专利名称：稳定表达hla-g分子的人胚胎干细胞分化细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞。
背景技术：
人胚胎干细胞具有自我复制及多潜能分化的特性，理论上可以分化为机体任何细 胞，例如心肌细胞，胰腺13细胞，多巴胺能神经元等，为临床细胞移植提供了丰富的细胞 来源。但是人胚胎干细胞分化细胞在移植过程中面临着免疫排斥的重大问题。HLA-G属于 非经典HLA-I类基因(HLA-Ib)，有7种亚型，其中4种为膜结合型(HLA-G1、 G2、 G3、 G4)和 3种可溶型(HLA-G5、 G6、 G7)，主要分布在母体胎儿界面绒毛外细胞滋养细胞，在母胎免疫 耐受及器官移植方面具有重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞 分化细胞，解决人胚胎干细胞分化细胞在移植过程中面临着免疫排斥的重大问题。
本发明提供的技术方案是一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞， 其特征在于由下述方法得到 —、构建HLA-G的慢病毒真核表达载体，步骤如下
1)获取胎盘组织cDNA ; 2)设计引物，PCR扩增获得HLA-G序列并回收； 3)将其连接T-easy质粒，酶切，其中上游XbaI内切酶，下游BsrGI内切酶，测序鉴 定，测序结果如SEQ ID No. 3所述； 4)将扩增获得的HLA-G与慢病毒载体质粒连接；
5)在293T细胞中包装慢病毒； 二、建立稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞并检测其全能性 三、诱导稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞随机及定向分化细胞，检测这些分
化细胞HLA-G分子的表达。 上述第2)步中，所述引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. l所述，下游引物序 列如SEQ ID No. 2所述。 上述第5)步中，慢病毒包装过程如下 1)转染时三种质粒的比例DB : CMVA : PMDG = 3 :4:1; 2)包装细胞为293T; 3)转染前24小时，293T细胞传代；4)按如下步骤操作(以100mm的培养皿为例)a) 1. 5ml的无血清0pti-MEM稀释60ul Lipo2000，混匀，RT，放置5分钟;
b) 1. 5ml的无血清0pti-MEM稀释24ug质粒，混匀
c)将上述稀释液混合、混匀、RT、放置20分钟
5)将3ml混合液加入含有适量培养基的293T细胞的培养皿中；
6) 37°C 、5% C02培养箱培养8h，换液(预热)，并开始计时；
7) 24h及48h分别收集培养液，4。C避光保存；8)2000rpm离心5min，取上清约lml，加入K562或直293T细胞中，同时力口 2ul ; Polybrene(4ug/u1)，2小时后补加lml新鲜培养液，24_48h观察细胞是否出现绿色荧光；
9)0. 45ul滤器(Milipore公司)过滤收集的培养上清液 10)采用柱子(Milipore公司，Amicon Ultra-15centrif卿l Filter Devices货 号UFC910096) ，4000g，30分钟; 11)收集病毒浓縮液，滴度测定，分装，-S(TC保存。 上述第二步中，慢病毒转染人胚胎干细胞建立稳定表达HLA-G分子的过程是
(1)胶原酶IV消化人胚胎干细胞；
(2)PBS洗2遍； (3)加入2ml培养液将人胚胎干细胞重悬； (4)同时力口入60ul病毒液及8ul Polybrene (5mg/ml); (5) 2小时后离心，PBS洗2遍，去除病毒 (6)将人胚胎干细胞重新种植于饲养层细胞上，72小时后加入50ug/ml潮霉素B 筛选，获得稳定表达HLA-G的人胚胎干细胞。 本发明的具有如下优点本发明采用慢病毒转染系统对人胚胎干细胞进行基因修 饰。对于人胚胎干细胞进行基因修饰目前最好的技术手段就是慢病毒转染系统。该系统的 优点是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细 胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，是目前理想的基因转移载体。 本发明人设计了将具有免疫耐受作用的HLA-G分子稳定转染人胚胎干细胞，并使其分化细 胞依然表达HLA-G分子。本发明对于解决临床将人胚胎干细胞定向分化细胞进行移植时的 免疫排斥问题奠定基础，具有深远的临床应用价值。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。 实施例1 :人胚胎干细胞HLA-G蛋白的表达 1 、人胚胎干细胞HLA-G蛋白的表达 (1) Western-blot检验人胚胎干细胞HLA-G蛋白的表达 采用MEM-G/1单克隆抗体(Serotec公司)1 : 500检验人胚胎干细胞HLA-G蛋白 的表达。具体步骤见《分子克隆第三版》 (2)免疫荧光法检验人胚胎干细胞HLA-G蛋白的表达 采用0ct-4单克隆抗体(Chemicon公司)(1 : 100)及MEM-G/9单克隆抗体 (1 : 25)共染人胚胎干细胞，检验人胚胎干细胞HLA-G蛋白的表达。具体步骤见《分子克 隆第三版》 结果人胚胎干细胞不表达HLA-G蛋白 实施例2 :诱导人胚胎干细胞随机分化及定向分化多巴胺能神经元、胰腺细胞并检验其HLA-G分子的表达 1、人胚胎干细胞随机分化及HLA-G分子的表达 将人胚胎干细胞用胰酶消化，种植于无饲养层，铺有matrigiel的培养皿中，去除 培养液中bFGF因子，使其随机分化。并于1周、2周、3周、4周收集细胞，提取蛋白，通过 Western-blot检测这些分化细胞HLA-G分子的表达。结果表明人胚胎干细胞分化细胞不表 达HLA-G蛋白。 2、人胚胎干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并检测其HLA-G分子的表达
将人胚胎干细胞与PA6(小鼠骨髓基质细胞)共培养诱导人胚胎干细胞向多巴胺 能神经分化，3周后，检测细胞Nestin，酪氨酸羟化酶神经标志物。通过Western-blot检测 这些分化细胞HLA-G分子的表达。 人胚胎干细胞诱导分化为多巴胺能神经元特异性表达酪氨酸羟化酶及Nestin蛋 白，不表达HLA-G蛋白。 3、人胚胎干细胞诱导分化为胰腺细胞并检测其HLA-G分子的表达
首先用悬浮培养生成EB，并平铺于胰岛素_转铁蛋白_硒_纤维结合素培养基中， 再在含bFGF、 N2和B27的培养基中扩增胰腺前体细胞。接着降低培养基中的葡萄糖浓度， 撤消bFGF，加入烟酰胺。最后，分离细胞并悬浮培养以使细胞继续生长，形成细胞集落，然后 检测培养液中胰岛素的含量。通过Western-blot检测这些分化细胞HLA-G分子的表达。
人胚胎干细胞诱导分化为胰腺细胞特异性表达胰岛素及胰岛素前体，但不表达 HLA-G蛋白。 实施例3 :制备稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞
1 、构建HLA-G的慢病毒真核表达载体 [OO56] (1)获取胎盘组织cDNA ; (2)设计引物，引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，即 ATCGTCTAGAATGGTGGTCATGG ;下游引物序列如SEQ ID No. 2所述，即ATCGTGTACATCACTTGTC ATCGTCGTCCTTGTAGTCATCTGAGCTCT 。利用设计的弓|物进行PCR扩增，获得HLA-G1全长序列并 回收； (3)将其连接T-easy质粒，酶切(上游Xbal内切酶，下游BsrGI内切酶)、测序鉴
定，测得的序如SEQ ID No. 3所述。 (4)将HLA-G全长与慢病毒质粒连接。 (5)在293T细胞中包装慢病毒，构建HLA_G的真核表达载体，慢病毒包装过程如 下 1)转染时三种质粒的比例DB : CMVA : PMDG = 3 :4:1; 2)包装细胞为293T ; 3)转染前24小时，293T细胞传代；4)按如下步骤操作(以100mm的培养皿为例)a) 1. 5ml的无血清0pti-MEM稀释60ul Lipo2000，混匀，RT，放置5分钟; b) 1. 5ml的无血清0pti-MEM稀释24ug质粒，混匀 c)将上述稀释液混合、混匀、RT、放置20分钟 5)将3ml混合液加入含有适量培养基的293T细胞的培养皿中；
5
6) 37°C 、5% C02培养箱培养8h，换液(预热)，并开始计时；
7) 24h及48h分别收集培养液，4。C避光保存；8)2000rpm离心5min，取上清约lml，加入K562或直293T细胞中，同时力口 2ul ; Polybrene(4ug/u1)，2小时后补加lml新鲜培养液，24_48h观察细胞是否出现绿色荧光；
9)0. 45ul滤器(Milipore公司)过滤收集的培养上清液 10)采用柱子(Milipore公司，Amicon Ultra-15centrif卿l Filter Devices货 号UFC910096) ，4000g，30分钟; 11)收集病毒浓縮液，滴度测定，分装，-S(TC保存。 2、建立稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞并检测其全能性慢病毒转染人胚胎 干细胞建立稳定表达HLA-G分子的过程
(1)胶原酶IV消化人胚胎干细胞；
(2)PBS洗2遍； (3)加入2ml培养液将人胚胎干细胞重悬； (4)同时力口入60ul病毒液及8ul Polybrene (5mg/ml); (5) 2小时后离心，PBS洗2遍，去除病毒 (6)将人胚胎干细胞重新种植于饲养层细胞上，72小时后加入50ug/ml潮霉素B 筛选，获得稳定表达HLA-G的人胚胎干细胞。 3、诱导稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞随机及定向分化细胞，检测这些分化 细胞HLA-G分子的表达，具体操作过程与实施2相同，最后获得稳定表达HLA-G分子的人胚 胎干细胞随机及定向分化细胞，如心肌细胞，胰腺P细胞，多巴胺能神经元等，为临床细胞 移植提供了丰富的细胞来源。
核苷酸序列表 〈110〉赵宏喜，姚元庆，李凌松，王莉 〈120〉稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞 〈160>3 〈210>1 〈211〉 13 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1ATCGTCTAGA ATGGTGGTCA TGG 13 〈210>2 〈211>48 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2ATCGTGTACA TCACTTGTCA TCGTCGTCCT TGTAGTCATC TGAGCTCT 48
〈210>3
〈211>1017
60101]〈212>DNA
0102]〈213〉人体
0103]〈400>3
0104]ATGGTGGTCATGGCACCCCGMCCCTCTTC
0105]GAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATGAGG
0106]CGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGC
0107]GACAGCGACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAG
0108]CCAGAGTATTGGGMGAGGAGACACGGMC
0109]MCCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACMC
0110]TGGATGATTGGCTGCGACCTGGGGTCCGAC
0111 ]GCCTACGATGGCMGGATTACCTCGCCCTG
0112]GACACTGCGGCTCAGATCTCCMGCGCMG
0113]AGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAG
0114]GAGATGCTGCAGCGCGCGGACCCCCCCMG
0115]TATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTG
0116]TGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAG
0117]GGGGATGGMCCTTCCAGMGTGGGCAGCT
0118]TACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTG
0119]TCTTCCCTGCCCACCATCCCCATCATGGGT
0120]GTAGTCACTGGAGCTGCGGTCGCTGCTGTG
CTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCTGACC60
TATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGC120
TACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTC180
CCGCGGGCGCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGG240
ACCMGGCCCACGCACAGACTGACAGMTG300
CAGAGCGAGGCCAGTTCTCACACCCTCCAG360
GGACGCCTCATCCGCGGGTATGMCAGTAT420
MCGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCAGCG■
TGTGAGGCGGCCMTGTGGCTGMCAMGG540
TGGCTCCACAGATACCTGGAGMCGGGMG600
ACACACGTGACCCACCACCCTGTCTTTGAC660
GGCTTCTACCCTGCGGAGATCATACTGACC720
GACGTGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCA780
GTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGA840
CCGGAGCCCCTCATGCTGAGATGGMGCAG■
ATCGTTGCTGGCCTGGTTGTCCTTGCAGCT960
CTGTGGAGGA AGMGAGCTC AGATTGA101权利要求
一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，其特征在于由下述方法得到一、构建HLA-G的慢病毒真核表达载体，步骤如下1)获取胎盘组织cDNA；2)设计引物，PCR扩增获得HLA-G序列并回收；3)将其连接T-easy质粒，酶切、测序鉴定；4)将HLA-G与慢病毒载体质粒连接；5)在293T细胞中包装慢病毒；二、建立稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞并检测其全能性；三、诱导稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞随机及定向分化细胞，检测这些分化细胞HLA-G分子的表达。
2. 根据权利要求1所述的稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，其特征在于 第2)步中，所述引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. l所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。
3. 根据权利要求1所述的稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，其特征在于 第3)步中，所述酶切用的酶是上游Xbal内切酶，下游BsrGI内切酶。
4. 根据权利要求1所述的稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，其特征在于 第二步中，慢病毒转染人胚胎干细胞建立稳定表达HLA-G分子的过程是(1) 胶原酶IV消化人胚胎干细胞；(2) PBS洗2遍；(3) 加入2ml培养液将人胚胎干细胞重悬；(4) 同时加入60ul病毒液及8ul Polybrene ;(5) 2小时后离心，PBS洗2遍，去除病毒;(6) 将人胚胎干细胞重新种植于饲养层细胞上，72小时后加入50ug/ml潮霉素B筛选， 获得稳定表达HLA-G的人胚胎干细胞。
全文摘要
本发明提供了一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，为临床细胞移植提供了丰富的细胞来源，解决了临床将人胚胎干细胞定向分化细胞进行移植时的免疫排斥问题，具有深远的临床应用价值。
文档编号C12N15/867GK101748099SQ20081018260
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者姚元庆, 李凌松, 王莉, 赵宏喜 申请人:赵宏喜;姚元庆;李凌松;王莉