南京椴组织培养繁殖方法

专利名称：南京椴组织培养繁殖方法
技术领域：
本发明为南京椴组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
二背景技术：
南京椴(77/&m/^e//m7fl Maxim)属椴树科、椴树属(Tilia)落叶乔木，既 是优良的用材树种和重要的蜜源植物，又是集观树形、树姿、树干、叶片、花 及花序为一身的优良园林观赏树种，可用作行道树、庭荫树、小区绿化的骨干 树种等。目前南京椴野生种群非常少，且自然更新能力差，在群落中处去衰落 种群。相关研究表明南京椴的种子繁殖和扦插繁殖十分困难，因此南京椴资源 非常缺乏。
木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较 大的发展。目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植 株。关于椴树属植物组织培养的研究，最早的报道是Barker从美洲椴的不同组织 中诱导出愈伤组织；Chalupa利用心叶椴幼树腋芽首次获得分化芽；日本人尹阳 等先后开展心叶椴和紫椴的组织培养，并获得成功。我国的吕校石等研究了椴 树组织培养中污染控制技术，得到较好的控制污染的方法；王彦彬等和张亚量、 徐妙珍等筛选出紫椴芽芽分化的最佳培养基；陈罡等研究得到日本椴的组织培 养和快速繁殖中最佳芽诱导培养基、增值培养基、壮苗培养基和生根培养基。 而关于南京椴的组织培养研究尚未见有报道。
本发明已成功采取组织培养繁殖南京椴，解决了南京椴资源增加的重要途 径，对南京椴的保护和经济利用都具有着非常重要的意义。
三
发明内容
1、 南京椴外植体选择分别取一年生实生苗、3-4年生实生苗和多年树大树基 部萌蘖当年生枝条上带腋芽的茎段为外植体，将消过毒的三种来源外植体分别
接于诱导培养基MS+6-BA0.5mg/L +NAA0.02 mg/L +GA32.0mg/L上，琼脂 6.5g/l，蔗糖30g/1， pH为5.8-6.0。每份材料接5瓶，重复三次。观察芽的分化 及分化后的生长情况。结果表明最佳外植体为一年生实生苗带腋芽茎段。
2、 南京椴外植体消毒比较多种消毒方法，结果表明最佳的消毒方法为，将带 腋芽的当年生枝条用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床 上振荡消毒15-20min。流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒 50-60s，立即倒入0.1%的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡 3-5min。将枝条切割为1.0-1.5cm长的茎段，每个茎段带一个腋芽。
3、 南京椴芽的诱导通过3因子3水平正交试验法L9(3"设计9个培养基 组合。将外植体接于9种培养基上，每瓶2个，每种培养基组合接5瓶，重 复3次。外植体接种后，在23-26。C黑暗中培养24h，然后进行正常培养。培 养温度20-26。C，光照时间16h/天，光强2000Ix。观察芽诱导情况，30天后 统计分化率和新稍高。通过软件正交设计助手IIv3.1分析数据，筛选最佳芽 诱导培养基为MS+6-BA0.2 mg / L +KT0.05 mg / L +IBA0.02 mg / L +GA30.1 mg/L，添加琼脂6. 5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 。
4、 南京椴继代与增值调整初代培养基激素水平，通过L9(3勺正交试验重新 设计9个培养基组合。将初代生长30天后的南京椴嫩梢切割后接入9种培养 基中，每个茎段带一个新腋芽。每瓶3个茎段，每种培养基接5瓶，重复三 次。观察芽增殖情况，30天后统计增殖率。通过软件正交设计助手IIv3.1分 析数据，筛选最佳继代增殖基培养基为MS+6-BA0.3 mg/L +IBA0.02 mg/L +GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0。5、南京椴根的诱导将长至3.0-4.0cm高的南京椴试管苗切为两段接入12 种生根培养基(1) MS+BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L;添加琼脂6. 5g/1，蔗 糖30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0。
(2) MS+BA0.05 mg/L +NAA1.0 mg/L; 添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5.8-6.0。
(3) MS+BA0.05 mg/L+NAA1.5 mg/L;添加琼脂6. 5g/1，蔗糖30g/1。培 养基pH为5. 8-6. 0。 (4)MS+BA0.05 mg/L +NAA2.0 mg/L;添加琼脂6. 5g/1， 蔗糖30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0。 (5) MS+BA0.05 mg/L +IBA0.5 mg/L; 添加琼脂6. 5g/1，蔗糖30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0。 (6) MS+BA0.05 mg/L +IBA1.0mg/L;添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0。 (7) MS+BA0.05mg/L +IBA1.5mg/L;添加琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH 为5. 8-6. 0。 (8) MS+BA0.05 mg/L +IBA2.0 mg/L;添加琼脂6. 5g/1，蔗糖 30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0。 (9)MS+BA0.05 mg/L +NAA1.0 mg/L +GA30.05 mg/L;添加琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0。 ( 10)MS+BA0.05 mg/L+NAA1.0 mg/L+ GA31.0 mg/L;添加琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/1。培养基 pH为5. 8-6. 0。 (11) MS+BA0.05 mg/L +NAA0.5 mg/L +GA30.05 mg/L添加 琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5.8-6.0。 ( 12) MS+BA0.05 mg/L +NAA0.5mg/L + GA31.0mg/L，添加琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/1。培养基pH为 5.8-6.0。
观察生根情况，从中筛选诱发根生长的最佳培养基为MS+BA0.05 mg/L +IBA1.0mg/L，添加琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0。具体实施例方式
以下以南京椴一年生实生苗为材料，说明本发明的具体实施方式
。 实施例一
1、 2006年4月15日，选取50株茁壮的南京椴一年生实生苗。剪取地上部 分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长2cm。将外植体用清
水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。 流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60s，立即倒入
0. 1%的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。将消毒 灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基 MS+6-BA0.2 mg / L +KT0.05 mg / L +IBA0.02 mg / L +GA30.1 mg / L，添加 琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5.8-6.0中。每瓶接3株，共接入 70瓶。在温度20-26。C，光照时间10 h /天，光强16001x的条件下，进行培 养。
2、 外植体接入培养基5天后，腋芽开始萌动。至30天时(5月15日)，萌 发率达60%，共获得126株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株 茎上带有已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，与初代苗切为带芽茎段，每 段带一个腋芽。接入继代增值培养基MS+6-BA0.3 mg/L +IBA0.02 mg/L +GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0中，在 温度20-26。C，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。培养5 天后，腋芽开始陆续出梢，30天后(6月15日)，增值率达到ll倍，即每 株继代苗上平均含有11个已萌动的腋芽。
3、 进行第3次继代后，于2006年7月15日，获得继代无菌苗约1386株。 将无菌苗切成带2至3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基MS+BA0.05 mg/L +IBA1.0mg/L，添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0。培养 条件同上。培养10天后，开始生根，30天后生根率达80%。至此，从外植 体接种到获得完整的无菌苗，共需120天的时间，获得无菌苗3300余株。
实施例二
1、 2007年4月25日，选取30株茁壮的南京椴一年生实生苗。剪取地上部 分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长2cm。将外植体用清 水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。 流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60s，立即倒入
0.1%的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。将消毒 灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基 MS+6-BA0.2 mg / L +KT0.05 mg / L +IBA0.02 mg / L +GA30.1 mg / L，添加 琼脂6. 5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5. 8-6. 0中。每瓶接3株，共接入 50瓶。在温度20-26。C，光照时间10 h /天，光强1600k的条件下，进行培 养。
2、 外植体接入培养基5天后，腋芽开始萌动。至30天时(5月25日)，萌 发率达70%，共获得105株不带根的初代无菌苗。无菌苗平均株高4.5cm， 每株茎上带有己萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，与初代苗切为带芽茎段， 每段带一个腋芽。接入继代增值培养基MS+6-BA0.3 mg/L +IBA0.02 mg/L +GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8_6. 0中，在 温度20-26X:，光照时间10h/天，光强1600k的条件下，进行培养。培养5 天后，腋芽开始陆续出梢，30天后(6月25日)，增值率达到10倍，即每 株继代苗上平均含有IO个已萌动的腋芽。
3、 进行第3次继代后，于2006年7月25日，获得继代无菌苗约1050株。 将无菌苗切成带2至3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基MS+BA0.05 mg/L +IBA1.0mg/L，添加琼脂6.5g/1，蔗糖30g/1。培养基pH为5. 8-6. 0。在温 度20-26。C，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。培养10 天后，开始生根，30天后生根率达80%。至此，从外植体接种到获得完整的 无菌苗的120天内，获得无菌苗2400余株。
权利要求
1、本发明南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于南京椴外植体的选择、消毒与取材时间，诱导培养基；继代增殖培养基和生根壮苗培养基的筛选。
2、 根据权利要求1南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于通过不同外植体 在相同条件进行接种，不同外植体芽分化情况差异明显，结果表明一年生种子 苗带腋芽茎段为最佳外植体。
3、 根据权利要求1南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于在不同季节取材 一年生种子苗带腋芽茎段培养，污染情况和分化率有明显差异，结果表明以腋 芽萌动期(南京地区为4月份)为最佳取材时间。
4、 根据权利要求1南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于比较不同的消毒 方法，该发明中最佳的外植体消毒方法是将外植体用清水冲洗干净，然后用洗 衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min，流水冲洗20-30min后， 于无菌操作台上用75%乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1%的升汞消毒10min，最 后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。
5、 根据权利要求1南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于(1) 诱导培养基通过L9(33)(激素3因子浓度三水平)正交试验设计，根 据芽萌发率，并通过软件正交设计助手IIv3.1分析数据，筛选得到最佳芽诱导 培养基为MS+6-BA0.2 mg / L +KT0.05 mg / L +IBA0.02 mg / L +GA30.1 mg / L;添加琼脂6.'5g/1，蔗糖30g/1，培养基pH为5.8-6. 0;温度20-26。C，光照 时间10h/天，光强16001x ;(2) 继代增殖培养基通过L9(3^正交试验设计，根据芽增殖和新梢生长量， 并通过软件正交设计助手IIv3.1分析数据，筛选得到最佳继代增殖基培养基为 MS+6-BA0.3 mg/L +IBA0.02 mg/L +GA30.3 mg/L;添加琼脂6. 5g/1，蔗糖30g/l， 培养基pH为5.8-6. 0;温度20-26。C，光照时间10h/天，光强16001x ;(3) 生根壮苗培养基在继代培养基的基础上，调整激素水平，设计12种 生根壮苗培养基，接种20d后统计生根率、测量根的长度，根据统计分析结果 筛选得到最佳的生根培养基为MS+BA0.05 mg/L +IBA1.0 mg/L;添加琼脂 6.5g/l，蔗糖30g/1，培养基pH为5.8-6.0;温度20-26。C，光照时间10h/天， 光强16001x 。
全文摘要
本发明为南京椴Tilia miqueliana Maxim组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗无性繁殖的技术领域。本发明旨在解决南京椴在种子育苗(种子发芽率低、休眠期长)和扦插繁殖都十分困难的情况下的育苗难题。本发明以不同年龄椴的带腋芽茎段为外植体分别接于诱导培养基上，根据芽诱导结果选择最佳外植体；以不同的消毒方法比较污染率选择最佳消毒方法；以L9(3³)正交试验设计分别筛选最佳芽诱导、继代增值培养基；以继代培养基为基础调整激素水平设计12种培养基，根据生根情况筛选最佳生根壮苗培养基。通过以上实验，优化得到最佳南京椴组织培养繁殖方法。
文档编号C12N5/04GK101347098SQ20081012465
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月28日 优先权日2008年8月28日
发明者李乃伟, 汤诗杰, 郑贵鸣, 郭忠仁, 陆小青 申请人:江苏省中国科学院植物研究所