800 mL蒸馏水煮沸30分钟，过滤，滤液体积补充 至900 mL，加入蔗糖5 g， pH值调至5.3，灭菌。无菌条件下 接种黑曲霉孢子悬液10mL(孢子浓度为1X105 cfu/mL)，无菌 水补充培养基总体积至1 L。转速为120转/分钟，37'C恒温培 养72小时。过滤菌丝，发酵液浓縮至1/20,析出四草酸钾结晶， 超纯水洗漆4 5次，4(TC烘干，得1.22 g纯度达98%的四草 酸钾白色粉末状产品。
例二 300 g新鲜马铃薯去皮，称取1 cm方块大小的马铃薯 200 g，加入800 mL蒸馏水煮沸30分钟，过滤，滤液体积补充 至900 mL，加入蔗糖20g， pH值调至5.8，灭菌。无菌条件下 接种黑曲霉孢子悬液10mL(孢子浓度为1 X 106 cfu/mL)，无菌 水补充培养基总体积至1 L。转速为120转/分钟，34X:恒温培 养84小时。过滤菌丝，发酵液浓縮至1/20，析出四草酸钾结晶， 超纯水洗涤4 5次，40'C烘干，得1.76 g纯度达98%的四草
酸钾白色粉末状产品。
例三300 g新鲜马铃薯去皮，称取lcm方块大小的马铃薯 200 g，加入800 mL蒸馏水煮沸30分钟，过滤，滤液体积补充 至900 mL，加入蔗糖15g， pH值调至5.6，灭菌。无菌条件下 接种黑曲霉孢子悬液10mL(孢子浓度为1 X 104 cfu/mL)，无菌 水补充培养基总体积至1 L。转速为120转/分钟，37'C恒温培 养72小时。过滤菌丝，发酵液浓縮至1/20，析出四草酸钾结晶， 超纯水洗涤4 5次，4(TC烘干，可生产2.1 g纯度达98%的四 草酸钾白色粉末状产品。
权利要求
1、一种黑曲霉发酵生产四草酸钾的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a、黑曲霉的分离纯化选取皱边石杉植株的茎段，经流水冲洗2-3小时→75％酒精消毒1～2min→0.01mol/L盐酸、5％次氯酸钠、2.4mmol/L柠檬酸依次冲洗一遍→5％次氯酸钠消毒10～12min→无菌水冲洗3—5次→10％双氧水消毒8-12min→无菌水冲洗4～5次→无菌吸水纸上吸干表面水→接种于PDA平板上→分离、纯化得到黑曲霉。b、黑曲霉的液体发酵培养每升PDA液体培养基，加入蔗糖5～25g，pH值调节至4.7～6.4，无菌状态下，接种黑曲霉孢子，黑曲霉孢子加入量为1升PDA培养液加1％(体积)黑曲霉孢子，孢子浓度为1×104～106cfu/mL、培养温度为30～40℃，转速为120～150转/分钟，通空气量为培养液总体积即PDA培养液、蔗糖和黑曲霉孢子接种量的总和的30％，恒温发酵培养72-100小时，过滤菌丝，发酵液浓缩至培养液总体积的1/20～1/15，析出结晶，超纯水洗涤4～5次，40～50℃烘干，得四草酸钾产品。
全文摘要
一种黑曲霉发酵生产四草酸钾的方法，该方法包括黑曲霉的分离纯化，及黑曲霉的液体发酵培养每升PDA液体培养基，加入蔗糖5～25g，pH值调节至4.7～6.4，无菌状态下，黑曲霉孢子接种量为1％，孢子浓度为1×10<sup>4</sup>～10<sup>6</sup>cfu/mL、培养温度为30～40℃，恒温发酵培养72-100小时，过滤菌丝，发酵液浓缩至培养液总体积的1/20～1/15，析出结晶，超纯水洗涤、烘干，得四草酸钾白色粉末状产品。本发明将黑曲霉的分离纯化与其液体发酵培养相结合，使用马铃薯、蔗糖作为基本培养基质，安全、无毒害，实现了四草酸钾的全程、全能环保型生产，生产成本大幅下降。
文档编号C12P7/46GK101532037SQ20081003077
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者刘仲华, 史云峰, 禹利君, 胡维新, 范铁芳 申请人:湖南农业大学