专利名称：一种耐高温和有机溶剂的生物-无机杂化材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于固定化酶技术领域，特别是提供了一种耐高温和有机溶剂的生物-无机 杂化材料及其制备方法，在高温下和有机溶剂中具有较高催化活性的生物-无机杂化材 料的制备方法。
技术背景酶作为一种优良的生物活性物质在很多领域中都展现出了优秀的性能，但是其稳 定性较差，在较高温度条件下和有机溶剂中都较易失去活力，这使得其应用受到了很 大程度的限制。针对这些问题，人们提出了固定化酶技术，固定化酶技术又分为吸附 法，共价偶联法，交联法，包埋法四大类。其中吸附法具有制作条件温和，简单等优 点，但酶易脱落，固定量小；共价偶联法具有结合力强的优点，但其激烈的固定化条 件易于使酶失活；交联法也具有结合力强，稳定性高的优点，但其交联条件激烈，且 机械性能差；包埋法条件温和，使用面较广，但扩散等问题严重。因此，提出新的固 定化方法和开发新的固定化材料已成为当务之急。"自组装"作为近年来提出的一种"软合成"手段在越来越多的领域得到了应用。 所谓自组装，是指基本结构单元(分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质)自发形成 有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用 下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。自组装过程并不是 大量原子，离子，分子之间弱作用力的简单叠加，而是若干个体之间同时自发的发生 关联并集合在一起形成一个紧密而又有序的整体，是一种整体的复杂的协同作用。采用自组装方法固定化酶将有利于酶与载体材料的有效复合，从而得到一种理想的杂化 材料。无机纳米层状材料凭借其表面性质可调，机械性能稳定，热稳定性良好等优异的 性能，受到了人们越来越多的关注，已经成为物理、化学、材料等领域的研究热点之 一。对于剥离后的无极纳米层状材料，其形成的稳定胶体溶液使得自组装过程易于进 行，另外，其层间区域完全开放，能实现酶的大量固定化，且其层板会对酶分子起到 很好的保护作用，从而提高酶的稳定性。 发明内容本发明的目的是提供一种耐高温和有机溶剂的生物-无机杂化材料及其制备方法， 扩宽酶的应用范围，解决传统酶固定化方法中存在的问题。该方法工艺简单，成本低 廉，且得到的杂化材料结构可调，适宜规模化生产。本发明的水滑石与酶组装的生物-无机纳米杂化材料的组成为以剥离水滑石纳米 片为载体，与具有生物活性的血红蛋白进行组装，得到一种生物-无机纳米杂化材料， 其中酶与水滑石的质量比为1: 1 30: 1;优选范围为l: 1 1-4，最优的为2: 1。应 用于以双氧水为氧化剂邻苯二胺生成2， 3-二氨基吩嗪反应中，以水为反应介质90摄氏度下的酶活保持率为自由酶的7. 71-18. 57倍，常温下甲苯介质中的酶活保持率为自 由酶的2. 83-5. 75倍。水滑石与血红蛋白的静电自组装、材料结构和分散度可调控、 催化剂的在高温和有机溶剂中的酶活保持率高。本发明以剥离水滑石为无机载体，与血红蛋白进行自组装得到生物-无机纳米杂化 材料，通过调变组装时间与干燥条件，可以得到不同结构的生物-无机纳米杂化材料。 具体工艺步骤如下a. 制备剥离水滑石。采用共沉淀法，使用碱溶液滴加入硝酸镁和硝酸铝混合盐溶 液中，得到乳酸插层的Mg/A^2/1的水滑石浆液，其中溶剂为水。将浆液洗涤至中性， 分散到水中，回流搅拌，直至得到完全澄清透明的胶体溶液。此胶体溶液即为剥离水 滑石溶液。步骤a中所有过程均在氮气保护下进行，所用水均为去二氧化碳去离子水。 步骤a中所得到的剥离水滑石溶液为5. 033g/L。在共沉淀法制备乳酸插层的Mg/Al=2/1的水滑石时，通过对碱滴加条件的改进， 可以用乳酸代替常规的乳酸盐。b. 剥离水滑石与酶组装制备生物-无机杂化材料称取酶O. 1066g-3. 198g，加 入100ml缓冲溶液，再加入20ml剥离水滑石胶体溶液，酶与水滑石的质量比为1: 1~ 30: 1，在25-40摄氏度水浴搅拌条件下，组装10秒-10小时，优选10秒-4小时，最 优为10秒；常温真空干燥或者冷冻干燥，得到生物-无机纳米杂化材料。步骤b中所有过程均在氮气保护下进行，所用水均为去二氧化碳去离子水。 步骤b中所用缓冲溶液的pH值为pH=7-10，优选pH=8-9，最优为pH=8.5。 组装时间为10秒-4小时，这考虑到了不同的组装时间对固定化酶活力的影响，发现短时间组装有利于酶催化活力的保持。对比干燥条件，发现冷冻干燥较常温真空干燥更有利于酶催化活力的保持。本发明的优点在于，利用具有高度热稳定性和化学稳定性的水滑石作为载体，通过调变组装条件和干燥方法，实现组装产物的结构和分散度的调变，从而得到在高温、有机溶剂中都体现出较高催化性能的生物-无机纳米杂化材料。酶与剥离水滑石通过静电自组装方式得到的生物-无机杂化材料较好的保留了酶的催化活力。对于在高温和有机溶剂中，固定化酶展现出高于自由酶酶活保持率。为固定化酶的开发利用、工业生产提供了可能性。
具体实施方式
实施例1:剥离水滑石的制备称取3. 7513g的硝酸铝(A1(N03)3* 9H20)和5. 1280g的硝酸 镁(Mg(亂'6H20)，加入60ml水，配制成Mg/Al为2/1的盐溶液。称取化学计量过 量的乳酸5. 30g (0. 05mol)，用1. 25mol/L的NaOH溶液滴加到剧烈搅拌的乳酸中，至 体系pH值为10，加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值为10。加热至 回流晶化10小时，得到的白色浆液，离心分离，洗涤至中性，在600ml水中分散，加热回流至几乎透明状态。所有过程在氮气保护下进行，所用水全部为去二氧化碳去离子水。 实施例2:称取血红蛋白0. 2132g，溶于100ml pH=8. 5的缓冲溶液中，40摄氏度搅拌条件下 逐滴滴加到20ml剥离水滑石中，滴加完成后，组装10秒，立即离心，洗涤，直至洗 涤液中不再能检测到血红蛋白，将洗漆液定容于容量瓶中，使用紫外可见光谱仪，测 定清液在408nm处的吸光度，计算出血红蛋白浓度，从而计算酶固定化量。将沉淀物 冷冻干燥，得到水滑石与酶组装的生物-无机纳米杂化材料。 实验例3:称取血红蛋白0. 2132g，溶于100ral pH=8. 5的缓冲溶液中，40摄氏度搅拌条件下 逐滴滴加到20ml剥离水滑石中，滴加完成后，在此温度下继续搅拌1小时，静置3 小时，而后离心，洗涤，直至洗涤液中不再能检测到血红蛋白，将洗涤液定容于容量 瓶中，使用紫外可见光谱仪，测定清液在408nm处的吸光度，计算出血红蛋白浓度， 从而计算酶固定化量。将沉淀物冷冻干燥，得到水滑石与酶组装的生物-无机纳米杂化 材料。 实验例4:称取血红蛋白0. 2132g，溶于100ml pH=8. 5的缓冲溶液中，40摄氏度搅拌条件下 逐滴滴加到20ml剥离水滑石中，滴加完成后，在此温度下继续搅拌1小时，静置3 小时，而后离心，洗涤，直至洗涤液中不再能检测到血红蛋白，将洗涤液定容于容量 瓶中，使用紫外可见光谱仪，测定清液在408nm处的吸光度，计算出血红蛋白浓度， 从而计算酶固定化量。将沉淀物常温真空干燥，得到水滑石与酶组装的生物-无机纳米 杂化材料。 实验例5:自由酶在水溶剂中催化活力的测定在90摄氏度，50ral缓冲溶液中，依次加入 0.0324g邻苯二胺，2. lmg血红蛋白，153jaL浓度为30%的过氧化氢溶液，反应10分钟， 将反应液过滤，测定所得溶液在450nm处的吸光度。上述所用缓冲溶液pH值为7。 实验例6:组装产物在水溶剂中催化活力的测定在90摄氏度，50ml缓冲溶液中，依次加入 0. 0324g邻苯二胺，3. 2mg组装产物，153(iL浓度为30%的过氧化氢溶液，反应10分钟， 将反应液过滤，测定所得溶液在450nm处的吸光度。上述所用缓冲溶液PH值为7。 实验例7:自由酶在有机溶剂中催化活力的测定在25摄氏度，50ml甲苯中，依次加入 0. 0324g邻苯二胺，2. l呢血红蛋白，153pL浓度为30%的过氧化氢溶液，在相应温度 下反应10分钟，将反应液过滤，测定所得溶液在450nm处的吸光度。实验例8:组装产物在有机溶剂中催化活力的测定在25摄氏度，50ml甲苯中，依次加入 0. 0324g邻苯二胺，3. 2mg组装产物，153^L浓度为30%的过氧化氢溶液，反应10分 钟，将反应液过滤，测定所得溶液在450nm处的吸光度。催化活力结果如表l所示。表l固定化酶在高温水溶剂和有机溶剂中催化邻苯二胺生成2， 3-二氨基吩嗪的活力真空干燥，组装4小时7.71 2.83冷冻干燥，组装4小时 12.14 3.75 冷冻干燥，组装10秒18.57 5.7权利要求
1. 一种耐高温和有机溶剂的生物-无机杂化材料，其特征在于以剥离水滑石纳米片为载体，与具有生物活性的血红蛋白进行组装，得到生物-无机纳米杂化材料；其中，酶与水滑石的质量比为1∶1～30∶1；应用于以双氧水为氧化剂邻苯二胺生成2，3-二氨基吩嗪反应中，以水为反应介质90摄氏度下的酶活保持率为自由酶的7.71-18.57倍，常温下甲苯介质中的酶活保持率为自由酶的2.83-5.75倍。
2.按照权利要求权利要求1所述的生物-无机杂化材料，其特征在于:酶与水滑石的质量比为l: 1-4: 1。
3. —种耐髙温和有机溶剂的生物-无机杂化材料的制备方法，其特征在于，工艺为a. 制备剥离水滑石采用共沉淀法，使用碱溶液滴加入硝酸镁和硝酸铝混合盐溶液中，得到乳酸插层的Mg/Al=2/1的水滑石浆液，其中溶 剂为水；将浆液洗涤至中性，分散到水中，回流搅拌，直至得到完全澄 清透明的胶体溶液；此胶体溶液为剥离水滑石溶液；b. 剥离水滑石与酶组装制备生物-无机杂化材料:称取酶O. 1066g 3. 198g，加入100ml缓冲溶液，再加入20ml剥离水滑石胶体溶液，酶与 水滑石的质量比为1: 1 30: 1，在25-40摄氏度水浴搅拌条件下，组 装10秒-4小时，室温真空干燥或者冷冻干燥，得到生物-无机纳米杂化 材料。
4、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所有过程均在氮气保 护下进行，所用水均为去二氧化碳去离子水；
5、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a中所得到的剥 离水滑石溶液为5. 033g/L。
6、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，在共沉淀法制备乳酸 插层的Mg/Al二2/1的水滑石时，通过对碱滴加条件的改进，用乳酸代替 常规的乳酸盐。
7、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b中所用缓冲溶 液的pH值为7-10。
8、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b中所用缓冲溶 液的pH值为8-9。
全文摘要
一种耐高温和有机溶剂的生物-无机杂化材料及其制备方法，属于固定化酶技术领域。以剥离水滑石纳米片为载体，与具有生物活性的血红蛋白进行组装，得到生物-无机纳米杂化材料；其中，酶与水滑石的质量比为1∶1～30∶1。首先使用水溶剂将乳酸插层水滑石剥离成为纳米片，通过控制酶的表面电荷，实现酶与带正电的水滑石纳米片的组装，从而实现酶的固定化，固定化酶在高温和有机溶剂条件下表现出较高的催化活性和稳定性。优点在于，利用具有高度热稳定性和化学稳定性的水滑石作为载体，通过调变组装条件和干燥方法，实现组装产物的结构和分散度的调变，从而得到在高温、有机溶剂中都体现出较高催化性能的生物-无机纳米杂化材料。
文档编号C12N11/00GK101275131SQ200810112260
公开日2008年10月1日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者静 何, 哲 安, 鑫 郭 申请人:北京化工大学