一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法

专利名称：：一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法
技术领域：
：本发明属于可再生生物能源领域，特别涉及一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法。具体说是以一株含油量高生长快的原始小球藻为产油藻种，在生物反应器中高密度发酵培养，所得藻油再经过转酯反应制备生物柴油。
背景技术：
：当今世界日益严峻的环境污染和能源匮乏问题使人类正面临前所未有的巨大挑战，为此，人们开始从环境和经济可持续性发展的角度考虑，开发可再生的碳中性燃料来取代传统的石化燃料。生物柴油就是这样一种环境友好的可再生清洁能源。生物柴油指的是动、植物或微生物油脂经酯化反应后得到的长链脂肪酸烷基单酯，在世界各地特别是欧美地区有着广泛的应用。但是，高昂的原料价格，造成生物柴油的生产成本高于传统的石化柴油，这成为制约生物柴油产业化发展的瓶颈，因此，设法降低生物柴油的原料成本，是生物柴油产业突破的主要方向。目前，大豆、油菜、葵花籽等经济作物是生产生物柴油的主要原料。这种以传统农业为基础的生物能源生产方式不仅产量低而且与粮食作物争夺耕地、淡水、肥料等资源，因此不能满足生物柴油产业对原料油持续增长的需求。微藻是一种能进行光合作用的微生物。"微藻生物燃料"的概念在很早以前就已提出，但是迄今为止，利用微藻生产生物柴油成本依然高昂，无法满足商业化的要求。主要原因在于自养状态下，含油量高的藻种生长缓慢，而生长迅速的藻种往往含油量相对较低。为此，吴庆余课题组以一株淡水绿藻CWore^a/7ro"^6"cc)i^s为材料，率先开展了利用异养微藻来生产生物柴油的研究。在该课题组己经发表的论文(1)MiaoXL，WuQY.2006.Biodieselproductionfromheterotrophicmicroalgaloil.BioresourTechnol97:841-846;(2)XuH，MiaoXL.，WuQY.2006.HighqualitybiodieselproductionfrommicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters.JBiotechnol126:499-507;(3)XiufengLi，HanXu，QingyuWu，2007，Large-scalebiodieselproductionfrommicroalgaGWore^sjOrc^6^力ecoic(sthroughheterotrophiccultivationinbioreactors.BiotechnologyandBioengineering.98(4):764-771.禾口已经申请专利CN1699516A、CN1837352A的内容显示，Cprotot/ec^Vas细胞的单位产量低于16g(干重)/L，含油量低于56%，如此低的微藻细胞产量和含油量还不能满足工业化应用的要求。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法。它是在已有研究成果和专利技术的基础上，进一步提高生物反应器中C;r^oA^:o/^s的产量和含油量，在保证高含油量的同时，实现高密度培养来满足利用异养小球藻细胞生产生物柴油的工业化应用要求。本发明的特征在于筛选含油量高、生长迅速的小球藻藻株，进一步优化该藻株异养发酵的条件，建立向生物反应器中流加营养物的策略和方法、控制搅拌速率、通气量等等，最终得到的微藻细胞密度(单位产量)为108g(干重)/L(以下细胞密度或浓度均是千重)，细胞油脂含量为61%，均大大高于我们早先发表的研究数据(最高细胞密度为15.5g/L，最高含油量55.2%)[1，2，3]。相对于植物油、动物脂肪、餐饮废油等生物柴油原料，高达108g/L的细胞密度和61%的含油量，降低生物柴油的原料成本，使本技术成为一条生物柴油原料油脂制备的经济、高效途径。所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法是以在生物反应器中高密度发酵培养异养小球藻作为制备生物柴油的原料，按照如下步骤进行(1)筛选一株含油量高、生长迅速的小球藻藻株；(2)将筛选到的藻株直接接种至摇瓶中作为一级种子培养；(3)将种子培养物转接至发酵罐中进行二级高密度发酵；(4)在一级种子培养和二级高密度发酵过程中流加营养液、条件优化和过程控制至细胞密度达到最佳；(5)离心收集小球藻细胞并干燥；(6)从干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂为原料，经过转酯化反应制备生物柴油。所述用于异养高密度发酵的C/^WW力e"^fes藻株的含油量高，优选于20%-61%之间，高含油量的藻株采用离心的方式筛选，在上清液中的藻细胞密度较小，含油量较高，将这些细胞接种于琼脂平板中，划线分离，形成单个藻落；为了筛选到生长速度快的藻株，筛选包括一步从平板中挑取大的、单克隆菌落的步骤，发酵罐中细胞密度优选于15-108g/L之间；筛选得到到一株生长速度快、含油量高的藻株CproZJo"eco/c/es077。。本发明中，一级种子培养和二级发酵罐培养的培养基都补加含碳水化合物，一级种子培养和二级发酵培养液中补加的碳水化合物包括但不限于葡萄糖以及其他单糖，二糖和多糖等，浓度优选于0.01-100g/L之间。这些碳水化合物包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麦淀粉水解物和高粱汁。本发明中，一级种子培养和二级发酵培养时接种量优选于0.01%-50%之间。一级种子培养和二级发酵培养时摇床转动或搅拌速度优选于5-1000转/分之间。一级种子培养和二级发酵培养时溶氧一般保持在5%以上，优选20%以上。一级种子培养和二级发酵培养时流加的有机氮源包括但不限于甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物和玉米浆。本发明中，一级种子培养和二级发酵培养时pH值优选6.0-8.0之间，通过流加碱性溶液来降低培养基的酸性，优选氢氧化钾为碱性溶液。一级种子培养和二级发酵培养时温度控制优选20-45"C之间。本发明中，一级种子培养和二级发酵培养时细胞干重优选20-108克/升之间，油脂含量优选40%-61%之间。本发明中涉及的其他对象、技术流程、优势和特点将会出现在下文的详细描述中。本发明方法涉及的技术流程详细描述如下(1)筛选生长速率快，含油量髙的藻株优选离心率为8000~12000g，30min，4""C对异养培养的小球藻细胞进行两次离心。上清中的藻细胞密度较小，含油量较高。接种该细胞于琼脂平板中，划线分离，经过240至360小时的培养形成单个菌落，平板中体积相对较大的单菌落被分别接种至摇瓶中液体培养，分别考察比较各摇瓶中细胞的生长速度及含油量。从细胞的生长速度及含油量最高的一组培养中得到一株含油量高、生长速度快的藻株。藻细胞在琼脂平板上划线分离后的培养使用了添加30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基础培养基，基础培养基的配方与下一部分种子培养和高密度发酵培养相同。倒制平板时，添加1.5%的琼脂粉形成固体培养基，平板培养时培养箱的温度控制在28士0.5nC。(2)在一级反应器中进行藻细胞种子培养将筛选得到的藻株接种至含有基础培养基的摇瓶中作种子培养，基础培养基配方如下KH2P040.7g丄-1,K2HP。40.3g丄-',MgS04'7H200.3g丄"，FeS04.7H203mg丄"，甘氨酸0.1g丄"，维生素B1O.Olmg丄"，A5微量元素液lml丄'1。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2MoCV2H20，ZnS04'7H20，和MnCl2'4H20CuS04'5H20等组分。优化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄陽1，ZnS04.7H200.222g丄"，MnCl2'4H201.81g丄國1,CuS04'5H200.074g丄"。在恒温振荡培养摇瓶中的培养条件对小球藻细胞生长的影响，包括但不限于如葡萄糖浓度、氮源、温度、转速、光强等。生长条件如下将5至50g/L的葡萄糖和1至10g/L市售的酵母提取物分别加入到基础培养基中。其中，采用30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物时，细胞生长达到最优，在20-45°C的范围内，28T为最佳培养温度。摇瓶速度，200转/分对细胞生长最佳。培养过程中还采用了5ymol.m-2s-1的弱光照射(3)种子细胞培养物转接至发酵罐中进行二级高密度发酵，将经过168小时培养，处于对数生长末期的种子培养物转接至二级生物反应器中进行过程控制与优化，该步反应优选在5-11,000L的发酵罐中进行。发酵开始时，在基础培养基中添加了30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。通过调整和控制接种量、底物流加、溶氧、搅拌速率、和温度、pH值等参数对异养小球藻发酵工艺进行了反复优化。优化结果显示，基于溶氧反馈的有机碳源流加补给对生物量和脂肪的积累至关重要。在培养基中分别尝试流加葡萄糖、果糖、蔗糖，玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉水解物以及高粱汁、含糖废水等碳水化合物溶液，然后通过在线监测耗氧量的变化考察细胞生长的状况。发酵工艺优化表明由搅拌速度和通气量变化引起发酵液溶氧(DO)波动对细胞的高密度培养极为重要。通过反复的发酵条件优化和过程控制实验，异养小球藻的高密度发酵条件设定如下接种量为25%;温度28±0,5"C;通气速率180L/h;通过补加10g/L的KOH，将pH值控制在6.3±0.1的范围之内；通过补加500g/L的葡萄糖维持发酵液中葡萄糖浓度在5-18g/L的范围内波动；以0.75g/l/h的速度连续补加有机氮源(巿售酵母提取物)，培养88小时以后，通过逐步提高搅拌速率，使发酵液中的溶氧饱和度维持在20%以上；在128小时以后同时补加氮源和葡萄糖；213小时时，细胞密度达到108g/L,油含量达到细胞干重的61%，终止发酵。(4)收集藻细胞细胞浓度优选20-108g/L，通过取样测定细胞浓度以后，将藻细胞从发酵液中分离出来。该过程包括但不限于过滤和离心工艺。分离得到的藻细胞干粉或者其他固体形态。(5)从干燥的藻细胞中提取油脂从干燥的藻细胞中提取油脂的方法包括但不限于索式抽提法。采用索式抽提法，以正己垸为标准萃取溶剂，从干藻粉中提取油脂。正己烷反复淋洗，直至细胞中不再残留脂肪，然后减压去除溶剂。(6)酯化反应制备生物柴油从藻细胞中提取的油脂制备生物柴油可采用酯化反应。脂肪酸到脂肪酸酯的转化可通过强酸，如浓硫酸催化，或酶催化。脂肪酶(TriacylglycerolAcylhydrolase，EC3.1.1.3)在油/水界面催化水解长链脂肪酸甘油酯，有效催化酯化和酯交换反应。脂肪酶从C朋力'^印.99-725中提取的，催化活力可达12000Ug人最佳甲酯化条件的组合为pH值7.0，加入2.5倍体积的正己烷溶剂，60%固定化脂肪酶(相对于油的质量，酶活12000Ug—0、10%质量分数的水，38°C、160rpm恒温摇床中温育，醇油摩尔比3:1，分三次加入反应体系。用脂肪酶催化生成的脂肪酸甲酯为生物柴油的主要成分。本发明的有意效果是本方法以筛选含油量高、生长迅速的小球藻藻株，进一步优化该藻株异养发酵的条件，采用向生物反应器中流加营养物的方式、控制搅拌速率、通气量等等，最终得到的微藻细胞密度(单位产量)为108g(干重)/L，细胞油脂含量为61%的高密度培养异养小球藻细胞，降低生物柴油的原料成本，满足利用异养小球藻细胞生产生物柴油的工业化应用要求，使本技术成为一条生物柴油原料油脂制备的经济、高效途径。定义除非特别说明，本文中涉及的名词定义如下.-生物柴油从可再生生物脂质资源，如植物油或动物脂中得到的长链脂肪酸烷基单酯。"生物"表示相对于石油基柴油来言，它是一种可再生的生物资源;"柴油"指的是它可用于柴油发动机或像柴油一样作为燃料使用。烷基单酯/单酯一般是指化学组成为脂肪酸酯的生物柴油。例如，脂肪酸烷基单酯生物柴油是由油酸，亚油酸，硬脂酸，棕榈油酸以及其他脂肪酸等成份组成的。藻类指一类水生的光合作用生物，包括单细胞藻和多细胞大型藻类如海带、紫菜等。藻类曾一度被划归为植物，但由于它缺乏根、茎、叶和胚胎等植物特征，因此目前被单独分为一类。微藻个体非常微小的藻类，一般指需借助于显微镜才能观察和识别的单细胞水生藻。异养生物体以有机化合物作为碳源和氮源的营养方式。转酯化反应通过引入含有羟基的化合物，使烷氧基发生交换的反应。长链脂肪酸烷基单酯/脂肪酸甲酯甲醇和脂肪酸加成并脱去一分子水生成的一类有机化合物。生物反应器是一种用于生物细胞培养或涉及生物化学反应过程并具有适当环境条件的容器或设备(包括培养瓶、恒温振荡培养摇瓶和发酵罐等)。异养培养/发酵微生物细胞在耗氧条件下利用葡萄糖或其他有机碳源生长的过程。酵母发酵在厌氧条件下利用酵母菌将糖转化为酒精的过程。燃料乙醇以微生物发酵得到的酒精为原料制备的一种生物燃料。油/脂肪一类具有长链结构的天然碳氢化合物。在本发明中，指的是脂肪酸及其衍生物，包括甘油单酯、二酯、三酯、磷脂以及其他的脂溶性甾醇类物质(如胆固醇等)尼罗红是一种亲脂的荧光染料，在富含脂肪的环境中能发出金黄色荧光。热解在缺氧条件下，有机质高温化学降解的过程。单菌落/藻落在琼脂平板上由单个细胞生长分裂堆积形成的菌落或藻落。恒温振荡培养摇瓶是一种温度、湿度等环境条件可控，供微生物生长或进行其他生化反应的设备。有机碳是一族来自于有机体的含碳化合物(如蔗糖、脂肪等)，它区别于C02等无机碳源。有机氮是指来自于有机体的含氮化合物，如蛋白质、尿素等。高梁禾本科蜀黍属一年生高大草本植物。甜高梁蔗糖含量一般在10%以上的高粱品种。木薯一种根部富含淀粉的灌木状多年生作物。索式抽提器是一种半自动的溶剂萃取装置，在本发明中用于从藻细胞中分离油脂。热值单位质量的燃料完全燃烧所释放的热量。单糖不能被进一步水解，分子式一般为CnH2n0n的碳水化合物，如葡萄糖、果糖、木糖等。二糖由两个单糖单元构成的碳水化合物。多糖由两个以上的单糖单元构成的碳水化合物。水解物经水解反应得到的化合物，在本发明中，一般指纤维素、淀粉或其他多糖物质经水解后得到的单糖或短链寡糖混合物。图1为利用异养小球藻进行高密度发酵生产生物柴油的方法及步骤。图2为在5L生物反应器中异养微藻高密度发酵的细胞生长和葡萄糖消耗曲线。图3为荧光显微镜下尼罗红染色细胞荧光强度测定相对油脂含量。图4为转酯化反应中随反应时间的产物组成变化。具体实施方式本发明提供一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法。它是在已有研究成果和专利技术的基础上，按照图1所示的利用异养小球藻进行高密度发酵生产生物柴油的方法及步骤，进一步提高生物反应器中C./^o幻Meco^/es的产量和含油量，利用高密度培养技术，筛选含油量高、生长迅速的小球藻藻株C/ro"We②ic/Mw07/。匸此菌种不是新的菌种，利用现有菌种培养得到，因此不需要保存)。在保证高含油量的同时，实现高密度培养来满足利用异养小球藻细胞生产生物柴油的工业化应用要求。下面列举实施例对本发明予以进一步说明。实施例原始小球藻(GWorW^3;ro""ecoic^)出发藻株购自美国Texas大学藻种中心，自1990年起，清华大学生物科学与技术系微藻生物能源实验室长期培养该藻种用于生物能源的研究，其基础培养基配方如下-KH2P040.7g/L，K2HP040.3g/L，MgS04'7H200.3g/L，FeS04-7H203mg/L，甘氨酸0.1g/L，维生素B^.01mg/L，A5微量元素液lml/L。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2Mo(V2H20，ZnSCV7H20，和MnCl2-4H20,CuS04.5H20等组分。优化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄'1，ZnS04'7H200.222g丄-1,MnCl2'4H201.81g丄—'，CuSO,5H200.074g丄"。通过步骤l中所描述的定向筛选技术，得到一株生长迅速、含油量高的藻株Cjarotoz^ecoic/ess/。77。。与出发藻株相比,C;zrotot力eccu'ofe51s/(9Z/(密度低，色泽金黄，最大生物量可达108克/升(如图2所示)，含油量高达61%。相比之下，在我们过去已经发表的文献中，出发藻株的最高细胞密度为15.5克/升，最高含油量为55.2%。表1显示了以C/^o力ot力ecojWes邵(W。高密度发酵制备的生物柴油与原初出发藻株一般发酵制备的生物柴油在成分与含量上的差别。将筛选得到的藻株接种至含有基础培养基的500ml摇瓶中作一级种子培养，培养温度为28°C，摇瓶速度为200转/分。在恒温振荡培养摇瓶的基础培养基中，加入30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。培养至168小时(细胞密度约为15g/L)，细胞进入对数生长末期。培养过程中还釆用了5umol.m-2s-l的弱光照射。在一级种子培养和二级高密度发酵过程中，在恒温振荡培养摇瓶中考察了不同培养条件如葡萄糖浓度、氮源、温度、转速等对小球藻细胞生长的影响。生长条件优化过程如下将浓度为5，10，15,20，25，30，35，40，45，50g/L的葡萄糖和浓度为l，2，3，4，5，6，7，8，9,10g/L的市售酵母提取物分别加入到上述基础培养基中，在培养温度为20、25、28、30、33、35、4CTC，摇瓶速度为200转/分的条件下进行考察培养，其中优选后，采用在基础培养基中加入30gZL葡萄糖和4g/L市售酵母提取物，培养温度为28。C，摇瓶速度为200转/分时，细胞生长最佳。处于对数生长期的细胞被接种至发酵罐中继续进行二级高密度培养。发酵培养在5L搅拌式生物反应器(MINITORS，瑞士)中进行，处于对数生长期的原始小球藻细胞接种至加入30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基础培养基中，接种量为25%(V/V)。高密度培养条件如下28±0.5"C，通气速率跪/h，pH值6.3±0.1，在线监测发酵罐中的溶氧变化，一旦溶氧低于饱和度的20%以下时，通过逐步提高搅拌速率，同时连续添加葡萄糖，葡萄糖浓度控制在5-18g/L范围内，使发酵液中的溶氧饱和度维持在20%以上，在128小时以后同时补加市售酵母提取物和葡萄糖，补加氮源速度为0.75g/l/h，通过在5L发酵罐中采用补料流加和过程控制的方式建立高密度培养策略，同时监控发酵罐中葡萄糖、甘氨酸、磷浓度以及pH值和溶氧的变化(如图3所示)。发酵完成后，从发酵液离心收集细胞，并真空干燥。高密度发酵过程中细胞密度通过定时测定光密度值(0D54。n)来估算。005.,。与细胞干重的线性关系可以用以下公式表示y=0.4155x,(R2二0.9933，P<0.05)，其中y表示细胞密度(克/升)，x表示540nm处光密度值。发酵完成后，发酵液于4"C以10000转/分的速度离心2分钟，收集沉淀，真空干燥，称重，共得到108克/升的干藻粉。采用索式抽提法，利用半自动的溶剂萃取装置一索式抽提器，以正己烷为标准萃取溶剂，从干藻粉中提取油脂。在索式抽提器中，用正己烷反复淋洗细胞，直至细胞中不再残留脂肪。异养藻油脂的分子量计算公式如下分子量(M)=56.1X1000X3/(SV-AV)，式中SV(SaponificationValue)代表微藻油脂的皂化值，AV(AcidValue)代表微藻油脂的酸值，计算得到的微藻油脂的分子量是无量纲数值。经过溶剂减压旋转蒸馏后对索式抽提法获得的油脂干燥后进行称中，以油脂净中除以细胞干重，得细胞千重的油脂含量为61%(wV)。酯化反应由来源于Ca/7力'^g邵.效-7M的脂肪酶催化完成，醇油摩尔比3:1，反应在180转/分的恒温摇床中进行，反应结束后，混合反应体系分成上下两层，分离位于上层的生物柴油，并置于5CTC的温水中淋洗，旋转蒸发，去除溶剂，得到纯净的生物柴油。为了考察不同操作条件对生物柴油产率的影响，使反应产物满足美国生物柴油国家标准(ASTM6751)中对甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等含量的要求，我们对各种操作变量进行了分析。这些变量包括反应体系中脂肪酶的用量、甲醇用量、甲醇流加速度、脂肪含量、有机溶剂用量、水含量等参数以及pH值和反应时间等。通过利用气相色谱-质谱连用技术可分析体系中甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等的含量(如图4所示)，据此可计算从油脂到脂肪酸甲酯的转化率。采用DSQGC(Thermo,USA，VARIANVF-5ms毛细管柱30M*0.25丽)气相色谱-质谱串联仪进行分析。流速设定为10mlmin—1。升温程序先升温到70。C，保持2min;然后以10°Cmin—1的速度将温度上升到300°C，保持20min。注射口温度250°C，分流比为30:1。在上述条件下，经过213小时的高密度培养，细胞密度达到108克/升，油含量为细胞干重的61%。在12小时的酯化反应过程中，98.15%的微藻油脂转化为脂肪酸甲酯(生物柴油)，生物柴油的产率为64.66克Z升。共检测到9种脂肪酸甲酯，其中含量最高的是油酸甲酯、亚油酸甲酯和棕榈酸甲酯，其含量占全部生物柴油的80%以上。主要结果如表l所示。表l利用异养小球藻制备的生物柴油的组成成分与含量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1.一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，该方法是以在生物反应器中高密度发酵培养的异养小球藻作为制备生物柴油的原料，具体步骤包括(1)筛选一株生长速率快，含油量高的小球藻藻株；(2)将筛选得到的藻株接种至含有基础培养基的摇瓶或小型生物反应器中进行种子培养，还添加碳水化合物和有机氮源为细胞生长提供营养；(3)将种子培养物转接至含有营养液的发酵罐或其他生物反应器中进行藻细胞高密度发酵即二级培养，发酵罐或生物反应器中细胞密度介于15-120g/L之间；(4)在一级种子培养和二级高密度发酵过程中，向发酵罐或生物反应器中流加营养液并通过其他条件控制至细胞密度达到最佳；(5)离心收集小球藻细胞并干燥；(6)从干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂为原料，经过转酯反应制备生物柴油。2.根据权利要求1所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，所述筛选一株生长速率快，含油量高的小球藻藻株，还包括使C.prato^ecoW^油脂含量达到细胞干重61%的异养培养技术；由于高含油量的藻株密度小，离心后仍悬浮于上清液中，而平板中，体积大的单菌落具有较快的生长速率，因此，筛选得到的藻株是由离心取上清和筛选大的单菌落的方式得到的，所得藻株被命名为C.prato^eco/(5fe07川。3.根据权利要求1所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，将筛选得到的藻株C.prato^ecoW^0770接种至含有碳水化合物浓度为0.01-100g/L的基础培养基的摇瓶或小型生物反应器中作种子培养，按接种量为0.01%-50%，摇瓶转动或搅拌速度为5-1000转/分，溶氧保持在5%20%或20%以上；在恒温、搅拌培养摇瓶或小型生物反应器中间歇或连续补加入浓度为550g/L的碳水化合物和110g/L的有机氮源，通过流加碱性溶液来降低培养基的酸性，使pH值为6-8，温度控制在20-45。C之间。4.根据权利要求1或3所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，所述种子细胞培养物转接至二级发酵罐或生物反应器中进行高密度发酵与过程控制，其接种量介于总体积的0.01%-50%之间，向发酵罐或生物反应器中流加营养液的方法还包括间歇或连续流加操作，发酵罐或生物反应器中原有营养液或添加营养液含有的碳水化合物包括葡萄糖或其他单糖、二糖或多糖，碳水化合物来源包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麦淀粉水解物和高粱汁；碳水化合物浓度控制在0.01-100克/升之间；发酵罐或生物反应器中原有的营养液或添加的营养液含有的有机氮源包括甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物或玉米浆；高密度发酵方法还包括搅拌操作和通气，搅拌速率控制在5-1000转/分之间，通气操作保持培养基中溶氧(DO)值保持在5%20%或20%以上；所述高密度发酵方法还包括向发酵罐中流加碱液用以维持体系pH值在6.0-8.0之间，碱液包括氢氧化钾及其他强碱性化合物；发酵罐内发酵的温度控制在20-45'C之间。5.根据权利要求1所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，所述酯化反应制备生物柴油，首先采用索式抽提法，以正己烷或氯仿为标准萃取溶剂，从发酵液中分离收集的小球藻细胞干粉中提取藻粉油脂，然后以酯交换反应在藻粉油脂中加入醇油摩尔比26:1的甲醇，分三次加入反应体系，在脂肪酶TriacylglycerolAcylhydrolase,EC3丄1.3的有效催化酯化作用下，加热至30。C90。C，160rpm恒温摇床中温育，反应生成的产物，经石油醚及水洗涤，离心取有机相，将有机溶剂蒸发、干燥后获得生物柴油，并分离出副产品甘油。6.根据权利要求1所述利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其特征在于，所述的种子培养和高密度发酵营养液含有的基础培养基配方如下KH2P040.7g丄"，K2HP040.3g丄"，MgS04-7H200.3g丄—1,FeS04'7H203mg丄.1，甘氨酸O.lg丄"，维生素BlO.Olmg丄-1，A5微量元素液lml丄"；其中A5微量元素液的组成为H3B032.86g丄"，Na2Mo04'2H200.039g丄-1,ZnS04-7H200.222g丄隱1,MnCl2-4H201.81g丄"，CuS04'5H200.074g丄1.全文摘要本发明公开了属于可再生生物能源领域的一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法。该方法是以在生物反应器中高密度发酵培养的异养小球藻为原料，主要通过高生长速率与高油脂含量藻种的筛选、直接接种至摇瓶中作为一级种子培养和转接至发酵罐中进行二级高密度发酵培养，进行条件优化与过程控制，并流加含有碳水化合物的培养液为细胞生长提供营养，使达到108g/L、油脂含量达到61％的高密度培养异养小球藻细胞，经过分离、收集并干燥、抽提藻油，再经过转酯化反应制备生物柴油；本发明降低生物柴油的原料成本，满足利用异养小球藻细胞生产生物柴油的工业化应用要求，使本技术成为一条生物柴油原料油脂制备的经济、高效途径。文档编号C12P7/64GK101230364SQ20081010087公开日2008年7月30日申请日期2008年2月25日优先权日2008年2月25日发明者吴庆余,周文广,伟熊申请人:清华大学