专利名称：通过酶促水解及随后的化学/酶促酯化生产生物柴油的制作方法
通过酶促水解及随后的化学/酶促酯化生产生物柴油
背景技术：
生物柴油(长链脂肪酸的烷基酯)是通过天然甘油三酯(如植物油，动物脂)与通 常为甲醇的低分子量醇进行酯交换而合成的环保燃料。生物柴油在工业上是通过使用强碱 作为催化剂的化学催化来生产的(参见Connemann J and Krallmann A. ,Process for the continuous production of lower alkyl esters of higher fatty acid (连续生产高级 脂肪酸的低级烷基酯的方法).，美国专利5，354，878号；Hanna MA, Transesterification process for production of Biodiesel (生产生物柴油的酯交换方法)，美国专利公开 2003/0032826 Al ；Lee JH, One-stage process for feed and Biodiesel and Lubricant oil(用于饲料和生物柴油及润滑油的一步法)，美国专利公开2004/002 Al)。然而， 强碱方法有一些缺点，例如难以回收甘油，需要从产物除去碱催化剂以及处理碱性废水。 此外，原料必须符合严格的规格(参见Lotero E. et al.，Ind. Eng. Chem. Res. Rev,44 5353-5363(2005))。例如，原料必须基本上无水并且FFA含量不能超过0. 5wt %。杂质的 存在会使得碱方法产生皂，从而增加粘度。高粘度会导致在下游分离中的困难，从而严重妨 碍燃料级生物柴油的生产。为了满足上述的原料规格要求，需要使用高度精炼的植物油，其 价格可以占到生物柴油最终成本的60-75% (参见Lotero E. et al.，Ind. Eng. Chem. Res. Rev,44 :5353-5363(2005)) ο此外，精炼过程(250°C^P l_3mmHg)破坏了抗氧化剂(维生素 E和胡萝卜素)，从而降低了生物柴油的氧化稳定性。碱方法的上述缺点使得研究者寻求可以降低难度并减少成本的催化和加工的替 代选择。基于酸催化反应的方法具有实现这一目的的潜力，因为酸催化剂对FFA较不敏感， 并且可以同时催化酯化和酯交换。然而，液体酸催化的酯交换方法在商业应用上并不像其 对应的碱催化反应一样普及。液体酸催化反应比液体碱催化反应慢很多的这一事实是主要 原因之一(参见 Srivastava A and Prasad R.，Renewable Sustainable Energy Rev.，4 111-133(2000))。虽然反应速率可以通过提高温度来增加，但是在高温和高压下可能发生 诸如醇醚化的副反应。此外，液体催化剂导致严重的污染问题，这使得必须进行良好的分离 和产品纯化流程。为了减少分离和纯化的问题，已报道了固体酸催化剂，但是该方法仍然需 要高反应温度和压力。例如，活化的蒙脱石KSF在220°C和52巴下表现出的转化率为100% (参见 Lotero E. et al. ,Ind. Eng. Chem. Res. Rev, 44 :5353-5363 (2005))。研究了使用大孔 树脂15 (Amberlyst 15)的酯化和酯交换反应。虽然大孔树脂对于羧酸的酯化具有很高的 活性，但是其对于油或脂肪的酯交换的活性非常低，而且需要温和的反应条件以避免催化 剂的降解。在相对较低的温度(60°C )下，当反应在大气压下进行并且甲醇和油的起始摩尔 比为6 1时，葵花籽油的转化率据报道仅为0.7% (参见Vicente G et al. , Ind. Crops Products,8 :29-35(1998))。利用脂酶的酶促酯交换对于生物柴油燃料生产更有吸引力，因为可以容易地回收 作为副产物而产生的甘油，并且易于完成脂肪酸甲酯的纯化。已证实利用酶(如固定的南 极假丝酵母(Candida Antarctica)脂酶)来进行植物油的甲醇分解可以用于生产生物柴 油(参见美国专禾丨J 5，713，965 号；Shimada, Y. et al. J. Am. Oil Chem. Soc. 1999，76，789 ；Nelson, L. A. et al.J. Am. Oil Chem. Soc. 1996，73，1191)。然而，低级醇(如甲醇)容易使 酶中毒，从而导致酶活性降低；或者副产物吸附在酶表面而阻断底物到达酶的活性位点，从 而抑制酶活性。因为前述原因，需要开发有效的且经济可行的方法，使用诸如含有大量水和FFA 的粗棕榈油(CPO)的低成本原料来生产生物柴油。该方法应当提供使得催化剂(化学催化 剂或酶)可再循环，并对水、FFA和甲醇较不敏感的系统。本发明满足了这些和其他需求。发明概述本发明提供了通过酶催化水解然后酯化来从油或脂肪生产生物柴油的尤其高效 的方法。在某些实施方案中，该方法需要温和的反应条件，并且使用低成本的原料，例如含 有大量水和游离脂肪酸的粗棕榈油(“CP0”)。本文所述的方法减少了与商业上所用的碱 催化方法相关的问题。因此，在一个实施方案中，本发明提供了生产生物柴油的方法，该方法包括将甘油三酯酶促水解以形成脂肪酸和甘油；以及用所述脂肪酸将低级醇酯化从而形成生物柴油。在某些方面，所述酯化步骤是化学催化或酶促催化的。例如，在一个实施方案中， 所述脂肪酸的化学酯化包括将脂肪酸与醇和酸催化剂混合；以及将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。在其他方面，所述脂肪酸的酶促酯化包括将脂肪酸与醇和脂酶混合；以及将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。与现有技术相比，本发明的方法使得产量更高、催化剂回收更容易并且产品分离 更简单。通过下文的发明详述和附图，上述和其它目的、方面以及实施方案会更显而易见。
图1示出本发明的实施方案。图2示出本发明的实施方案。图3A-B示出脱胶CPO水解前㈧和水解后⑶样品的UV光谱。图4A-B示出棕榈脂肪酸酯化前㈧和酯化后⑶样品的UV光谱。图5示出在缓冲液中不同脂酶浓度下的CPO水解。反应条件CP02g，脂酶溶液 2ml，振荡速度250rpm，温度40 °C。图6示出脱胶CPO在不同温度下的水解反应。反应条件CP0 2g，脂酶溶液(lmg/ ml) 2ml，振荡速度 250rpm。图7示出脱胶CPO在不同缓冲液与油比例(ν/ν)下的水解反应。反应条件CP0 2g，脂酶ang，振荡速度250rpm，温度40°C。图8示出异辛烷中大孔树脂15催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化。反应条件 IOml原料(异辛烷中的FA，0. 32M)，Ig大孔树脂15，温度60°C，400%化学计量的甲醇或乙 醇，250rpm振荡。图9示出Novozym 435催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化。反应条件IOml原料(异辛烷中的 FFA，0. 32M))，0. 04g Novozym 435[15 ？]，温度 40°C，120%化学计量的甲醇 或乙醇，250rpm振荡。图10示出Novozym 435催化与大孔树脂15催化的棕榈FFA甲基酯化的比较。图11示出本发明的一个实施方案中大孔树脂15(A)和NOVOZym435 (B)重复使用 的结果。图12示出本发明的实施方案中脱胶CPO的酶促水解以及大孔树脂15或Novozym 435催化的酯化的结果，这提供了良好的产率(98-99% )。发明详述I.定义本文所用的术语“低级烷基”包括C1至C6的饱和直链、支链或环化烃，并且特别地 包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、 异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2_ 二甲基丁基和2，3_ 二甲基丁基。本文所用的术语“醇”包括含有一个或多个羟基的烃类化合物，并且包括例如以下 的醇甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环戊醇、异戊醇、新戊醇、己醇、 异己醇、环己醇、3-甲基戊醇、2，2_ 二甲基丁醇、2，3_ 二甲基丁醇，以及它们的异构体。本文所用的术语“油(oil) ”或“油(oils) ”包括植物油或脂肪、动物油或脂肪、海 产油或脂肪、微生物来源的油或脂肪、废弃油或润滑脂、提炼产品(rendered product)或它 们的任何混合物。本文所用的术语“提炼产品”包括通常通过加热处理来除去水、固体和其他杂质的脂肪。本文所用的术语“生物柴油”包括用作运输和发电燃料或添加剂的脂肪酸烷基酯。本文所用的术语“原料”包括粗棕榈油；或者任何油或脂肪，其来源于任何植物油 或脂肪、动物油或脂肪、海产油或脂肪、微生物来源的油和人工或合成的甘油酯；以及来自 上述材料的加工过程的废弃物、废水和残留物。本文所用的术语“植物油”包括来自诸如农作物和林产品的植物来源的脂肪、油或 脂类，以及来自诸如皂脚的上述材料加工过程的废弃物、废水和残留物。本文所用的术语“动物油”包括来自动物来源的脂肪、油或脂类，以及来自上述材 料加工过程的废弃物、废水和残留物。本文所用的术语“海产油”包括来自水流中海产来源的脂肪、油或脂类，以及来自 上述材料加工过程的废弃物、废水和残留物。本发明使用的甘油酯包括化学式为(R)CH(R)CH(R’ ) (R”)CH(R”)的分子，其中R、 R’和R”选自-H、-OH或分子式-0(C = 0)R”’所示的脂肪酸基团，其中R”’是饱和、不饱 和或多不饱和，直链或支链，具有或无取代基的碳链，其中甘油酯具有至少一个-0(C = 0) R”’。给定的甘油酯上的R、R’、R”可以相同或不同。R、R’和R”可以从本文所述的任何游 离脂肪酸获得。本发明的甘油酯包括具有三个脂肪酸基团的甘油三酯，具有两个脂肪酸基 团的甘油二酯和具有一个脂肪酸基团的甘油单酯。用作本发明的起始原料的甘油酯包括天 然、加工、精炼以及人工或合成的脂肪和油。术语“脂肪酸基团”或“酸基团”包括分子式_0(C = 0)R”’所示的化学基团。这 些“脂肪酸基团”或“酸基团”通过与羰基碳单独结合的氧原子的共价键来与甘油酯的其余部分连接。相反地，术语“脂肪酸”或“游离脂肪酸”均指HO(C = 0)R”’，并且未与甘油酯共 价结合。如本文所述，在“脂肪酸基团”、“酸基团”、“游离脂肪酸”和“脂肪酸”中，R”’是饱 和、不饱和或多不饱和，直链或支链，具有或无取代基的碳链。本领域技术人员应当认识到， 本文所述的“游离脂肪酸”或“脂肪酸”(即H0(C = 0)R”’ )的R”’和与甘油酯相连接的或 本发明中用作底物的其他酯的“脂肪酸基团”或“酸基团”中的R”’作用相同。即本发明的 底物可以包括脂肪、油或其他具有由本文所述的游离脂肪酸或脂肪酸所形成的脂肪酸基团 的酯。II.实施方案本发明提供了利用粗或精制植物油或动物脂生产生物燃料(例如生物柴油)的方 法。在一方面，本发明涉及以含有甘油三酯的动物脂、植物油或它们的混合物为原料来生产 脂肪酸酯。该方法包括通过酶促水解使得甘油三酯原料产生游离脂肪酸。然后，引入醇并 用游离脂肪酸将所述醇酯化，从而形成含有脂肪酸酯的产物。本发明提供了通过甘油三酯原料水解以及随后的醇酯化来经济地生产脂肪酸酯 的方法。本文的方法可以通过产量高于现有技术方法的方式来连续实施。所产生的脂肪酸 酯有益于生产润滑剂和诸如生物柴油的燃料。图1示出生产生物柴油的方法100的一个实施方案。在一方面，将诸如植物油110 的含有甘油三酯的原料酶促水解112产生游离脂肪酸115、甘油和水120。甘油三酯可以来 源于植物油、动物脂、牛脂、润滑脂或回收提炼的油或脂肪。然后，利用催化剂(例如酸或酶 催化剂)，可以将脂肪酸115用于醇的酯化。通常，所述脂肪酸为C12至Q的脂肪酸。酯化 反应122产生生物柴油130和水132。可以任选地精制来自粗植物油水解的甘油和水产物， 其中将水蒸馏以生产精制的甘油161，或者可以将甘油用于例如其他化学品141的发酵反 应。现在转向图2，其示出了本发明方法更详细的工艺流程200，其中在含水212 (例如 再循环的)和有机溶剂215(例如再循环的)的反应器225中，将含有甘油三酯的粗棕榈油 (CPO)或者植物油或脂肪202利用例如酶催化剂210(例如脂酶)进行水解。将含有游离脂 肪酸、甘油和水的产物从反应器225转移到分离容器230，其中游离脂肪酸233可被转移到 含有诸如脂酶或酸的催化剂的第二反应器248或250(例如一个在使用，而另一个在再生) 中。可以将甘油、水和脂酶的混合物235转移至中空纤维膜236，并且使脂酶211循环回到 反应器225。可以将来自膜236的甘油和水237用于发酵生成其他化学品M0。在反应器 248或250中，将游离脂肪酸233用于酯化诸如低级醇(例如C1-C6醇，如甲醇或乙醇)的 醇。低级醇M2的酯化可以利用脂酶(例如NOVOZym435)或酸催化剂(例如大孔树脂15) 催化。反应容器248或250中的催化剂可以利用诸如叔丁醇的极性溶剂进行再生。在反应 结束后，来自反应混合物的酯可以通过蒸馏271分离，其中将醇238、溶剂258和水262蒸馏 和再循环。可以使用最终的生物柴油产物260，或将其与石油柴油混合。合适的反应器包括 但不局限于固定床反应器、流化床反应器和搅拌槽式反应器。在某些情况下，将原料和酶(例如脂酶)与水及任选的有机溶剂一起装入反应器。 有利地，包含甘油三酯的原料可以含有水。将原料(例如脱胶CP0)装入反应器，任选地预 热至约20-60°C，优选约25°C至约50°C (例如40°C )，并加入水解酶(例如脂酶)。脂酶可 以来源于植物、细菌、真菌和更高等的真核生物。脂酶可以来源于细胞外或细胞内，或者为全细胞的形式。适合用于水解反应或酯化反应的脂酶包括但不局限于来源于皱褶假丝酵母 (Candida rugusa) >Pttjix^if^fiJ (Candida cylindracea)(Rhizopus oryzae)
质色杆菌(Chromobacterium viscosum)、洋葱假单胞菌(Pseuodomonus cepacia)、猪胰腺 (Hog pancrease)、荧光假单胞菌(Pseudomonus fluorescent)、南极假丝酵母 B (Candida antarctica B)和Novozym 435 (固定的南极假丝酵母脂酶B)的脂酶。可以将脂酶固定在 丙烯酸树脂或任何固体支持物上。本领域技术人员能够知道其他适用于本发明的脂酶。任 选地，将脂酶通过使用诸如叔丁醇的极性溶剂洗涤来再生。其他合适的极性溶剂包括但不 局限于C1-C6烷醇和其他空间位阻烷醇。酶的固定可以通过任何已知方法进行，例如包括无机载体共价键方法和有机载体 共价键方法的载体结合、交联、捕获和吸附(参见美国专利4，798，793号、5，166，064号、 5，219，733号、5，292，649号和5，773，266号)。考虑到操作，优选载体结合方法。载体结合 包括通过化学吸附或物理吸附将酶吸附到任何固体支持物(例如离子交换树脂)。在本发 明中，优选利用多孔载体的物理吸附。描述了一些用于酶固定的有用载体(参见美国专利4，940，845号和5，219，733 号)。有用的载体优选为微孔的，并具有疏水的多孔表面。通常，孔的平均半径为约10人至 约1,000 A,孔隙率为约20体积％至约80体积％，更优选为约40体积％至约60体积％。 孔为载体提供了增加的每载体颗粒的酶结合面积。优选的无机载体的实例包括但不局限于 多孔玻璃，多孔陶瓷，寅式盐(celite)，诸如二氧化钛、不锈钢或氧化铝的多孔金属颗粒，多 孔硅胶，分子筛，活性炭，粘土，高岭石，珍珠岩，玻璃纤维，硅藻土，膨润土，羟基磷灰石，磷 酸钙凝胶，无机载体的烷基胺衍生物以及它们的组合。优选的有机载体的实例包括但不局 限于微孔特氟隆、脂肪族烯烃聚合物(例如聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯的均聚物或共聚物或者 它们的混合物或者预处理的无机支持物)尼龙、聚酰胺、聚碳酸酯、硝基纤维素、乙酸纤维 素以及它们的组合。其他合适的有机载体包括但不局限于诸如琼脂糖凝胶的亲水多糖，其 具有烷基、苯基、三苯甲基或其他类似的疏水基团以提供疏水孔表面。微孔吸附树脂包括但 不局限于那些由苯乙烯或烷基胺聚合物制成的微孔吸附树脂；螯合树脂；离子交换树脂， 例如具有叔胺作为交换基团的弱碱性阴离子交换树脂；基本上由聚苯乙烯链交联二乙烯基 苯组成的微孔吸附树脂；以及亲水纤维素树脂，例如通过掩盖纤维素载体的亲水基团而制 备的亲水纤维素树脂。酶的固定可以通过将酶固定在合适的载体上来进行。许多无机和有机载体可以用 于固定酶。载体的实例包括但不局限于寅式盐、离子交换树脂、陶瓷等。在某些实施方案中 使用离子交换树脂。离子交换树脂的材料、性质和离子交换基团可以根据要吸附的酶的吸 附力和具有的活性水平来选择。在其他实施方案中使用阴离子交换树脂。阴离子交换树脂 的实例包括但不局限于基于酚甲醛的阴离子交换树脂、基于聚苯乙烯的阴离子交换树脂、 基于丙烯酰胺的阴离子交换树脂和基于二乙烯基苯的阴离子交换树脂。本领域技术人员应 当认识到，其他合适的载体可以用于固定本发明所用的酶。固定的温度依据酶的属性来确定。固定需要在酶活性未丧失的温度下进行。固定 可以在约0°C至约60°C下进行，优选在约5°C至约40°C下进行。对于酶与固定载体的比例，对于每重量份固定载体而言，优选使用0. 05至10重量 份、尤其是0.1至5重量份的酶。
酶促活性通常会受到诸如温度、光线和湿度的因素的影响。光线可以通过使用本 领域已知的各种光线遮挡或过滤的方法来遮挡。湿度，包括周围大气中的水分，可以通过在 封闭系统中操作工艺来控制。封闭系统可以处于正的惰性大气压力下以排除水分。或者， 可以在底物、纯化床或柱、或者脂酶填充柱上面放置氮气床。也可以使用其他诸如氦或氩的 惰性气体。这些技术具有使得诸如氧的大气中的氧化性化合物远离底物、产物或酶的额外 好处。在某些情况下，脂酶被固定在例如多孔载体或粉末上。酶促水解反应优选在约为 20°C至50°C的温度下孵育。在一方面，酶促水解反应孵育时间为约0. 5小时至约M小时， 以实现由甘油三酯向游离脂肪酸的转化。酶促水解反应优选在水的存在下进行。在某些方 面，酶促水解反应在缓冲溶液中进行。在一方面，水与甘油三酯的比例为约1 10(v/v)至 约20 1 (ν/ν) 0脂酶浓度可为约0. 125mg/ml至约ang/ml。在某些方面，酶促水解反应还 含有有机溶剂，如C5-C12烷或空间位阻烷醇。在优选实施方案中，加入酶(例如lmg/ml)以起始反应，将反应混合物振荡和混合 2小时至约10小时，优选约2至6小时(例如3小时)。在某些情况下，水解反应速率随着 脂酶浓度的提高而成比例地增加。虽然水解反应的温度和压力并不特别重要，但是可以调整这些参数以增加反应速 率。在某些情况下，温度可以影响水解速率。例如，甘油三酯的水解在约20°C至约60°C下 进行，优选在约30°C至约50°C下进行，更优选在约35°C至约45°C下进行。在一个优选实施 方案中，反应在45 °C下进行。此外，在某些方面，缓冲液浓度可以影响水解速率。在某些优选方面，缓冲液浓度 与甘油三酯的比例为约0.5(v/v)至约2.0v/v(0.5 2)，优选的缓冲液浓度与甘油三酯的 比例为约1 l(v/v)。合适的缓冲液包括但不局限于磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等。反应结束后，加入有机溶剂(例如异辛烷或己烷)以将产生的脂肪酸(FA)与甘油 和水分离。然后可以任选地将混合物离心，上层相可以直接用作酯化反应的原料。在某些 方面，然后将脂肪酸原料和催化剂(例如酸或酶)与醇混合以开始酯化反应。虽然酯化反应的温度和压力并不特别重要，但是可以调整这些参数以提高反应速 率。在化学催化的情况下，任选地将FFA原料预热到约40°C至约80°C，优选约50°C至约 700C (例如60°C )。在酶催化的情况下，任选地将FFA原料预热到约20°C至约60°C，优选 约25°C至约50°C (例如40°C)。反应通过加入低级醇来开始。反应结束后，移除催化剂。适用于酯化反应中的醇包括但不局限于具有一个至八个碳原子的一元脂族伯醇 和仲醇。酯化过程中使用的优选醇有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇，其中甲醇和乙醇是最优 选的。例如，尤其优选的醇为甲醇、乙醇和它们的组合。合适的酸催化剂包括无机酸催化剂(例如矿物酸，如HCl W2SO4等)或有机酸催化 剂(例如苯甲酸)。酸催化剂可以为液体或固体。酸可以采取分子筛的形式。在一种情况 下，酸催化剂为酸性苯乙烯-二乙烯基苯磺化离子交换树脂。通常，酯化反应混合物含有诸 如C5-C12烷或空间位阻烷醇的有机溶剂。在一个实施方案中，孵育温度为约20°C至约90°C。 在某些情况下，孵育时间为约0. 2小时至约M小时。此外，固体酸催化剂与脂肪酸的比例 通常为约1 10至约10 l(w/w)。任选地将酸催化剂通过用诸如甲醇的极性溶剂进行洗 涤而再生。其他合适的极性溶剂包括C1-C6烷醇或空间位阻烷醇。
在某些情况下，酯化过程中醇与游离脂肪酸的摩尔比为约6 Kmol mol)至约 1 1，更优选约4 1至约3 1，或约2 1，或约1.2 1或约1 1。对于酸催化，醇 与甘油三酯的摩尔比可以为约6 1至约3 1(例如4 1)。在一个实施例中，当使用大 孔树脂15时，醇与FFA比例为4 1。对于酶催化的酯化，合适的酶包括脂酶以及其他催化酯形成的酶。通常，反应含有 诸如C5-C12烷或空间位阻烷醇的有机溶剂。在某些情况下，反应在温度约20°C至约70°C下 进行约0. 2小时至约M小时。对于酶催化，醇与脂肪酸的比例为约1 1至约2 Kmol/mol)。在其他情况下， 所述比例优选为约1.2 1或1.3 1或1.4 1或约1.5 1。在一个实施例中，当使用 Novozym 435时，使用相当于约120%化学计量的醇量。在一个实施例中，脂酶与脂肪酸的 比例为约0. 005 1至约1 1 (w/w)。酯化结束后，将脂肪酸酯与任何反应物分离。分离可以通过本领域通常已知的任 何方法实现，优选通过比重分离和倾析或离心。分离的脂肪酸酯产品可以用循环的水洗涤 然后干燥。据发现，本发明的方法所达到的甘油三酯原料向脂肪酸酯的总转化率为约95% 至约97%。根据本发明方法制备的生物柴油可以用本领域技术人员已知的各种装置来分析。 例如，解析分析可以使用带有UV检测器的HPLC来进行。在一方面，所述检测器设置在210nm 并且可以使用常用的C185u柱(250X4. 6mm,Alltech Associates, Inc.，USA)。流动相包括 例如三个不同组分己烷、异丙醇和甲醇。储蓄器A含有甲醇，储蓄器B含有异丙醇和己烷 的混合物(5 4，v/v)。在一方面，使用100^^至50%4+50%8的线性梯度超过30111土11。 流动相的流速可以为lml/min，样品进样体积为101。该非水性RP-HPLC方法是现有技术方 法(参见 Holcapek，M. et al. J Chromatogr A 1999,858,13)的改进。
I II.实施例1.材料和方法1. 1 材料脱胶粗棕榈油购自马来西亚柔佛州的Wawasan Tehran Sdn Mid，来源于皱褶 假丝酵母的脂酶购自日本的Meito Sangyo Co.。来源于洋葱假单胞菌、粘质色杆菌、圆 柱假丝酵母的脂酶和Novozym 435 (固定在丙烯酸树脂上的南极假丝酵母脂酶B)购自 Sigma-AldriCh(USA(美国))。来源于猪胰腺、洋葱假单胞菌和南极假丝酵母B(粉末) 的脂酶来自Fluka(USA)。大孔树脂15 (强酸性苯乙烯-二乙烯基苯磺化离子交换树脂， 4. 7mequiv/g)购自Sigma(USA)。异辛烷购自美国新泽西州的Fisher Chemical。1. 2脱胶粗棕榈油的水解将装有脱胶CPO (2g)的80ml螺盖玻璃瓶预热至反应温度40°C约10分钟。将2ml 脂酶溶液(lmg/ml)加入到预热的CPO中，将混合物在250rpm下振荡3h (小时)。反应结束 后，将20ml异辛烷或己烷与反应混合物混合以便使产生的脂肪酸与甘油和水分离。然后将 该混合物在5000rpm下离心5分钟。收集上层相并直接用作酯化的原料。1. 3游离棕榈脂肪酸的酯化将含有IOml原料(异辛烷中的FA酸，0. 32M)和Ig大孔树脂15或0. 04g Novozym435的反应混合物预热至反应温度60°C (对于大孔树脂15)和40°C (对于Novozym 435)， 并且振荡速度为250rpm。分别加入相当于大孔树脂15的400%化学计量或相当于Novozym 435的120%化学计量的甲醇或乙醇以起始反应。反应结束后，滤出NOVOZym435和大孔树 脂15，并分别用叔丁醇(HPLC级)和甲醇洗涤。将它们冻干过夜备用。1. 4 分析反应混合物中的脂肪酸含量通过用0. 2M NaOH滴定来测量。甘油三酯的转化通过 带有210nm UV检测器的HPLC来确认(参见图3A-B)。使用常用的C 18 5u柱Q50 X 4. 6mm， Alltech Associates, Inc. , USA) 0流动相包括三个不同组分己烷、异丙醇和甲醇。储蓄 器A含有甲醇，储蓄器B含有异丙醇和己烷的混合物(5 4，ν/ν)。使用100% A至50% A+50% B的线性梯度超过30分钟。流动相的流速为lml/min，样品进样量为10 μ 1。该 非水性 RP-HPLC 由 Holcapek 等报道的方法(Holcapek M et al.，J Chromatogr A,858 13-31(1999))改进而来。酯化反应中消耗的脂肪酸通过用0. an NaOH滴定来监测。甲基或 乙基酯(生物柴油)的产量通过上述HPLC系统来确认(参见图4A-B)。2 结果2. 1不同脂酶水解脱胶粗棕榈油的效果表1示出了不同脂酶在固定蛋白浓度下将CPO转化为FFA的效果。很明显，来源 于皱褶假丝酵母和粘质色杆菌的脂酶最有效。虽然Novozym 435 (固定在丙烯酸树脂上的 南极假丝酵母脂酶B)对于酯化和酯交换活性很高，但是其水解活性很低。因为皱褶假丝酵 母脂酶比粘质色杆菌脂酶便宜50倍，所以选择它用于进一步的研究。表1 不同脂酶水解粗棕榈油的效果*
脂酶FFA 含量(mol%)铍褶假丝酵母52.0圓柱假丝酵母44.2米根霉26.9粘质色杆菌52.2洋葱假单胞菌22.0猪胰腺22.8荧光假单胞茵24.9南极假丝酵母B6.65Novozym 435 (固定的南极作i丝酵母脂酶B)5.1*实验条件除Novozym 435(160mg)以外，所有脂酶在缓冲液中的蛋白浓度保持 恒定在0. 5mg/ml，缓冲液2ml, CPO 2g，温度40°C，振荡速度250rpm,时间Ih。2. 2不同皱褶假丝酵母脂酶浓度下脱胶CPO的水解图5示出了反应速率随着缓冲液中脂酶浓度的增加而加快。对于除0. 125mg/ml外任何脂酶浓度，反应在FFA产量为99. 0%时达到平衡。反应速率在低脂酶浓度下缓慢，并 且在0. 125mg/ml的浓度下需要多于20h以完成反应。2. 3不同温度下脱胶CPO的水解图6示出了在不同反应温度下CPO的水解。反应速率在40°C和55°C下几乎相同， 然而在30°C下较低。因为脂酶在较低温度下更加稳定并且CPO熔点在35°C附近，所以对于 后续实验选择40°C为反应温度。2. 4不同缓冲液与CPO比例(ν/ν)下CPO的水解可以看出最佳的缓冲液与CPO比例为1 1(ν/ν)，低于或高于该比例时，反应速率 和FFA产量都会降低(图7)。2. 5大孔树脂15催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化图8示出了大孔树脂15催化的FFA甲基和乙基酯化的比较。虽然在两种情况下， 生物柴油的产量均达到99%，但是甲基酯化过程比乙基酯化更快。甲醇的低成本使其成为 酯化反应的良好选择。然而，乙醇可以作为合成完全生物生成燃料的理想候选，因为其来源 于农产品并且比甲醇毒性低。 2. 6Novozym 435催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化很明显，虽然Novozym 435催化的甲基酯化过程比乙基酯化快，但是池后在BD产 量99%时两个反应均达到平衡(图9)。因为甲醇在高浓度下对Novozym 435有毒性，所以 乙醇是Novozym 435催化的棕榈FFA酯化的正确选择。2. 7大孔树脂15和Novozym 433的重复使用将催化甲基和乙基酯化的大孔树脂15和Novozym 435分别用溶剂洗涤和冻干后 重复使用。用于洗涤大孔树脂15和Novozym 435的溶剂分别为甲醇和叔丁醇。图10示出 了每个循环中反应1.5h(对于大孔树脂15)和池(对于Novozym 435)后的BD产量。可以 看出大孔树脂15和Novozym 435可以分别重复使用多于100个循环和50个循环(见图 11)。本发明方法与已公开技术的比较由表2可见，皱褶假丝酵母脂酶催化水解然后大孔树脂15或Novozym 435催化 酯化的方法在合理的加工时间内提供了更高的产量(98-99%)。如该表所示，在 KOH-或NaOH-催化的酯交换中产量相对较低(见图12)。表2 本发明方法与已公开技术的比较
权利要求
1.生产生物柴油的方法，所述方法包括 将甘油三酯酶促水解以形成脂肪酸和甘油；以及 用所述脂肪酸酯化低级醇以形成所述生物柴油。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述甘油三酯与脂酶混合，并在足够的温度下孵 育足够的时间以形成所述脂肪酸。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述甘油三酯选自植物油、动物脂、牛 脂、润滑脂和再循环的提炼油或脂肪。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸为C12至C22脂肪酸。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述脂酶来源于植物、细菌、真菌和更高 等的真核生物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述脂酶来源于细胞外或细胞内，或者为全细胞的 形式。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述脂酶是固定的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述固定在多孔支持物或粉末上实现。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多孔支持物为丙烯酸树脂。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述脂酶为南极假丝酵母(Candidaantarctica) 脂酶B。
11.如权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述脂酶来源于皱褶假丝酵母 (Candida rugosa)0
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述酶促水解反应在约20°C至约50°C 的温度下孵育。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述酶促水解反应孵育时间为约0.5 小时至约24小时。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述酶促水解反应在水的存在下进行。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述酶促水解反应在缓冲溶液中进行。
16.如权利要求14所述的方法，其中水与甘油三酯的比例为约1 10至约20 l(v/V)。
17.如权利要求2-16中任一项所述的方法，其中所述脂酶浓度为约0.125mg/ml至约 2mg/ml0
18.如权利要求2-17中任一项所述的方法，其中所述脂酶能够利用中空纤维膜或其他 过滤器而再循环。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述酶促水解反应还包含有机溶剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述有机溶剂选自C5-C12烷和空间位阻烷醇。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述酯化步骤是化学催化或酶促催化的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述脂肪酸的所述化学酯化包括 将所述脂肪酸与所述醇和酸催化剂混合；以及将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述醇为C1-C5醇。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述酸催化剂选自无机酸催化剂或有机酸催化剂。
25.如权利要求M所述的方法，其中所述酸催化剂为液体或固体。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述酸催化剂为酸性苯乙烯-二乙烯 基苯磺化离子交换树脂。
27.如权利要求2216所述的方法，其中将所述酸催化剂通过用极性溶剂洗涤而再生。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述极性溶剂选自C1-C6烷醇和空间位阻烷醇。
29.如权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述酯化步骤包含有机溶剂。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述有机溶剂选自C5-C12烷和空间位阻烷醇。
31.如权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述酯化步骤包含分子筛。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述孵育温度为约20°C至约90°C。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述孵育时间为约0.2小时至约M小时。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述醇与脂肪酸的比例为约1 1至约 6 ； 1 (mol/mol) 0
35.如权利要求21-34所述的方法，其中固体酸催化剂与脂肪酸的比例为约1 10至 约 10 1(w/w)。
36.如权利要求21所述的方法，其中所述脂肪酸的所述酶促酯化包括 将所述脂肪酸与所述醇和脂酶混合；以及将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述脂酶来源于植物、细菌、真菌和更高等的真核 生物。
38.如权利要求36-37所述的方法，其中所述脂酶来源于细胞外或细胞内，或者为全细 胞的形式。
39.如权利要求36-38所述的方法，其中所述脂酶是固定的。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述固定在多孔支持物或粉末上实现。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述多孔支持物为丙烯酸树脂。
42.如权利要求36-41所述的方法，其中所述脂酶为南极假丝酵母脂酶B。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述脂酶通过用极性溶剂洗涤而再生。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述极性溶剂选自C1-C6烷醇和空间位阻烷醇。
45.如权利要求36所述的方法，其中所述酯化反应包含有机溶剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述有机溶剂选自C5-C12烷和空间位阻烷醇。
47.如权利要求36-46中任一项所述的方法，其中所述酯化反应包含分子筛。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述孵育温度为约20°C至约70°C。
49.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述孵育时间为约0.2小时至约M 小时。
50.如权利要求36-49中任一项所述的方法，其中所述醇与所述脂肪酸的比例为约-1 1 至约 2 1 (mol/mol)。
51.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中所述脂酶与所述脂肪酸的比例为约 0. 005 1 至约 1 1 (w/w)。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述水解或酯化在反应器中进行。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述反应器选自固定床反应器、流化床反应器和 搅拌槽式反应器。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中将所述生物柴油与石油柴油混合。
全文摘要
通过酶促水解油或脂肪然后化学/酶促酯化在水解步骤中所产生的游离脂肪酸来生产生物柴油的方法。该方法包括将甘油三酯酶促水解以形成脂肪酸和甘油；以及用所述脂肪酸将低级醇酯化以形成生物柴油。
文档编号C12P7/62GK102144035SQ200880130967
公开日2011年8月3日 申请日期2008年7月8日 优先权日2008年7月8日
发明者吴金川, 穆德·麦哈布布尔·拉赫曼·塔鲁克德尔 申请人:科技研究局