专利名称：：丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体说，是涉及在丹参中表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因及其编码的蛋白质和应用。
背景技术：
：丹参酮(tanshinone)是一种从中国传统的中药材丹参中分离得到的一类活性物质，主要由脂溶性的丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮、隐丹参酮等丹参酮类组成。医学临床大量应用总丹参酮治疗金黄色葡萄球菌及其耐药菌株、链球菌等引起的化脓性扁桃腺炎、乳腺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、外耳道炎症及痈肿,外科感染等疗效显著。丹参酮广泛应用于临床医学，目前全球市场需求十分巨大。现代工业化生产中的丹参酮主要靠从丹参等天然植株中提取而获得。然而丹参酮的提取工艺繁琐，损耗量大，且丹参酮及其类似物在植物体内含量较低,所以从天然的丹参中提取丹参酮的方法远远不能满足人们对丹参酮日益增长的需要。因此，丹参酮药源的严重匮乏，己经成为制约丹参酮相关产业发展的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高丹参酮或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将丹参酮生物合成途径中的关键酶基因导入丹参中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高丹参酮含量的最佳途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶是MVA途径中的一个重要的代谢酶，能够催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A縮合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，随后在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下生成甲羟戊酸(MVA),甲羟戊酸经焦磷酸化和脱羧作用形成C5的IPP，从而为丹参酮合成提供通用前体。通过提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活性或含量，可以间接的提高丹参中丹参酮或其前体的含量。药用植物丹参(6"Ww'a啦'7"'o/T力y幼Bunge)为唇形科多年生草本植物，主主产四川、山东、浙江等省。在我国民间常用于祛瘀止痛，活血通经，清心除烦。现代医学研究证明，丹参所含的活性成分具有扩张血管、降血脂、抗动脉粥样硬化、抑制血小板3凝聚、保护心肌、抗菌消炎及抗肿瘤等作用。由于丹参作为重要的产丹参酮的草本植物，使其具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，这无疑为研究丹参酮的生物合成及其分子调控提供了更加快捷的来源与途径。在对现有文献的分析中，"ScineceAsia(亚洲科学)2002,28:29-36"报道了从橡胶树中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因，但至今尚未有从药物植物丹参中分离克隆出3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的文献报道。由于这个基因编码的酶对于丹参酮的生物合成具有重要影响，因此，这一步是利用基因工程技术来调控丹参酮生物合成的重要切入点。
发明内容本发明的目的在于提供一种丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因。本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明的另一个目的在于提供该基因及其编码的蛋白质的应用。本发明所提供的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(DsHMGS)为以下核苷酸序列之一(1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；(2)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。该基因所编码的蛋白质为丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶，是以下氨基酸序列之一(1)具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNo.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。含有本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因全序列或部分片段的重组载体，均属于本发明的保护范围。这些重组载体包括质粒和植物表达载体。含有本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参细胞或丹参发根细胞。优选的宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或丹参发根细胞。本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化丹参细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与丹参细胞共培养，得到转基因的丹参发根系；或者用所述的丹参发根细胞再生丹参植株；或者用所述的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因序列遗传转化获得转基因丹参植株。本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下本发明所说的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的DNA分子包括编码具有丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第118—1500位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40—55'C条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第118_1500的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第118—1500位的核苷酸序列。本发明分离出的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽包括:具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本发明中术语"丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(或多肽)基因"指编码具有丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDN0.1中第118—1500位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的编码框第118—1500位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1中第118—1500位核苷酸序列同源性低至约7(^的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第118一1500位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQIDNO.1中从核苷酸第118一1500位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-90个，较佳地1-60个，更佳地l-20个，最佳地l-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本发明中术语"丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白或多肽"指具有丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶活性的SEQIDNO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶相同功能的SEQIDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。本发明中丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶保守性变异多肽指:与SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1.保守性变异多肽中的取代残基<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明还包括丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶或多肽的类似物。这些类似物与天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽时，可以将丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶表达载体。所述"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。本发明还可用Northern印迹法技术分析丹参3-羟基_3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因产物的表达，即分析丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的RNA转录物在细胞中的存在和数量。此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶源基因或同源蛋白。为了得到与丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因相关的丹参cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选丹参cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自丹参的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因家族的核苷酸序列。本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.，SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明提供的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因是首次从丹参中克隆制备的，填补了从我国药物植物丹参中分离克隆出3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的空白。可以通过基因工程技术用来提高丹参等植物中萜类活性成分丹参酮的含量，转基因结果显示，丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因对促进丹参酮含量的提高有明显作用，丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因可通过转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，尤其可用于中药材丹参的品质改良，对于缓解丹参酮药源严重匮乏问题具有较好的促进作用，因此本发明具有很好的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的克隆1.组织分离(isolation)丹参植株来源于四川，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。2.RNA的分离(RNAisolation)取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents,GIBC0BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据巴西橡胶，红豆杉及其它已克隆得到的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)3'-RACEPCR(UPM+F2)得到DsHMGSF2，(746bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，结果表明其核酸序列及编码蛋白与已知3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(如橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因等)的同源性很高，故初步认为它是一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因。(2)5'-RACE根据3，RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到DsHMGSR2'(896bp)(过程同(l))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。将测序结果与3'RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。(3)将5'RACE测序结果与3'RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物DsHMGSKFl:5'-ATGGCCAAGAATGTCGGG-3'(SEQIDNO.3)和5，-TCAGTGGCCGTTCGCAA-3'DsHMGSKRl(SEQIDN0.4))进行PCR扩增DsHMGS编码区得到DsHMGS编码区(1383bp)(过程同步骤(l))。BLAST的结果证明从丹参中新得到的基因确为一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因。研究表明3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶是是MVA途径中的一个重要的代谢酶，故推测新克隆的基因具有相似的功能。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的丹参DsHMGS蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物Ds腦SFl:5'-ACACCATTCAGCCACCCATTCT-3'为正向引物，寡核苷酸DsHMGSRl:5'-CGATAAAGAAACTACAGATAAT-3'为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，Fl/R2的PCR条件为94°C5分钟，随之以94°C1分钟、60°C1分钟和72°C2分钟进行35个循环，最后以72°C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1097bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序,获得SEQIDNO.1所示的序列。实施例2丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的序列信息与同源性分析本发明新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶全长cDNA的长度为1655bp，详细序列见SEQIDNO.1，其中开放读框位于118-1500位核苷酸。根据全长cDNA推导出丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的氨基酸序列，共460个氨基酸残基，分子量50.6KD,pl为6.04，详细序列见SEQIDNO.2。将丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与巴西橡胶树基因(GenBankAccessionNo.AB294689)具有79%的同源性(见表2);在氨基酸水平上，它与短小蛇根草HMGS(GenBankAccessionNo.BAF98279)的第1-460位氨基酸残基有83%的相同性和91%的相似性(见表3)。由上可见，丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因与巴西橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。故可以认为丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶在提高资源植物中丹参酮的含量上具有显著促进作用。表2.本发明的丹参DsHMGS与巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)HbHMGS的核苷酸序列的同源比较(GAP)表Query118ATGGCCAAGMTGTCGGG-ATCCTCGCCATGGAAATCTACTTCCCTCCCA-CT-TGCATC174Sbjct302ATGGCAMGAATGT-GGGAATTCTCGCTATGGACATCTATTTCCCTCCTACCTATG—TT358Query175CAGCAGGAGGTATTGGAAGCTCACGATGGAGCAAGCAMGGGAAGTACACMTTGGGCTT234Sbjct359CAGCAGGMGCATTGGAGGCTCATGATGGTGCMGCAMGGGMGTATACCATTGGTCTT418Query235GGCCAAGATTGCATGGCATTTTGTTCGGAGGTTGAAGATGTCATTTCGATGAGCATGACA294Sbjct419GGACAGGATTGCATGCCATTTTGTACTGAGGTGGAAGATGTCATCTCAATGAGTTTGACT478Query295GCGGTTACTTCGCTTCTAGGGMGTACMTGTTGATCCGAAGCAGATTGGACGTCTTGAA354SbjctQu6rySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQusrySbjctQuerySbjctQuery479GCAGTTACTTCACTCCTCGACMGTATMTATTGATCCTAAACAAATCGGTCGTCTGGAA538355GTTGGAAGTGAGACCGT-ACTCGACAAGAGCAMTCCATTAAGACATTTC-TGATGCCGA412539GTTGGCAGTGAGACTGTGA-TCGACAAGAGCAAATCTATTAAAAC-CTTCTTGATGCAAA596413TCTTCGAG嵐TGT-GGCAATATTGACATCGMGGTGTTGACTCAAGC-AATGCTTGCTA470597TTTTCGAGAAAT-TCGGAAACACTGACATTGMGGCGTTGACTCAA-CAAATGCATGTTA654471TGGTGGGACTGCAGCACTATTTAACTGTGTCMTTGGGTGGAAAGTAGTTCTTGGGATGG530655TGGGGGGACTGCAGCTTTATTCAACTGTGTCMTTGGGTTGAGAGCAGTTCATGGGATGG714531MGATATGGGCTTGTTGTCTGCACAGACAGTGCGGTATATGCCGAGGGACCAGCTAGACC590715ACGCTATGGACTTGTAGTGTGTACTGACAGTGCGGTCTATGCAGAGGGTCCAGCCCGACC774591TACTGGTGGGGCTGCAGCTATTGCCATGCTAATAGGACCAAATGCACCCATTGCTTTTGA650775AACTGGAGGAGCTGCAGCCATTGCCATGCTAATAGGTCCAGAGGCACCTATTGCTTTTGA834651MGCMGCTTAGGGCGMTCACATGGCTCATGTTTATGATTTTTACMGCCCGACCTTGC710835AAGC嵐TTTAGGGGGAGCCATATGTCTCATGCTTACGATTTTTACMGCCCAACCTGGC894711CAGTGAATATCCAGTTGTTGATGGCMGCTTTCTCAGACTTGTTGCCTTACGGCACTGGA770895TAGCGAATATCCAGTTGTGGACGGCAAACTTTCTCAAACATGCTACCTCATGGCTCTTGA954771TGCTTGTTACMAGGCTTC—TGCCAAMGTTTGAGMGCAGGAGGGCAAGCAGTTCTCG828955TTCCTGCTACAMCATTTCTGTGCC—MGTATGAG嵐TTGGAGGGC嵐CMTTCTCT1012829ATCTT-GGATGCCGACTACTTTGTATTTCATTCTCCATACMCAAGCTTGTACAGAAAAG8871013AT-TTCTGATGCTGAATATTTTGTATTTCACTCTCCTTACAACAAGCTTGTACAGMAAG1071888CTTCT-CTAGATTGTTGTTCMTGACTTT-TCGAGAAATGCCAGCTCCATCGATGAGGCT9451072CTT-TGCTCGTTTGGTGTTCAATGACTTTGT~GAGGMTGCCAGCTCTATTGATGACGCT1129946GCTAAAGAAAAGCTGGCACCATTTTCATCATTMGCAAC-GAGGAAAGCTACCAMGTCG10041130GCTAMGAAAAGCTGGCACCATTTTCAACTTTAT-CTGGTGATGAAAGCTACCAAMCCG11881005TGATCTTGAGAAGGCATCTCMCMGTCGCTMACCTTTCTT-TGATACCAAGGTGCAAC10631189GGATCTTG嵐AGGTGTCCCAACMGTTGCCMGCCCCT-TTATGATGCAAAGGTGCAAC12471064CATCTACTCTCG-TCCCAAAACMGTGGGAAACATGTATACTGCATCGCTCTATGCTGCA1122Sbjct1248CAACCACTTT-GATACCAAAGCAAGTTGGCAATATGTACACTGCATCTTTGTATGCAGCA1306Query1123TTTGCTTCCCT-CATCCACMCMGAGTAGCACT—-TTGGCTGGGCAGAGGGTCATATT1178IIIIMillIUMMMIIllllMillIIIIIMIm1Sbjct1307TTCGCATCCCTACTTC-ACAATAA-AC-A-CACTGAATTGGCAGGTAAGCGGGTGATACT1362Query1179GTTTTCCTACGGCAGTGGTCTGTCAGCCATC-ATGTTCTCTCTTC-GTTT-CACTGAGGG1235Sbjct1363ATTCTCATATGGGAGTGGTTTGACAGCCA-CGATGTTCTCA-TTGAGACTACA-TGAAGG1419Query1236AGAACATCC-TTTCAGCCTGTCCMCATTGCATCTGTTATGAATGTTTCAGAGAA-GTTG1293Sbjct1420CCAACATCCCTTT-AGCTTGTCAMCATTGCMCTGTGATGAATGTTGCAG-GAAAGTTG1477Query1294MGTCAAGGCACGAGTTCCCACCAGAGMATTCGTC-GA-ACTGATGCAGCTCATGGAGC1351Sbjct1478AAGACMGACACGAGTTCCCCCCAGAGMGTTTG-CAGTTA-TCATGAAGCTAATGGAGC1535Query1352A-CAGATATGGAGGC-AAAGACTTCATCACMGCAAGGACTGCAGCCTTCTTG-CACCAG1408Sbjct1536ATC-GATACGG-GGCTAAAGACTTTGTGACAAGCAAGGATTGCAGCAT-CTTGGCGCCTG1592Query1409GTACATACTATCTCACTGAAGTCGACTCCCAA-TACCGMGATTCTATGCCAAGAAGGC1466Sbjct1593GAACATACTATCTCACAGAAGTTGACACC-ATGTATCGMGATTCTATGCCCAGAAGGC1650其中Query表示丹参DsHMGS的核酸序列；Subject表示短小蛇根草HbHMGS2的核酸序列(GenBankAccessionNo.AB294689)。结果在1250个核苷酸的比对中两者有79%的相似性。表3.本发明的丹参DsHMGS与巴西橡胶树HbHMGS氨基酸序列的同源比较(FASTA)表Query1MAKNVGILAMEIYFPPTCIQQEVLEAHDGASKGKYTIGLGQDCMAFCSEVEDVISMSMTAMAKNVGILAM+IYFPPT+QQELEAHDGASKGKYTIGLGQDCMFC+EVEDVISMS+TASbjct1MAKNVGILAMDIYFPPTYVQQEALEAHDGASKGKYTIGLGQDCMPFCTEVEDVISMSLTA6060Query61VTSLLGKYNVDPKQIGRLEVGSETVLDKSKSIKTFLMPIFEKCGNIDIEGVDSSNACYGGVTSLLKYN+DPKQIGRLEVGSETV+DKSKSIKTFLMIFEKGNDIEGVDS+NACYGGSbjct61VTSLLDKYNIDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTFLMQIFEKFGNTDIEGVDSTNACYGG120120Query121TMLFNCVNWVESSSWDGRYGLVVCTDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPNAPIAFESK180TAALFNCVNWVESSSWDGRYGLVVCTDSAVYAEGPARPTGGAAAI亂IGPAPIAFESKSbjct121TMLFNCVNWVESSSWDGRYGLWCTDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPEAPIAFESK180Query181LRANHMA證DFYKPDLASEYPVVDGKLSQTCCLTALDACYKGFCQKFEKQEGKQFSILD240R+HM+HYDFYKP+LASEYPVVDGKLSQTCLALD+CYKFCK+EKEGKQFSIDSbjct181FRGSHMSHAYDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYLMALDSCYKHFCAKYEKLEGKQFSISD240Query241ADYFVFHSPY亂VQKSFSRLLFNDFS腿SSIDEAAKEKLAPFSSLSNEESYQSRDLEK300A+YFVFHSPY亂VQKSF+RL+FNDFRNASSID+AAKEKLAPFS+LS+ESYQ+RDLEKSbjct241AEYFVFHSPYNKLVQKSFARLVFNDFVRNASSIDDMKEKLAPFSTLSGDESYQNRDLEK300Query301ASQQVAKPFFDTKVQPSTLVPKQVGNMYTASLYMFASL腳KSSTLAGQRVILFSYGSG360SQQVAKP+DKVQP+TL+PKQVGNMYTASLYMFASL+腿+LAG+RVILFSYGSGSbjct301VSQQVAKPLYDAKVQPTTLIPKQVGNMYTASLYMFASLLHNKHTELAGKRVILFSYGSG360Query361LSAIMFSLRFTEGEHPFSLSNIASVMNVSEKLKSRHEFPPEKFVELMQLMEHRYGGKDFI420L+AMFSLREG+HPFSLSNIA+VMNV+KLK+RHEFPPEKF+M+LMEHRYGKDF+Sbjct361LTATMFSLRLHEGQHPFSLSNIATVMNVAGKLKTRHEFPPEKFAVIMKLME服YGAKDFV420Query421TSKDCSLLAPGTYYLTEVDSQYRRFYAKKAIA——NGTVANGH460TSKDCS+LAPGTYYLTEVD+YRRFYA+KA+NG+ANGHSbjct421TSKDCSILAPGTYYLTEVDTMYRRFYAQKAVGDTVENGLLANGH464其中Query表示丹参DsHMGS的氨基酸序列；Subject表示巴西橡胶树HbHMGS的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.BAF98279);相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。结果在460个氨基酸的比对中，两者分别有83%的相同性和91%的相似性。实施例3丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯在该实施例中，将全长的丹参DsHMGS编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌根据丹参DsHMGS的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将丹参DsHMGS基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-DsHMGS表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-Ds腦S。2、表达Trx-DsHMGS重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-DsHMGS工程菌于3mL含100ng/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按l:100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100!Lig/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至ODe。。达0.5后，加入IPTG至终浓度lmmol/L继续于37'C分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的lmL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2XSDS上样缓冲液50pL，蒸馏水45pL，二巯基乙醇5|aL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12%SDS_PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-DsHMGS融合蛋白的工程菌。3、Trx-DsHMGS融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达Trx-DsHMGS融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-DsHMGS，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mMCAPS，pH11.0，0.3%N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mMTris-HC1，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His*Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1Mimidazole,500raMNaCl,20mMTris-HC1pH7.9)洗脱来收集Trx-DsHMGS融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20'C酶切16小时后即可分离获的DsHMGS的表达蛋白。此表达蛋白的分子量50.6KD,pi为6.04。4、纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活力测定按Suwanmanee等(Plantscience,2004，166:531537)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白进行酶活力的测定，研究其对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成的影响。反应体系含有0.1MTris-HCL(pH=8.0)，0.2mM乙酰辅酶A,0.05mM乙酰乙酰辅酶A,0.ImMEDTA及10ul酶蛋白样品，总体积为lOOul.反应流程如下首先将"C标记的乙酰辅酶A加入到没有标记的酰基(67dpsnmol—')中稀释成混合物，3(TC预培养2分钟。在加入乙酰辅酶A后的2和4分钟，取等量的40微升的混合物转移到玻璃小瓶中并加入100微升的6MHCL，然后在95'C干燥。在烘干的过程中，硫酯被羟化，未参与反应的"C标记的乙酰基被蒸发了，只有't标记的HMG酸仍然保留在瓶子中，加入500微升的水，用液体闪烁记数器测定"C标记的3-羟基-3-甲基戊1二酰辅酶A的含量。为了计算在上述程序没有去除干净的"C标记的乙酰辅酶A的残余量，实验中设计了一个平行对照。结果表明，表达的蛋白的确具有催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶活性。实施例4丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶或多肽在丹参中进行真核细胞表达及转基因发根中丹参酮含量测定含目的基因(丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因)的表达载体的构建，根据丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的全长序列(SEQIDNO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因cDNA克隆到双元表达载体(如pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，遗传转化资源植物丹参1)取发根农杆菌A4，使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28'C培养过夜。2)取生长8周左右的丹参无菌嫩叶片。3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液，用转化液稀释为100个细菌AnL。取无菌丹参叶片，用无菌的解剖刀划以"+"字形伤口，放入上述转化中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(O.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。4)把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有lOOmL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70'C备用。5)含丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的转基因发根的丹参酮含量测定按Shi等(JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2005,37:481-486)的方法对表达丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的转基因发根进行丹参酮含量测定。结果表明，在表达丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的转基因发根中丹参酮含量比非转基因对照组提高1.2倍(P<0.05)。因此转基因结果证明，丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因对促进丹参酮含量的提高有明显作用，丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。核苷酸序列表SEQUENCELISTING<110>上海师范大学<120>丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因及其编码的蛋白质和应用<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1655<212>DNA<213>丹参CSW^/s/27//〃orr力/zaBunge)<220><221>CDS<222>(118)..(1500)<223><400>1acaccattcagccacccattctctctctacctctctgattcctgagctctgcgactactg60tgtgtgctgtttaactgatccgctatttccttcatttcgtcaactcaagaagtcgag117atggccaagaatgtcgggateetcgccatggaaatetacttccctccc165MetAlaLysAsnValGlylieLeuAlaMetGlulieTyrPheProPro151015acttgcatecagcaggaggtattggaagetcacgatggagcaageaaa213ThrCyslieGinGinGluValLeuGluAlaHisAspGlyAlaSerLys202530gggaagtacacaattgggcttggccaagattgcatggcattttgtteg261GlyLysTyrThrlieGlyLeuGlyGinAspCysMetAlaPheCysSer354045gaggttgaagatgtcatttegatgageatgacagcggttacttegctt309GluValGluAspVallieSerMetSerMetThrAlaValThrSerUu505560etagggaagtaca"gttgatccgaagcagattggacgtcttgaagtt357LeuGlyLysTyrAsnValAspProLysGinlieGlyArgLeuGluVal65707580ggaagtgagaccgtaetcgacaagageaaatecattaagacatUctg405GlySerGluThrValLeuAspLysSerLysSerlieLysThrPheLeu859095atgccgatettcgagaaatgtggcaatattgacategaaggtgttgac453MetProliePheGluLysCysGlyAsnlieAsplieGluGlyValAsp100105110teaageaatgettgctatggtgggactgcagcaetatttaactgtgtc501SerSerAsnAlaCysTyrGlyGlyThrAlaAlaLeuPheAsnCysVal115120125aattgggtggaaagtagttcttgggatggaagatatgggcttgttgtc549AsnTrpValGluSerSerSerTrpAspGlyArgTyrGlyLeuValVal130135140tgcacagacagtgcggtatatgccgagggaccagetagacctactggt597CysThrAspSerAlaValTyrAlaGluGlyProAlaArgProThrGly145150155160ggggetgcagetattgccatgetaataggaccaaatgcacccattget645GlyAlaAlaAlalieAlaMetLeulieGlyProAsnAlaProlieAla165170175tttgaaageaagcttagggcgaatcacatggetcatgtttatgatttt693PheGluSerLysLeuArgAlaAsnHisMetAlaHisValTyrAspPhe180185190tacaagcccgaccttgccagtgaatatccagttgttgatggcaagctt741TyrLysProAspLeuAlaSerGluTyrProValValAspGlyLysLeu195200205tctcagacttgttgccttacggcactggatgettgttacaaaggcttc789SerGinThrCysCysLeuThrAlaUuAspAlaCysTyrLysGlyPhe210215220tgccaaaagtttgagaagcaggagggcBagcagttctcgatettggat837CysGinLysPheGluLysGinGluGlyLysGinPheSerlieLeuAsp225230235240gccgactactttgtatttcattctccatacaacaagcttgtacagaaa885AlaAspTyrPheValPheHisSerProTyrAsnLysLeuValGinLys245250255agettctctagattgttgttcaatgacttttcgagaaatgccagetec933SerPheSerArgLeuLeuPheAsnAspPheSerArgAsnAlaSerSer260265270ategatgaggetgetaaagaaaagctggcaccatttteateattaage981lieAspGluAlaAlaLysGluLysLeuAlaProPheSerSerLeuSer275280285aacgaggaaagetaccaaagtcgtgatcttgagaaggcatctcaacaa1029AsnGluGluSerTyrGinSerArgAspLeuGluLysAlaSerGinGin290295300gtcgetaaacctttctttgataccaaggtgcaaccatctactetcgtc1077ValAlaLysProPhePheAspThrLysValGinProSerThrLeuVal305310315320ccaaaacaagtgggaaacatgtatactgcategetctatgetgcattt1125ProLysGinValGlyAsnMetTyrThrAlaSerLeuTyrAlaAlaPhe325330335gettecetcatecacaacaagagtageactttggetgggcagagggtc1173AlaSerLeulieHisAsnLysSerSerThrLeuAlaGlyGinArgVal340345350atattgttttectacggcagtggtctgteagecateatgttctctctt1221lieLeuPheSerTyrGlySerGlyLeuSerAlalieMetPheSerLeu355360365cgtttcactgagggagaacatcctttcagectgtecaacattgcatct1269ArgPheThrGluGlyGluHisProPheSerLeuSerAsnlieAlaSer370375380gttatgaatgttteagagaagttgaagteaaggcacgagttcccacca1317ValMetAsnValSerGluLysLeuLysSerArgHisGluPheProPro385390395400gagaaattcgtcgaactgatgcagetcatggagcacagatatggaggc1365GluLysPheValGluLeuMetGinLeuMetGluHisArgTyrGlyGly405410415aaagacUcateacaageaaggactgcagecttcttgcaccaggtaca1413LysAspPhelieThrSerLysAspCysSerLeuLeuAlaProGlyThr420425430tactatetcactgaagtcgacteccaataccgaagattctatgecaag1460TyrTyrLeuThrGluValAspSerGinTyrArgArgPheTyrAlaLys435440445aaggecattgcgaatggcacagttgcgaacggccactgaagatgtgata1510LysAlalieAlaAsnGlyThrValAlaAsnGlyHis450455460tgccataaagttggctcttcttctgtctagttgattcagcacatagaaaaataatctaat1570ctattttcattgtttgatacaagcatttgagttggtttgacagatgaattattatctgta1630gtttctttatcgaaaaaaaaaaaaa<210>2<211>460<212>PRT<213>丹参(SalviandltiorrhizaBunge)<400>2MetAlaLysAsnValGlylieLeuAla15MetGlulieTyr10PheProPro15ThrCyslieGinGinGluValLeuGluAlaHisAspGlyAlaSerLys202530GlyLysTyrThrlieGlyLeuGlyGinAspCysMetAlaPheCysSer354045GluValGluAspVallieSerMetSerMetThrAlaValThrSerLeu505560LeuGlyLysTyrAsnValAspProLysGlulieGlyArgLeuGluVal65707580GlySerGluThrValLeuAspLysSerLysSerlieLysThrPheLeu859095MetProliePheGluLysCysGlyAsnlieAsplieGluGlyValAsp100105110SerSerAsnAlaCysTyrGlyGlyThrAlaAlaLeuPheAsnCysVal115120125AsnTrpValGluSerSerSerTrpAspGlyArgTyrGlyLeuValVal130135140CysThrAspSerAlaValTyrAlaGluGlyProAlaArgProThrGly1655145150155160GlyAlaAlaAlalieAlaMetLeulieGlyProAsnAlaProlieAla165170175PheGluSerLysLeuArgAlaAsnHisMetAlaHisValTyrAspPhe180185190TyrLysProAspUuAlaSerGluTyrProValValAspGlyLysLeu195200205SerGinThrCysCysUuThrAlaLeuAspAlaCysTyrLysGlyPhe210215220CysGinLysPheGluLysGinGluGlyLysGinPheSerlieLeuAsp225230235240AlaAspTyrPheValPheHisSerProTyrAsnLysLeuValGinLys245250255SerPheSerArgLeuLeuPheAsnAspPheSerArgAsnAlaSerSer260265270lieAspGluAlaAlaLysGluLysLeuAlaProPheSerSerLeuSer275280285AsnGluGluSerTyrGinSerArgAspLeuGluLysAlaSerGinGin290295300ValAlaLysProPhePheAspThrLysValGinProSerThrLeuVal305310315320ProLysGinValGlyAsnMetTyrThrAlaSerLeuTyrAlaAlaPhe325330335AlaSerLeulieHisAsnLysSerSerThrLeuAlaGlyGinArgVal340345350lieLeuPheSerTyrGlySerGlyLeuSerAlalieMetPheSerLeu355360365ArgPheThrGluGlyGluHisProPheSerUuSerAsnlieAlaSer370375380ValMetAsnValSerGluLysLeuLysSerArgHisGluPheProPro38539039540022GluLysPheValGluLeuMetGinLeuMetGluHisArgTyrGlyGly405410415LysAspPhelieThrSerLysAspCysSerLeuLeuAlaProGlyThr420425430TyrTyrLeuThrGluValAspSerGinTyrArgArgPheTyrAlaLys435440445LysAlalieAlaAsnGlyThrValAlaAsnGlyHis450455460<210>3<211>18<212>■<213>丹参(5WWs迈/7〃orrM^Bunge)<400>3atggccaagaatgtcggg<210>4<211>17<212>DNA<213>丹参(5W".a迈/7〃orr力/zaBunge)<400>4tcagtggccgttcgcaa权利要求1、一种丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因，其特征在于，所述基因是以下核苷酸序列之一(1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；(2)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2、一种丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有以下氨基酸序列之一(1)具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNo.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。3、一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因全序列或部分片段。4、一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求1所述的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因全序列或部分片段。5、根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、丹参发根细胞或丹参细胞。6、丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因应用于制备转基因丹参植株。7、丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因应用于制备转基因丹参发根系。全文摘要本发明公开了一种丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因及其编码的蛋白质与用途。丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因可以通过基因工程技术提高丹参等资源植物中药用活性成分丹参酮的含量，可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，有助于促进丹参酮药源严重匮乏问题的解决，具有很好的应用前景。文档编号C12N1/21GK101250542SQ200810035719公开日2008年8月27日申请日期2008年4月8日优先权日2008年4月8日发明者周根余,开国银,敬王,董彦君,杨陆申请人:上海师范大学