专利名称：制备减毒病毒株的方法
制备减毒病毒株的方法本发明涉及制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚 合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述聚合物与所述病毒的接 触，其中所述易感病毒的特征在于减少病毒板的方法，其中由所述减毒病毒得到的病毒株 具有不同于产生其的野生型病毒株株的稳定的表型和基因型特征。所述方法包括通过用浓 度递增的所述硫酸化聚合物连续传代约15次或更多次而实现所述硫酸化聚合物与对所述 聚合物的抑制敏感的病毒的接触。根据本发明方法，第一次传代中所述至少一种硫酸化聚 合物的浓度应小于所述聚合物针对野生状态下易感病毒的ic5(l。特别地，本发明涉及下述方法，包括通过用浓度递增的连续传代使至少一种硫酸 化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒相接触以改变所述病毒的致病性行为。在本发明的一个特定目的中，还涉及通过上述方法获得的减毒病毒株，以及包含 所述减毒病毒株的治疗性或预防性组合物。此外，本发明还包括含有通过本发明方法得到 的减毒病毒株的疫苗。
背景技术：
硫酸化多糖是非常丰富且易得的化合物，其可分离自多种天然来源，并且因其广 泛而多样的物理化学性质而为人所知，这使得它们适于医学和药理学领域中的不同应用。 由于其免疫调节剂和抗肿瘤剂活性，对凝血系统和炎性过程的作用，它们已显示出通过影 响病毒复制而可用于皮肤病学、饮食计划等方面。可发现的其天然来源有藻类，它们构成了 细胞壁。根据藻类的类型，可分离具有与糖胺聚糖(GAG)类似结构的那些，其可具有广泛的 抗病毒活性(Pujol C.A等，2007)。因此，其抑制广谱包膜病毒的有效作用可以针对例如 逆转录病毒1型和2型人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，疱疹病毒1型和2型疱疹 病毒(HSV-1和HSV-2)，人巨细胞病毒(HCMV)，假狂犬病毒；黄病毒2型登革病毒；天花病 毒；天花病毒(variola virus)；肝DNA病毒乙型肝炎病毒(HBV)；正粘病毒甲型流感病 毒(infA)；副粘病毒呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒；棒状病毒水泡性口膜炎病毒 (VSV)；嵌沙样病毒胡宁病毒(Jiminvirus)，塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)；披膜病毒 辛德毕斯病毒，塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(表1)和一些无包被病毒，例 如脑心肌炎病毒、甲型肝炎病毒(Girond S等1991)和乳头状瘤病毒(HPV) (Buck CB等， 2006)，包括DNA与RNA病毒。对于这些病毒中的大部分而言，病毒与细胞的初始结合主要 由毒粒与已知为硫酸乙酰肝素的GAG类型的细胞表面的相互作用所介导(Esko JD,Selleck SB,2002)。通常，已知硫酸多糖通过化学上模拟硫酸乙酰肝素Q^paran sulphate)阻断病毒 感染，因此同病毒与细胞表面的初始结合进行竞争。表1 提取自海藻的硫酸多糖的抗病毒活性 GAG是无分支的长链多糖，其由连续重复的二糖单位(其可以是硫酸化的)形成。 GAG可分为两类糖胺聚糖(例如硫酸乙酰肝素)以及半乳糖胺聚糖(例如硫酸软骨素)。 从其名称可看出，定义的差异在于初始引入的糖单位分别为N-乙酰基-葡萄糖胺或N-乙 酰基-半乳糖胺。另一个重要区别在于糖胺聚糖以一系列1，4-糖苷键相连，而半乳糖胺聚
6糖则以交替的1，3_和1，4_糖苷键相连。GAG主要位于细胞表面和中胚层组织的大部分细 胞基质中，如表2中所示(结缔组织、软骨、肌肉和骨)，它们经常与蛋白质核心相连，由此形 成所谓的蛋白聚糖。GAG是带负电的分子，其可以具有生理意义，例如，透明质酸、硫酸皮肤 素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素。表2 作为抗病毒剂测试的聚阴离子物质可根据分子上存在的阴离子进行分类。聚磺酸 酯代表最大类别的具有抗病毒特征的聚阴离子，其中包括硫酸多糖和聚乙烯醇衍生物、聚 缩醛、萘、聚苯乙烯以及其它聚合物。在该领域中，已经对分离自海藻的硫酸多糖或其合成 类似物以及分离自其它天然来源(例如高等植物、海洋无脊椎动物和蓝细菌)的抗病毒物 质进行了许多研究(Damonte EB等，2004)。红藻在其细胞壁中含有大量多糖，其大部分为硫酸半乳聚糖。这些半乳聚糖通常 由1，3-α-吡喃型半乳糖苷键和l，4-i3-D-吡喃型半乳糖苷键的交替重复单位构成，其硫 酸化的水平和模式以及甲氧基和/或丙酮酸基团以及其它糖(例如甘露糖和木糖)的取代 有所不同。它们还在3，6_脱水半乳糖含量以及1-3-α-吡喃型半乳糖残基构型上有所不 同。在这些半乳聚糖中，可提及的是卡拉胶，其具有与半乳糖胺聚糖中观察到的模式 相类似的结构。这些化合物作为胶凝剂和增稠剂大量用于食品工业和生物技术工业。它们 包括一组广泛的结构，可分为两个家族家族，其由β -D单位中存在硫酸化C4基团而定义 并且由卡拉胶_ κ / t和卡拉胶-μ /V所形成，以及家族，其特征为硫酸化C2基团以及由所 有种类的λ结构构成(Painter TJ, 1983) 0 λ-和t -类型的卡拉胶比大多数来源于组织的硫酸乙酰肝素的硫酸化程度更高(Esko JD和SelleCk，2002)。一般来说，此类型的卡拉 胶显示出略微大于κ-卡拉胶的病毒抑制潜力。最近，已有报道称在炎症、感染或组织损伤的过程中，蛋白聚糖硫酸乙酰肝素被 切割，得到可溶性硫酸乙酰肝素的片段(Ihrcke NS等，1998)。另一方面，在健康组织中， 不存在显著的可溶性硫酸乙酰肝素级分，尽管它们可存在于受损组织的流体中(在激活 树突状细胞所需范围内的浓度下(Kainulainen VH等，1998))，以及在受感染个体的尿中 (Oragui, E 等 2000)。因此，化学结构类似于某些GAG (例如细胞硫酸乙酰肝素)的硫酸化聚合物在选择 压力下会产生对所述化合物有抗性的病毒变体，所述GAG具有对确定病毒的抑制活性(例 如是单纯疱疹病毒的抑制剂)并且其作用机制影响病毒周期的某些阶段。同时，经修饰的 病毒_化合物结合位点可能作为抗原决定簇或毒力表达位点而干扰其它功能。根据上述讨论，但不限于特定假说，本发明人认为所述病毒变体可能作为与含有 细胞硫酸乙酰肝素之卡拉胶结构类似的后果而自发存在，这导致表型和基因型的修饰，并 影响作为gB、gC或糖蛋白的病毒包膜。另一方面，HSV已发展出多种免疫逃避策略，以应答于感染和再活化期间的宿主攻 击。这些机制中的一些包括1)病毒逃避，其是由于病毒包膜的改变或者在潜伏期病毒表达的减少。2)病毒抗性，例如防御细胞的促凋亡和抗凋亡作用的依次诱导。3)病毒反击，其抑制树突状细胞的衰老(Novak N和Peng WM, 2005)。免疫逃避的一些决定因素可见于HSV-I表面糖蛋白中，其表达于病毒包膜上以 及受感染细胞的表面。因此，gB通过减少恒定链的表达以及阻止MHC II抗原的呈递与 HLA-DR以及HLA-DM多肽相互作用(Neumann J等，2003)。gC插入避免了由补体介导的中和 (Friedman HM等，2000)，另外还会涉及单核细胞向内皮细胞的添加(Larcher Cl等，2001)。 另一方面，gD诱导kB(NF-KB)核因子的活化，并保护其在感染的早期阶段免遭凋亡，这保 证了充分的病毒复制(Novak N和Peng W. M，2005)。因此，内源可溶性多糖或外源多糖(例 如杀生物剂)的连续相互作用产生的这些糖蛋白的变化可改变其正常行为，导致无症状或 亚临床感染。特别地，通过本发明方法获得的变体将涉及上述第1点，例如糖蛋白中的变化 直接通过如下而显示出来产生对原始药物或类似化合物的抗性，对于模式菌株的不同细 胞致病作用以及更大的体外扩散速率。此外，对病毒胸苷激酶(TK)的遗传修饰会导致由于 潜伏而使病毒再活化减少或消除(EfstathiouS等，1989，Evans J，等，1998)。卡拉胶是具有不同结构类型的硫酸化多糖，其分离自红藻 Gigartinaskottsbergii,已被鉴定为HSV-1和HSV-2的高效选择性抑制剂。对卡拉胶针 对HSV复制的作用机制的研究表明，它们主要影响病毒周期的最初阶段即吸附，涉及表面 糖蛋白(Carlucci MJ等，1999a ;Carlucci MJ等，1999b)。另一方面，已知频繁使用抗病毒 剂会产生抗性，这通过下述在体外确认，使用HSV-I并连续传代至递增浓度的卡拉胶μ /ν 1C3 (Carlucci MJ等，2002)，获得具有不同细胞致病性特征、药物抗性和毒力的变体。因此，由于构成细胞GAG的杂多糖与天然或合成聚合物的硫酸化结构之间的类似 性，本发明人提议，通过用递增浓度的上述抗病毒作用涉及复制周期第一阶段的化合物的 连续传代，可减弱某些易感病毒的致病作用，因此可将它们用于治疗和预防的目的。
现有技术中用于生产减毒病毒株的一些方法描述如下1.在另一种宿主(不同于在其中造成疾病的宿主)中连续传代野生型病毒。因 此，选择对所述第一宿主通常丧失毒力的变体。其为通常导致混合群体的凭运气的方法，将 所述减毒病毒株从所述群体中克隆以进行表征。2.使野生型病毒库(wild virus stock)突变，并分析存活病毒颗粒，所述存活病 毒颗粒可能已经通过负责其的基因的随机突变而失去了毒力。这是繁琐且过于细致的方 法，其不总是提供所预期的结果。3.从生态系统中任何受感染宿主中随机分离减毒病毒株，例如麻疹疫苗毒株。4.对于基因组已经完全测序的病毒，可在特异性位点引入核苷酸(定点诱变)或 者除去它们，以改变负责毒力的基因序列。这仅在毒力依赖于单一基因表达的情况下才有用。然而，现有技术中用于生产减毒病毒株的方法显示出下列缺点1. 一旦被引入到对象中并且由所述对象排出到环境中，则用于疫苗接种的病毒株 的毒力有可能回复，例如抗脊髓灰质炎病毒的疫苗情况即如此。2.疫苗种子被其它病毒的不可见污染，例如，第一批脊髓灰质炎减毒疫苗被来自 猴肾原代细胞系之细胞基质的SV40病毒所污染。目前，推荐将人胚胎细胞系用作疫苗基 质，以避免风险。3.对于孕妇和免疫缺陷人群来说是不可取的。但是，尽管有所有这些不便，减毒病毒疫苗仍使得一些最重要的人类病毒病(例 如天花、脊髓灰质炎、麻疹和风疹)得到遏制。事实上，疫苗基于减毒活病毒，并具有以下优点1.-它们是良好的免疫原。2. _它们诱导大且强烈的免疫反应。这是由于以下的事实病毒在有机体中复制， 其扩增是受限的，没有到达重要器官，因为免疫系统阻止了感染，取而代之的是类似于天然 感染的免疫记忆。3.-—般说来，对于有效免疫而言，单次施用疫苗即可足够。通过随后自然再感染 或者进行重复施用(recau dose)来维持免疫保护水平。4.-通过接种、呼吸和摄入方式施用它们。这些方法赋予了体液和局部的免疫，避 免了开放处的微生物感染以及其随后的散布。因此，本发明人开发了一种产生减毒病毒株的新的有利方法，其可满意地解决现 有技术方法的许多缺点。发明简述本发明涉及制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚 合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述聚合物与所述病毒的接 触，其中所述易感病毒特征在于减少病毒板的方法，其中由所述减毒病毒得到的病毒株具 有不同于产生其的野生型病毒株株的稳定的表型和基因型特征。本发明还涉及通过权利要求的方法获得的减毒病毒株的用途，其中所述病毒株用 于制备具有治疗和预防活性的疫苗或药物组合物。发明详述
本发明涉及制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚 合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述聚合物与所述病毒的接 触，其中所述易感病毒的特征在于减少病毒板的方法，其中由所述减毒病毒得到的病毒株 具有不同于产生其的野生型病毒株株的稳定的表型和基因型特征。所述方法包括通过用浓 度递增的所述硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代约15次或更 多次而实现所述聚合物与所述病毒的接触。根据本发明方法，第一次传代中所述至少一种 硫酸化聚合物的浓度应低于针对野生型状态下所述易感病毒的IC5(I。特别地，本发明涉及下述方法，包括通过用浓度递增的连续传代使至少一种硫酸 化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒相接触以改变病毒的致病性行为。在本发明的一个具体目的中，还涉及通过上述方法产生的减毒病毒株，其用途以 及包含其的治疗和预防组合物。此外，本发明还包括含有通过本发明方法得到的至少一种 减毒病毒株的疫苗。根据本发明，减毒病毒株指尽管其感染细胞并在有机体中复制，但不能引起疾病 的活病毒株。由此，一旦与它们相接触，免疫系统就可以准备保护有机体免受致病病毒株的 再感染(Basualdo J A 等，2006)。根据本发明，所述减毒病毒株具有改变的病毒结构。特别地，通过本发明方法产生 的所述减毒病毒株具有改变的包膜。因此，本发明的另一个特定目的是通过下述方法产生的病毒株，所述方法包括将 通过用递增浓度的至少一种硫酸化聚合物将对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传 代而将所述聚合物与所述病毒相接触，其中所述易感病毒的特征在于减少病毒板的方法以 及其中从所述减毒病毒所得的毒株具有不同于其所来源的野生型病毒株的稳定的表型和 基因型特征。所述减毒病毒株具有改变的病毒结构，并且对于与所述方法中所用的那些结 构类似的硫酸化多糖有抗性。此外，其IC5tl是野生型病毒IC5tl的约4倍。根据本发明，所述 减毒病毒株对抗病毒作用机制不同于已接触的硫酸化多糖的药物(例如溴夫定、肝素、阿 昔洛韦和膦甲酸)有抗性，其中所述抗性不是减毒的决定性因素。根据本发明，减少病毒板的方法包括下述过程在不存在或存在不同化合物浓度 的情况下，用50UFP/孔的病毒感染24孔板中产生的Vero细胞单层。一式两份测试每个稀 释度。在37摄氏度下吸附1小时后，除去接种物，通过用培养基(具有最终浓度为0.7%的 甲基纤维素的培养基)铺板进行涂覆。继续进行接种直至病毒板出现，然后在用结晶紫适 应和染色细胞后进行计数。此外，根据本发明，50%抑制浓度(IC5tl)指将病毒板数目减少约 50%所需的化合物浓度。此外，本文中所用的野生型病毒意指用作参考的病毒株，其来自于受感染的患者 并在细胞培养物中很少传代，保持合适的特性。通过本发明方法，可产生有包膜或无包膜的RNA和DNA病毒的减毒株。特别地，所 述方法特别可用于制备疱疹病毒的减毒病毒株。优选地，所述疱疹病毒是1型单纯疱疹病 毒或2型单纯疱疹病毒。优选地，所述硫酸化聚合物选自天然硫酸化聚合物以及合成硫酸化聚合物。特别 地，所述硫酸化聚合物是糖胺聚糖或者具有类似于糖胺聚糖结构的硫酸化聚合物。更优选 地，所述硫酸化聚合物选自卡拉胶(carragenanos)。此外，在合成硫酸化聚合物中，优选合成的萘硫酸化聚合物。在本发明一个特别的目的中，包括制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递 增的至少一种硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述 聚合物与所述病毒的接触，其中所述易感病毒通过减少病毒板的方法进行选择，其中由减 毒病毒获得的毒株具有不同于其所来源的野生型病毒株的稳定的表型和基因型特征。所述 方法包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚合物(优选硫酸化聚合物，更有选卡拉胶) 使对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代约15次或更多次而实现所述聚合物与所 述病毒的接触。根据本发明方法，第一次传代中所述至少一种硫酸化聚合物的浓度应低于 针对野生型状态下所述易感病毒的IC5(I。特别地，本发明方法还可包括以下步骤中的一个或多个1.确定待使用的化合物是否具有杀伤所研究病毒的活性并确定其50%病毒浓度 (CV50)。2.比较所述50%抗病毒和杀伤抑制浓度3.如果两个浓度类似(IC5tl和CV5tl)，则大大延长选择变体的时间，从比IC5tl低约 5至10倍的初始亚剂量化合物的连续传代开始，合理地将接下来的传代浓度相比于前一个
增加一倍至两倍。4.如果所述化合物不具有杀伤作用，则使用比其相应IC5tl低约两倍至四倍的初始 浓度，以避免过多降低病毒滴度并使病毒颗粒逐渐适应培养基。5.孵育细胞单层直至观察到70-90%的细胞致病表现。6.对每次传代进行滴定，进行传代扩增，至具有降低约2个log的初始病毒滴度的 传代。7.进行传代13-15之间的病毒克隆，以分析所选克隆对不同药物的抗性特征，优 选选择表现出某些表型变化的那些，例如板尺寸或合胞体形成。本发明方法显示了具有下述等优点1.连续传代可在不同细胞系单层(包括二倍体人细胞)中进行，以避免与细胞基 质有关的外来病毒污染。2.使用硫酸化聚合物作为选择减毒病毒突变体的试剂，其在自然界更加丰富，易 于收集和获得，稳定、便宜、无害，具有可变结构并且易于化学修饰，允许引入大量硫酸化基 团。3.可对不同类型的天然或合成硫酸化聚合物(例如PR02000)使用相同的方法。4.制备本发明突变株的方法不需要复杂的设备或者复杂或昂贵的方法。5.可用于本发明方法中的结构类似于GAG的许多硫酸化多糖大量分布于有机体 中，并由于来自细胞交换、感染或炎性过程的分子循环(例如肝素或硫酸乙酰肝素)保持恒 定的选择压力，由此控制病毒逆转回毒力形式的风险。6.所述硫酸化多糖不仅改变病毒结构，还改变表达毒力的其它基因组位点，例如 胸苷激酶基因。这增大了获得高稳定性减毒病毒株的可能，特别是在毒力不取决于单一基 因表达的病毒的情况下。7.允许制备由相同方法和试剂产生的混合血清型所形成的疫苗。包含根据本发明方法制得的减毒活病毒的具有治疗或预防活性的疫苗或药物组合物的配方可由本领域技术人员通过已知技术确定，并且可见于可获得的参考文献中。制备实施例使用SAMMA和PR02000通过连续传代诜择病毒变体对于在SAMMA(来自扁桃酸缩合的非硫酸化聚合物)和PR02000 (萘硫酸化聚合 物)存在下选择病毒变体而言，在2. 5微克/毫升SAMMAac5tlSAMMA 4. 2微克/毫升)和 0. 25 微克 / 毫升 PR02000 (IC5QPR02000 0. 2 微克 / 毫升)存在下用 HSV-2 (G)感染 CaSki 细胞(人宫颈癌细胞)，感染复数为0. IUFP/细胞。在所用化合物具有杀伤作用的情况下， 认为便于开始用亚剂量进行传代，以避免对病毒的主要抑制。在病毒吸附过程中(1小时， 37摄氏度)和感染后存在化合物。在感染后24至72小时期间观察到80-90%的细胞致病 作用(ACP)时，用多次冻融裂解细胞。为了除去细胞碎片，将细胞裂解物以IOOOrpm离心10 分钟，将上清保持在-70摄氏度。在SAMMA或PR02000存在下使用上清感染新鲜单层。当 在短时间内观察到表明高病毒滴度的大量细胞致病作用时，将每种化合物的浓度加倍。通 过针对SAMMA或PR02000的病毒板减少试验(或者在2_3次传代后)确定每种病毒传代的 滴度和IC5tl。到年末时，在6孔板中生长的Vero细胞单层中分别克隆了 PR02000和SAMMA存在 下的第13代和15代对应的病毒。用有限稀释的病毒感染细胞单层，用含有0.6%琼脂糖的 维持培养基(MM)涂覆。孵育2天后，用中性红对细胞染色，对克隆物划线。对于克隆扩增 来说，用每种所选克隆物感染Vero细胞；在37摄氏度下吸附1小时后，弃去接种物，用匪 涂覆，对其在37摄氏度下孵育24-48小时，直至观察到ACP产生。滴定克隆物，随后显示对 抗病毒化合物的体外敏感性。同时，在没有SAMMA或PR02000的情况下在CaSki细胞中制备连续传代的 HSV-2(G)，作为对照。以相同方式，如前所述(Carlucci MJ等，2002)，获得具有IC3的变体。通过在没有化合物的情况下在Vero细胞中进行5_10次传代来确认病毒株的稳定性。已经研究的lC3-synl3-8和lC3-synl4-l变体显示出根据所测试的细胞类型导致 的细胞致病作用的差异，产生类似于野生型病毒株或合胞体的循环(表3)。表3 合胞体表型和细胞类型 Vero 非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾CV-I 来源于绿猴肾。HEp-2 人喉上皮癌PH 人阴茎包皮。
CasKi 人宫颈癌。Syn 合胞体。取决于接种途径，也显示显著的体内致病性变化(Carlucci MJ等，2002)。因此，通 过阴道内途径，lC3-synl3-8和lC3-synl4-l分别产生60%和0%的死亡率，与此相比对照 (HSV-1 病毒株F)为 100%。西奈山医学院(Mount Sinai School of Medicine,New York, NY)使用相同方法但使用2型HSV病毒株G以及PR02000硫酸化聚合物分离到相似特性的 病毒株(PR02000-synl3-9 和 PR02000-synl3_l) (Carlucci 等，未发表结果)。这表明重 复使用此类化合物可改变病毒的致病性行为。此外，通过相同的方法，使用其它非硫酸化化合物获得了变体SAMMA。如此产生的 病毒株不是合胞体，分析SAMMA-15-3和SAMMA-15-7显示出对相同药物的抗性，其对肝素和 卡拉胶IC3的抗性是相对于对照病毒的2. 6至6. 7倍。SAMMA-15-3和SAMMA-15-7在体内显示对野生型毒株HSV-2(G)的致病性和死亡率 的罕见差异。但是，使用PR02000获得的这两种病毒变体和使用IC3获得的那些显示出合 胞体特性，相对于对照，PR02000-13-9病毒株的毒力和死亡率降低80% (如果选择压力再 继续2-3次传代将获得存活)，而lC3-syn-14-l降低100%。表4 病毒变体对阴离子聚合物的敏感性 IC50a(50%抑制浓度)是将板数目减少50%所需的药物浓度(以μ g/ml计)。RRb (相对抗性)是每个病毒变体的IC50与HSV_1 (F)或HSV_2 (G)对照病毒株之 间的关系。从表4和表5中可见，从不具有syn特征、对所有被测化合物敏感并产生93-100% 受感染动物死亡率的HSV-I (F)和HSV-2(G)野生株获得具有下列特征的变体a.具有lC3-syn-13_8合胞体表型，对1C3、肝素和PR02000敏感的致病性变体。b.具有lC3-syn-14-l合胞体表型，对1C3、肝素有抗性并且对PR02000敏感的非 致病性变体。c.具有Pro2000-syn-13-9合胞体表型，对1C3、肝素有抗性并且对PR02000敏感 的低致病性变体。d.非合胞体致病性变体SAMMA-15-3，其对1C3、肝素、SAMMA有抗性，对PR02K敏感。通过使用不同聚合物的选择压力获得的病毒变体将具有改变(很可能为其包膜) 的病毒结构，其涉及稳定的表型和基因型变化，其会改变对产生其的药物以及其它相关化 合物的敏感性以及其致病性。与病毒血清型(HSV-1或HSV-2)以及用于产生所述变体的硫酸化聚合物(1C3和 PR02000)无关，可获得非致病性突变体，例如在lC3-syn-14-l和PR02000-syn-13_9的情形 下。值得探讨的是，这些表述是否可按照相同方法外推到其它包膜病毒，用硫酸化聚 合物选择和/或产生的无症状变体是否比缺少SAMMA硫酸化的那些更敏感。另一方面，根据上述不同变体，我们可推断，合胞体表型不与体内观察到的致病性 相关联，如lC3-syn-13-8所示。另外，可以说对初始药物的抗性并不是确定减毒突变体的 主要决定因素，如PR02000-syn-13-9所示。表5 在阴道感染模型中评价体内病毒毒力 所用病毒株(HSV-l(F)、HSV_2(G))以及其各个变体的毒力表现出通过阴道内接 种感染的不同迹象和症状(表3和表4)。因此，HSV-2(G)的致死性分类为1)非显性感染， 2)阴道发红，3)中等红斑或阴道以及周围组织炎症，4)严重红斑或阴道周围炎症，5)溃疡 或严重炎症、红斑或脱发，6)神经病。对于HSV-I (F) 1)非显性感染，2)阴道发红，3)结肠 性便秘和中等会阴炎症，4)胃胀以及严重尿道括约肌和肛门阻塞，5)伴有腹部坏死的神经 病。根据操作方法和国家及国际的动物保护法律法规(试验动物管理和使用规定， Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Buenos Aires，Argentina，由 CD 140/00y禾口 Helth Department and Human Service, Public HealthService，NIH，2002 批准。保险 识别号#A5523-01)处死两种病毒所述分类均显示第4水平的动物。表6 在变体研究中所用聚合物的比较表 *死亡率指通过阴道内的感染此外，结果公开了在小鼠模型中使用HSV-I(F)病毒株和其lC3-syn-14-l病毒变 体的阴道内感染对促炎细胞因子IFN以及白细胞介素(例如IL-6)和TNF-α产生最小应答 或没有应答(表7)。无症状地感染具有100%的存活，尽管在阴道洗出物中回收到与对照相 同量的感染性病毒。而对于HSV-2(G)和其PR02000-synl3-9病毒变体而言，改变的细胞因 子水平与HSV-I不同，例如IL-I β和IFN- γ，与动物症状差异有关。在两种情况下，HSV-I 和HSV-2的病毒变体均在硫酸化聚合物PR02000和1C3产生选择压力后显示出毒力的显著 降低。在任何病毒感染中，免疫系统应答都非常重要，因为它诱导产生抗病毒因子(例如干 扰素)，其阻止病毒复制并由此阻止病毒传播。炎性细胞因子也起到重要作用(例如IL-6 和TNF-α )，其募集并活化效应细胞，它们经常对疾病中表现出的症状(发烧、肌肉痛、与局 部炎症有关的疼痛)负责，尽管有时可使情况更糟。随着细菌性败血症的发生，通过细胞 因子的炎性应答在有些情况下可导致致病和死亡，例如在疱疹性脑炎的情况下，其为TLR-2 活化导致脑炎症和死亡的后果(Kurt-Jones E等，2004)。表7 小鼠阴道洗出物中细胞因子和趋化因子的测定 在感染后第1天产生阴道洗出物。*先天性免疫的介导剂和调节剂·获得性免疫的街道及和调节剂。注为避免阴道操作数据的变化，在感染后(p. i.)第1和6天检测细胞因子。感 染后第6天的对照没有观察到重大变化。在宿主中感染性有机体或外源物质的侵入产生复杂但协调的一系列防御机制，其 包括炎症以及先天性和获得性免疫应答的活化。来自血管内皮的细胞对于免疫和炎症过 程来说是必不可少的。为应答多种刺激，它们在细胞骨架结构、细胞粘附分子的表达和活 性、血栓形成性质和凝血性质以及胞浆蛋白的透过性方面发生重大变化(Bevilacqua MP, 1993)。白细胞与内皮细胞的粘附特别重要，因为它们最终决定到达炎症部位的免疫系统细 胞的数量、表型和功能。内皮细胞-白细胞相互作用调控是由复杂的机制介导的，其包括细 胞因子、粘附表面和共刺激分子(Kotowicz K等，2000)。对阿昔洛韦(ACV)(例如溴呋啶(BVDU))有抗性(IC50比对照的IC50大至少4倍) 的病毒变体显示胸苷激酶(TK)中的突变，而显示出对药物(例如膦甲酸(PFA)(焦磷酸盐 类似物)、PMEA和HPMPC (无环核苷膦酸酯类似物)有抗性的病毒变体则表明在病毒DNA聚 合酶的基因中有突变。因此，用嘧啶和嘌呤类似物(例如阿昔洛韦(ACV)和溴呋啶(BVDU))对1C3 (17,20 和21)的较大选择压力对克隆变体传代的初步试验显示了病毒TK水平的变化(如表8所 示，该特征目前为止还未公开于现有技术文献中)。TK基因不是体外病毒复制所必需的，尽 管其在体内涉及毒力、致病性和由于潜伏的再活化(Andrei G等，2005)。尽管硫酸化多糖通 过阻断病毒包膜糖蛋白起作用，但一些研究表明硫酸化多糖在随后的阶段中也对病毒周期 中的细胞粘附起作用(Gonzalez M 等，1987 ;Callahan L 等，1991 ;De Vreesc K 等，1996)。 因此，病毒所接受的选择压力可在TK基因中具有选择的突变，另外重叠基因产生具有更小 体内致病作用的病毒株(Jacobson J等，1993)。因为TK基因重叠于5'端UL24基因(基因座syn，与膜相关的蛋白质)，所以TK 中的某些突变也会影响到该基因以及另一侧编码gH糖蛋白的UL22 (Jacobson J等，1989)。 所以，我们的病毒变体具有syn表型(合胞体)，它们会显示病毒糖蛋白的修饰，因此可与表 型和基因型相关。表8:对病毒变体的敏感性 aIC50(y g/ml).b相对抗性每个克隆的IC50与HSV-I (F)的IC50之间的关系。很明显，由于1C3 syn 14_1很少有对ACV和BVDU的抗性，因此其不显示TK中大的 改变，但是即使如此，其也未显示出与完整粘膜中模式病毒株相关的致病作用。因此认为， 相比于1C3 syn 14_1，对不同作用机制之药物(例如肝素和BVDU或ACV)具有更强交叉抗 性的变体(如1C3 syn 17-2，1C3 syn 20-1)可通过其它接种途径进一步减毒，因此在此类 型变体中存在超过一种的改变的毒力表达位点。中和抗体为了确定对HSV-I (F)或lC3-syn-14-l获得性免疫应答中的特定差异，用两种病 毒株免疫Balb/c小鼠。如表9中所示，通过使用直接铺板法，来自用所研究病毒株免疫的 动物的血清呈递以相同方式中和HSV-I (F)和lC3-syn-14-l对照病毒株的抗体。此外，用 合胞体变体或野生型病毒株以交叉方式攻击受免疫的动物，不显示疾病症状。表9 用HSV-I (F)和1C3 syn 14-1免疫的中和抗体的效价 所获得的结果表明，硫酸化多糖是病毒对药物抗性的缓慢且较差的诱导物 (Witvrouw和De Clercq, 1997)，这是由于制备所述变体的其大规模过程产生和/或选择稳 定的表型和基因型修饰。本发明人提出，使用硫酸化聚合物(例如卡拉胶)作为减毒病毒突变株的选择剂 和/或产生剂，在此情况下显示已获得的对药物有抗性的HSV突变体具有多于一种的经修 饰毒力决定簇，例如病毒TK基因以及负责合胞体表型和潜伏的其它基因。因为TK基因侧 翼是UL22基因(gH)，并重叠UL24基因(含有基因座syn，编码与膜相关的蛋白质)，显然 TK突变也能够对其产生影响(Jacobson J等，1993)。此外，gH与gL是必需的病毒蛋白质， 其构成复合体，参与病毒进入、离开细胞以及在细胞-细胞间的传播。此类型突变体使得可 确定其潜在的治疗或预防用途，例如具有这些特征的病毒将能够在致病作用减少的情况下 复制(Coen DM等，1989)并引起没有再活化的潜伏(Efstathiou S等，1989)。因此，可提出 促进病毒演化过程的方法，减少其毒力，并由此减少当其永存于宿主中时的致病性。另一方面，在本发明人的实验过程中，在通过完整鼻粘膜感染的动物中，尽管早产 但出生正常并且可在子宫和阴道中检测到减毒病毒株，而没有检测到这些可对生育有害， 可说明含有本发明方法的减毒病毒的疫苗可用于怀孕动物和孕妇的可能性很高。此外显 示，如果使用浓度递增的硫酸化聚合物在所述硫酸化聚合物和对所述聚合物的抑制敏感的 病毒间进行超过约20次传代，则开始时第一次传代的硫酸化聚合物浓度小于针对所述病 毒野生状态下的IC5tl，含有本发明减毒病毒株的疫苗可用于怀孕动物和孕妇的可能性很高。参考文献1. -Andrei G, Snoeck R, De Clercq Ε.1995. Antimicrob. Agents Chemother. 39,
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权利要求
一种制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述方法包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代至少约15次而实现所述聚合物与所述病毒的接触，其中第一次传代中所述至少一种硫酸化聚合物的浓度小于所述聚合物针对野生状态下所述易感病毒的IC50，通过减少病毒板的方法选择所述易感病毒，所述减毒病毒株具有不同于产生其的野生型病毒株的稳定的表型和基因型特征。
2.根据权利要求1的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述至少一种硫酸化聚合 物选自天然硫酸化聚合物和合成硫酸化聚合物。
3.根据权利要求1的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述至少一种硫酸化聚合 物是硫酸化多糖。
4.根据前述权利要求的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述至少一种硫酸化多 糖是卡拉胶。
5.根据权利要求2的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述至少一种合成硫酸化 聚合物是合成的萘硫酸化聚合物。
6.根据权利要求1的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述至少一种硫酸化聚合 物是糖胺聚糖或具有类似于糖胺聚糖结构的硫酸化聚合物。
7.根据权利要求1的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述易感病毒是疱疹病毒。
8.根据前述权利要求的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述疱疹病毒是1型单 纯疱疹病毒。
9.根据权利要求5的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述疱疹病毒是2型单纯疱疫病毒。
10.根据权利要求1的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，使一种硫酸化聚合物与对 所述聚合物的抑制敏感的病毒相接触。
11.根据前述权利要求的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述硫酸化聚合物是硫酸化多糖。
12.根据前述权利要求的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，所述硫酸化多糖是卡拉胶。
13.根据权利要求10的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，如此获得的减毒病毒株 具有改变的病毒结构。
14.根据权利要求10的制备减毒病毒株的方法，其特征在于，如此获得的减毒病毒株 具有改变的包膜。
15.通过权利要求1的方法获得的减毒病毒，其特征在于，所述病毒具有改变的病毒结 构，其对与所述方法中所用硫酸化多糖的结构类似的硫酸化多糖有抗性，其IC5tl是野生型 病毒IC5tl的约4倍。
16.通过权利要求1的方法获得的减毒病毒株的用途，其特征在于用于制备疫苗。
17.通过权利要求1的方法获得的减毒病毒株的用途，其特征在于用于制备具有治疗 或预防活性的药物组合物。
18.基于减毒活病毒的疫苗，其特征在于包含根据权利要求1至14中任一项方法获得 的减毒病毒。
19.基于减毒活病毒的疫苗，其特征在于包含根据权利要求1至14中任一项方法获得的一种或多种类型的减毒病毒。
全文摘要
本发明涉及制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述聚合物与所述病毒的接触，其中所述易感病毒的特征在于减少病毒板的方法，其中由所述减毒病毒得到的病毒株具有不同于产生其的野生型病毒株株的稳定的表型和基因型特征。所述方法包括通过用浓度递增的所述硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代约15次或更多次而实现所述硫酸化聚合物与所述病毒的接触。根据本发明方法，第一次传代中所述至少一种硫酸化聚合物的浓度应小于所述聚合物针对野生状态下易感病毒的IC50。本发明还涉及通过上述方法获得的减毒病毒株在制备疫苗和药物组合物中的用途。
文档编号C12N7/08GK101903516SQ200880122154
公开日2010年12月1日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年11月20日
发明者卡洛斯·阿尔贝托·皮若尔, 埃尔萨·比阿特丽斯·达蒙特, 玛丽娜·钱恰, 阿尔贝托·索尔·塞雷索, 马里亚·何塞菲娜·卡卢奇 申请人:国家科学和技术研究委员会(Conicet);Inis生物技术有限责任公司