使基因表达靶向于神经胶质瘤的核酸分子和方法

专利名称：：使基因表达靶向于神经胶质瘤的核酸分子和方法
技术领域：
：本发明主要涉及使基因表达定向到神经胶质瘤中的核酸分子、表达载体和方法。
背景技术：
：选择的细胞或组织类型中的特异性基因表达可通过使用与配体结合的递送载体的靶向基因递送实现，所述递送载体通过所述配体结合于靶细胞独特的细胞表面受体。特异性基因表达还可通过使用细胞特异性启动子和增强子的靶向转录实现。细胞特异性启动子是将特殊细胞功能限制于特定分化细胞类型的主要方式之一。这些启动子指导相关基因转录的能力通过特定类型细胞中转录因子的胞内浓度和活性调节。使用细胞特异性细胞启动子以将转基因表达限制在靶组织中的细胞类型特异性转基因表达是一种可用于生物学研究以研究基因的细胞功能的技术，并且是一种可用于医学用途以消除由治疗基因的脱靶表达导致的副作用的技术。目前，采用组织或细胞类型特异性启动子来控制转基因表达的特异性。此方法对于在癌症治疗中表达自杀基因尤其有吸引力，所述癌症治疗使用毒性基因或编码使前药转变为毒性化合物的酶的基因。前人在自杀基因的表达中使用组织或细胞特异性启动子或者肿瘤选择性启动子的努力取得了利弊并存的成功，遭受到这些启动子将治疗基因表达严密限制于肿瘤细胞的严密性的困扰(Harringtonetal,2000；Robson&Hirst,2003；SaukkonenandHemminki,2005)。这与以下观念一致定义组织特异性并不简单，因为人基因组的转录普遍存在(Yangetal.,2005；Birneyetal.，2007)。而且，组织特异性基因在不同的生理条件下可能不是真正特异性的，并且细胞启动子可因内源性顺式和反式调节元件在不同生理条件下的不同表达而呈现不同的诱导模式(Harringtonetal,2000；Robson&Hirst,2003；SaukkonenandHemminki，2005；Stoff-Khalilietal.，2008)。因此，可能需要其他控制方法获得使用自杀基因表达治疗癌症所需的肿瘤选择性。因此，此方法可能被在某些条件下的显著脱靶表达所妨碍。例如，尽管细胞特异性启动子介导的毒性基因表达可消除所述启动子在其中发挥功能的特定细胞类型衍生的肿瘤细胞，然而这一方法也会因所述细胞启动子在健康细胞中诱导的表达而杀死健康细胞。已对组织特异性启动子和肿瘤选择性启动子就自杀基因表达进行了试验，以使对非靶标正常细胞的杀死效应最小化。区分组织特异性启动子和肿瘤选择性启动子倚赖启动子在正常和肿瘤组织中的相对活性，并且它们之间的分界线经常是模糊的(Harringtonetal.，2000)。除上述缺点以外，体内最精密的器官一中枢神经系统(CNS)的独特特征使得成功的组织或细胞靶向的基因表达存在几个障碍。在CNS中发现的细胞类型极为不同，其中许多对生理功能极为重要，并对基因表达的任何变化都高度敏感。使用选择性靶向方法来控制治疗基因的表达，例如使用自杀基因表达的试验，通常涉及表达毒性自杀基因的载体的直接肿瘤内注射，藉此将治疗基因表达局限于肿瘤组织。然而，由于大多数病毒载体的天然感染谱并不局限于肿瘤组织，因此肿瘤内注射的载体可能泄露到正常组织中是一个问题，并且可能造成健康细胞的附带破坏。尽管这种破坏在某些器官中是可忍受的，然而其在敏感器官例如脑中可能引起严重的后果。这些具体挑战要求建立特异性方法以在CNS细胞中表达转基因，包括局限于具体CNS细胞类型的基因表达，藉此确保在所需细胞中的治疗效果，并且限制由在非靶CNS细胞中的基因表达造成的副作用。神经胶质瘤是原发性脑肿瘤的最常见类型之一。神经胶质瘤可以是高度浸润的，极有侵袭性，并可能是最难治的人癌症形式之一(Ciafreetal.,2005；PulkkanenandYla-Herttuala,2005)。神经胶质瘤源于神经胶质细胞，主要是星形细胞，随着恶性水平增加分级为I到IV。IV级神经胶质瘤，也称为多形性成胶质细胞瘤(GBM)，包括近半的神经胶质瘤并且是成年人中最常见的原发性脑肿瘤。神经胶质瘤的常规治疗例如手术、Y照射和化疗对神经胶质瘤无效，证据是神经胶质瘤患者的预后很差，这些患者在诊断后的平均存活时间不到一年。正在研究的疗法例如靶向基因表达仍然是最有希望的治疗神经胶质瘤的方法之一。这些方法需要建立一种可特异性杀死肿瘤细胞同时不影响CNS的非靶健康细胞的选择性靶向方法。因此，使用治疗性自杀基因的肿瘤特异性表达来治疗神经胶质瘤的充分潜力将从建立可更精确地控制神经胶质瘤细胞内自杀基因表达而不靶向CNS健康细胞的方法中获益。
发明内容在一个方面中，本发明提供一种核酸分子，包含一个神经胶质特异性启动子；一段转基因编码序列；和多个miRNA靶位点；其中每个miRNA靶位点均结合一个在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中下调的miRNA，并且其中所述神经胶质特异性启动子和所述多个miRNA靶位点均可操作地连接于所述转基因编码序列。所述神经胶质特异性启动子可为星形细胞特异性启动子，包括胶质细胞原纤维酸性蛋白启动子。所述多个miRNA靶位点可以包含至少一个has-miR-31、has-miR-127或has-miR-143靶位点。在某些实施方案中，所述多个miRNA靶位点包含至少一个has-miR-31靶位点、至少一个has-miR-127靶位点和至少一个has-miR-143位点；或者至少两个has-miR-31靶位点、至少两个has-miR-127靶位点和至少两个has-miR-143位点。所述转基因可编码一种使神经胶质瘤细胞被直接杀死的基因产物、一种免疫调节蛋白、一种细胞毒素、一种血管生成抑制蛋白、一种肿瘤抑制蛋白、一种自杀蛋白、一种凋亡蛋白、一种抗血管生成蛋白或一种抗体。例如，所述转基因可编码HSV-tk或DT-A。在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的本发明核酸分子的表达载体。所述表达载体可为杆状病毒载体。在又一方面，本发明提供了一种在神经胶质瘤细胞中表达转基因的方法，包括用本发明的表达载体转染神经胶质瘤细胞。所述神经胶质瘤细胞可为体外(invitro)细胞、从受试者体内移出到体外的离体(exvivo)细胞或者受试者的体内(invivo)细胞。在本发明的另一方面，提供了一种包含本发明表达载体的转基因细胞。在本发明的又一方面，提供了一种包含本发明表达载体的药物组合物。在本发明的再一方面，提供了一种包含本发明表达载体和用于在神经胶质细胞中表达转基因的说明书的试剂盒。本领域技术人员在阅读以下本发明具体实施方式和附表和附图的描述后会明了本发明的其他方面和特征。在仅以举例的方式说明本发明实施方案的表和图中表1用于构建本发明表达载体的具体实施方案的引物的序列。图1用于调节转基因表达的miRNA的选择。(a)在正常人星形细胞中具有高拷贝数并且在成胶质细胞瘤细胞中显著下调的miRNA的鉴定。基于来自10个微阵列测定的10个星形细胞样品的平均信号强度和使用实时PCR定量的miR-31的绝对拷贝数估计了正常星形细胞中不同miRNA的拷贝数。图中包括231个在正常星形细胞和成胶质细胞瘤细胞中均表达的miRNA。将三个选择的miRNA的点涂以蓝色。(b)用RT-qPCR进行的miRNA表达分析。对三种选择的miRNA:miRNA-31、miRNA-127和miRNA_143在U87细胞和NHA中的表达进行了定量。基于用合成miR-31RNA寡核苷酸生成的标准曲线计算了miRNA拷贝数。图2=GFAP启动子和miRNA调节对萤光素酶转基因表达的组合效应。(a)含有增强的星形细胞特异性GFAP启动子和miRNA靶序列的表达盒的示意图。首先构建并测试了具有GFAP启动子和不同miRNA靶序列的pFastBac质粒(pFB)载体。CMVE/GFAP一种通过将人巨细胞病毒即刻早期基因5’端增强子的380bp片段添加至人GFAP启动子而构建的杂合启动子。Luc萤光素酶基因。将在表1中明示的miRNA靶序列插入Iuc基因的3’UTR区。PA聚腺苷酸信号。分别使用不含miRNA靶序列和含有mix9F序列的pFastBac质粒作为穿梭载体，生成杆状病毒载体BV-luc-ctrl和BV-luc-mix9F。(b)筛选在正常人星形细胞中、但不在成胶质细胞瘤细胞中调节转基因表达的miRNA靶序列。使用含有不同miRNA靶序列的PFB载体转染U87细胞和正常人星形细胞。在转染1天后分析萤光素酶基因表达。结果表示为无miRNA靶序列插入的对照pFB的百分数。(c)由杆状病毒载体介导的体外萤光素酶转基因表达。用从2到50增加的MOI转导细胞，在转导1天后分析萤光素酶基因表达。BV-luc-mix9F的结果表示为BV-luc-ctrl的百分数。(d)由杆状病毒载体介导的萤光素酶转基因在脑中的表达。在将BV-luc-ctrl或BV-luc-mix9F注射到小鼠脑的纹状体中两天后，采集脑组织用于萤光素酶活性测定。结果表示为每个脑的相对光单位(RLU)。柱:平均值(n=4)；棒SD。*:p<0.05。图3=BV-HSVtk的选择性细胞效应。(a)在BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F转导的人神经元、星形细胞和U87成胶质细胞瘤细胞以及小鼠脑中HSVtk表达的蛋白质印迹分析。(b)BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F转导的人神经元、星形细胞和U87成胶质细胞瘤细胞在GCV处理2天后的细胞生活力。(c)BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F注射的小鼠的脑切片的GFAP免疫染色显示了将miRNA靶序列整合至杆状病毒表达盒中对GFAP阳性星形细胞的保护。STR:纹状体。(d)在BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F注射的小鼠脑中GFAP表达的蛋白质印迹显示了将miRNA靶序列整合至杆状病毒表达盒中对GFAP阳性星形细胞的保护。图4=BV-HSVtk-Ctrl和BV-HSVtk_mix9F显示出对成胶质细胞瘤相同的治疗效果。(a)以BV-HSVtk-ctrl(右脑)和BV-HSVtk-mix9F(左脑)注射的两只具有成胶质细胞瘤的代表性小鼠。在肿瘤接种7天后对脑中人U87成胶质细胞瘤异种移植物的每一个进行单次杆状病毒注射，然后进行5天的腹膜内GCV注射。示出了杆状病毒/GCV注射0、2和5天后的生物发光图像。肿瘤细胞的生物发光信号在GCV注射5天后降低至背景水平，但在PPS注射5天后保持不变。(b)对4只动物的生物发光信号的定量分析。注意，生物发光信号在BV-HSVtk-mix9F注射的肿瘤异种移植物中的变化与在BV-HSVtk-ctrl注射的肿瘤异种移植物中的变化具有相同的趋势。(c)脑切片的代表性图片示出了U251异种移植物。左GCV注射5天后，仅在远离病毒注射位置的脑切片中发现了小肿瘤(箭头)。右在未进行GCV注射的对照中，发现了大且明显的肿瘤块，肿瘤已扩散至脑室。具体实施例方式本文所述的核酸分子、表达载体、方法和应用结合使用了组织特异性启动子和microRNA(miRNA)差异表达以优先指导神经胶质瘤细胞中的基因表达。为开发本发明的核酸分子、表达载体、方法和应用，使用了微阵列来确定在健康星形细胞和在成胶质细胞瘤细胞中的差异miRNA表达。在健康星形细胞中丰富但在神经胶质瘤细胞中下调的miRNA的miRNA靶位点与神经胶质特异性启动子一起用于使基因例如治疗性转基因在神经胶质瘤中优先表达，同时降低在神经胶质细胞包括星形细胞中的表达。简而言之，miRNA是最近发现的一类基因调节子，其是在植物和动物中均参与基因表达下调的约19-25个核苷酸的丰富的内源性非编码单链小RNA。miRNA首先由RNA聚合酶II从不同基因组位置转录为一级miRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA含有折回形成特殊茎-环二级结构的发夹_环结构域。所述发夹_环结构域在细胞核中由与一种双链RNA结合蛋白形成复合体的核酸内切酶切割，释放出约60-70个核苷酸的前体(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA被主动地从细胞核中转移至细胞质中，在细胞质中它们被核糖核酸酶切割。切割产生19-M个核苷酸双链体的成熟产物，其随后由解螺旋酶解链。所述成熟miRNA非对称地整合至被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的效应复合体中，所述复合体对含有miRNA所靶向序列的基因负调节。在与mRNA碱基配对后，miRNA通过以下机制介导转录后基因抑制诱导脱腺苷化、分解靶mRNA，并且/或者通过抑制翻译起始、阻断延伸和/或降解新生肽抑制蛋白产生(Filipowiczetal.，2008)。大多数动物miRNA结合mRNA转录物的3’非翻译区(3’UTR)中多个部分互补的位点。这种互补性通常限于成熟miRNA序列5’端的前2-8碱基。靶mRNA的命运由miRNA与其靶标之间的碱基配对程度决定。miRNA与其靶标的3’UTR之间完美或接近完美的互补会导致RISC诱导的mRNA切割，而不完美碱基匹配主要导致靶标的翻译沉默，对mRNA水平无大影响。到目前为止，已在人基因组中鉴定了约540个miRNA基因(http//microrna.sanger.ac.uk)。这些miRNA调节人基因组中全部蛋白编码基因的10-30%(Johnetal.，2004；Lewisetal.，200。单种miRNA可能调节100-200种基因，每种基因可被多种miRNA所靶向，表明miRNA与其靶标之间的复杂调节网络(Johnetal.,2004；Lewisetal.,2005)。鉴定miRNA的组织表达模式和这些小RNA在器官发育中的作用的研究已经完成。已发现一些miRNA在人体中广泛表达，而其他则以发育阶段、组织或细胞类型特异的方式显示出受限制的表达。miRNA几乎控制到目前为止研究过的每个细胞过程，包括增殖、干细胞分裂、发育时控(developmentaltiming)、凋亡、分化和代谢(Bushati&Cohem，2007；Kloosterman&Plasterk,2007)。脑表达最大比例的组织特异性miRNA，逐渐增加的证据显示了脑中的广泛转录后调节，并且已证明了脑特异性miRNA在控制神经发育、突触可塑性和可能的长时程记忆存储中的调节作用(Krichevskyetal.,2003；Babaketal.,2004；Sempereetal.，2004)。因此，在脑中miRNA表达受损可导致分化的丧失(或去分化)，从而导致脑肿瘤的发生(Esquela-KerscherandSlack,2006；Rosenfeldetal.,2008)在肿瘤组织中，miRNA表达谱可提供人癌症分类的信息，大多数miRNA在原发性肿瘤组织和癌细胞株中相比于在正常组织中是下调的(Luetal.，200。与miRNA表达与分化紧密联系的观念一致，分化程度低的肿瘤具有较低的miRNA表达的总水平，并且miRNA的总表达随着肿瘤细胞的分化而增力口(Luetal.，2005)。数项研究已使用报告物系统来原位追踪miRNA表达(Mansfieldetal.,2004；Zhaoetal.，200，然而，对miRNA介导的抑制的程度和鲁棒性检查得较少。Brown及其同事最近的研究证明，内源性miRNA可广泛地用于在不同细胞类型中调节转基因表达(Brownetal.，2006；2007)。然而，miRNA调节的多重性和协同性对选择严格控制转基因表达的内源性miRNA提出了很大的挑战。本发明的核酸分子、表达载体、方法和应用基于如下观念使用组织特异性启动子可增加优先在特定类型的组织或细胞中的转基因表达，而另外使用miRNA调节将提供使转基因在相同谱系的肿瘤细胞和正常细胞间差异表达的另一层控制。在miRNA有活性的细胞中，miRNA活性可导致基因表达的脱靶向，而非靶向。此机制在转录后水平起作用并提供一种克服使用组织特异性启动子的现有基因递送系统的局限性的方法，包括减少由于插入的位置效应和/或组织特异性启动子的不完美重构而导致的脱靶表达。通过阻止在正常神经胶质细胞中的转基因表达同时允许在神经胶质瘤细胞中的高水平表达，在本发明核酸分子、表达载体、方法和应用中使用的miRNA调节和组织特异性启动子控制的结合可用于增强神经胶质瘤细胞中基因表达的效力和特异性。因此，本发明所述的核酸分子(包括表达载体)可用于在神经胶质瘤的治疗中指导基因表达。因此，本发明提供了一种核酸分子，其包含一个神经胶质特异性的启动子、一段转基因编码序列和多个miRNA靶位点。所述miRNA靶位点的每一个均能够结合一个在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中下调的miRNA。所述神经胶质特异性的启动子和所述多个miRNA靶位点均可操作地连接于所述转基因编码序列，从而调节所述转基因的表达。本文使用的“神经胶质细胞”或“神经胶质”是指在中枢神经系统发现的一种或多种非神经元细胞，它们用作神经元细胞的支持物，不传导电脉冲，并且在神经组织的修复和再生中起作用。神经胶质细胞包括星形胶质细胞或星形细胞，其是星形的神经胶质细胞并且可为纤维性星形细胞或原浆性星形细胞。原浆性星形细胞主要见于灰质，而纤维性星形细胞主要存在于大脑和脊髓的白质中。神经胶质细胞还包括小神经胶质细胞以及少突胶质细胞(在中枢神经系统中)或许旺细胞(khwarmcell)(在周围神经系统中)。“源于神经胶质细胞的细胞”是指从包括星形细胞在内的神经胶质细胞衍生、发源或分化的细胞，包括赘生性细胞和肿瘤细胞(包括神经胶质瘤和星形细胞瘤一包括低级别和高级别星形细胞瘤)，并且可为任何这类细胞，包括哺乳动物细胞，例如人细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。“正常”神经胶质细胞一包括正常星形细胞，是指与神经胶质瘤细胞相对的非癌性、非肿瘤性、未转化的并且非赘生的神经胶质细胞。除非另有指明，否则在上下文允许的情况下，术语“一个细胞”或“多个细胞”是指单个细胞，以及多个细胞、细胞培养物、细胞生长物、细胞群或细胞系，并且可在体外或体内。体外细胞包括从受试者体内移出的离体细胞。类似地，除非另有指明，否则在上下文允许的情况下，提及“多个细胞”还包括提及单个细胞。应理解，启动子或启动子区是位于基因编码序列上游的核苷酸序列，该序列至少包含指导编码区转录必需的最小必要DNA元件，并且通常包括一个指引RNA聚合酶至转录起始位点以及一个或多个转录因子结合位点的位点。启动子(包括天然启动子)可包括例如包含TATA盒和起始序列的核心启动子区，还可包括包含所述核心启动子之外的近侧启动子元件的调节区，所述调节区的作用是增强或调节所述核心启动子的转录水平，包括通常与给定启动子关联的增强子元件。“神经胶质”描述的物质是神经胶质细胞、与神经胶质细胞相关或者包含神经胶质细胞。类似地，“星形胶质”描述的物质是星形胶质细胞或星形细胞、与星形胶质细胞或星形细胞相关或者包含星形胶质细胞或星形细胞。术语“神经胶质特异性的”指的物质或活性是存在于或出现于神经胶质细胞或源于神经胶质细胞的细胞中，但不存在于或出现于或者基本不存在于或出现于非神经胶质细胞或非源于神经胶质细胞的细胞，例如神经元细胞或不存在于中枢神经系统的细胞。。所述核酸分子包括神经胶质特异性启动子。神经胶质特异性启动子是控制这样的基因表达的启动子，即所述基因仅在或主要在神经胶质细胞或源于神经胶质细胞的细胞一包括神经胶质瘤细胞和星形细胞一中表达。神经胶质特异性启动子指导基因在神经胶质细胞或源于神经胶质细胞的细胞中的表达，但基本不指导同一基因在其他细胞类型例如神经元细胞中的表达，因此具有神经胶质特异性转录活性。在某些情况下，在其他细胞类型中可存在一些低水平表达，但这种表达基本比在神经胶质细胞中的低，例如为在神经胶质细胞中的表达的不足约1%，或者为约1%、2%、3%、5%、10%、15%或20%。这类启动子可为强启动子或可为弱启动子，其可指导基因在神经胶质细胞或源于神经胶质细胞的细胞中的组成型表达，或者其可指导响应某些条件、信号或细胞事件的表达。例如，所述启动子可为需要特定配体、小分子、转录因子或激素蛋白以引起自所述启动子的转录的诱导型启动子。所述启动子可为杂合启动子，含有来自天然神经胶质特异性启动子的元件和来自另一启动子一例如病毒启动子一的元件例如人巨细胞病毒即刻早期基因的增强子元件。应理解的是，使用的任何杂合启动子均应保留神经胶质特异性。在某些实施方案中，所述神经胶质特异性启动子包括JC病毒早期启动子(Kim，S.Y.，etal.，JVirol.(2003)77:3394-401)、髓鞘碱性蛋白启动子(Wei,Q.，etal.，Gene.(2003)313:161-7)或SlOOβ启动子(Namihira,M.，etal.，FEBSLett.(2004)572184-8)。在一个实施方案中，所述神经胶质特异性启动子包括胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)基因的启动子区，其是星形细胞和源于星形细胞的细胞特异的。所述GFAP启动子可为指导胶质细胞原纤维酸性蛋白表达的任何启动子。在具体实施方案中，所述GFAP启动子包含位于人GFAP基因侧翼的2.21Λ5’端区。GFAP是一种中间丝蛋白，仅在神经胶质源的细胞中表达(Eng，1985)。此蛋白已被用作星形细胞恶性肿瘤的病理标记物(Rutkaetal.，1997)。尽管因GFAP启动子的超甲基化而使GFAP蛋白在许多多形性成胶质细胞瘤肿瘤中检测不到，然而在基因转移载体中的启动子在神经胶质瘤细胞中是有活性的(Condorellietal.,1994；Fukuyamaetal.，1996)。因此，已对GFAP启动子在神经胶质瘤细胞中的选择性转基因表达进行了广泛的测试(Chenetal.，1998；McKieetal.，1998；Wangetal.，2006；Horstetal.,2007)在具体实施方案中，所述神经胶质特异性启动子区包含人GFAP启动子或大鼠GFAP启动子的序列，或者基本由所述序列构成，或者由所述序列构成，所述序列如下所示人GFAP启动子[SEQIDNO1]GTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGTAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCAGAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACAGGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACGGAGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGCCAGCACAGCCAGCTCATGCGTAACGGCTTTGTGGAGCTGTCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAGGAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGATAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACCTCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGCTGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAATGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGACTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGGTGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAATTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCCTGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATCTGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCACTCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTATTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAGAGAGGGTCCTCTTGATTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTCTGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAGGAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGCTATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTCTAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGCAGAGCCAGAGCAT大鼠GFAP启动子[SEQIDNO2]CCTGCAGGGCCCACTAGTCTGTAAGCTGGAAGTCTGGCAGTGCTGAGCTGGCCAACCCCCTCAGGACCTCCTCCTTGTGCCCACTGAATGACTCACCTTGGCATAGACATAATGGTCAGGGGCGGGCACACAGCCTGATTCCCGCTGCACTCCAGGCCCCCTTCAATGCTTTCCGAGAAGTCCATTGAGCTGGGAGCTTGTACTGCACCAAGGGCTGACATCCTGGCAGCCAGGGATGAAAGCAGCCCATGGGGCTACCCTTGCCGTATGCCTCACTGGCGGCAGAGAACAAGGCTCTATTCAGCAAATGCCCTGGAGTAGACACCAGAAGTCCAAGCATGGGCAGAGGAAGGCAGGCGTTGGGGGCTGGAGGGGAGCAGAGCTGTCTGTTTTCCAGAAGCCCAAGGGTACAGATGGCGCCTGGGGGGGAACTGAGTGGAGGGGATAGATGGGCCTGAGATCTCAAACATCAACAGCCTCCTCCCCACCAACGATGAAGGTGGAGGTTGGTTTCCCAGACCTACATATCCCCCAGAGACCTGGTGTATGAAAATTCAAAGGAGGTAAGTCTCCTGAGAGAACGGGGGGCTCACAAATGAAGCCAGCTGTCTTACCCTATCAGGACCTACGTGCATTCCTTCTGTCCTGCCCCCTAAACACACAGCCAGAGGCTCAAATTGATTCTGGAGTCACAAAGGGGGCTTGAAACCCCAGCCCCCCACTCCTGAACTCCAGGAATGAGAAGATAGTATTGGAGGGGTTCAGAGGAGAGGGCTCTGCACATCTGTTGAGAATGGGGGTCCCAGGAGAGTGTAATTTAGGCTGATCCCGGAGGAAGGGAATAGGCTCTTCAAGATCCTAGCATCTCACAGGCCCACAGAGAAGTTCAGAGTTGGGGCAGCCCTGGCTTACAGGCTCTAAGAACTGGAGGCAGTTTACCCAACCCAGCTGTGTGCATGCTGTCCCTCTCTCTGTCTCTGTCTGTCTCTCTCTGTCTCTGTCTCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGCTCACACACGTGTGTGTTTATCACACAAATGTTCATGTGTGTGTACATACATGTGTTGAGGCCAGAGGTCAACCTCAGACACTGTTGACTTGGTTGTATGAGATAACATTTCCCCCTGGGACCTGGGATTTGCCAATTAGTGTGACCCAGGAAGCCTACTTATTTTCATTCCTCAGCACTGCAGTTACAAGTATGCACTGTCAAACCAGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAACCAGGCCTTTTGTATTCGCTCTGTGGCTAGAACTTGGGTCTCCATGCTTGACAGGCAAGCGATTTATGGACTAAGCTGTTTCCTCGGCCCTCTCTTGACCCATTTACCAGAAATGGGGTTTCCTTGATCAATGGTTAAGCCAGGCTGGTGTTCCCAGGAAACCCTTGACTCTGGGTACAGTGACCTTGGTGGGGTGAGAAGAGTTCTCTCCATAGCTGGGCTGGGGCCCAGCTCCACCCCCTCAGGCTATTCAATGGGGTGCTGCCAGGAAGTCAGGGGCAGATCCAGTCCAGCCCGTCCCTCAATAAAGGCCCTGACATCCCAGGAGCCAGCAGAAGCAGGGCAT本文使用的“基本由......构成”是指核酸序列在所述序列内或在所述序列的一端或两端包括一个或多个核苷酸碱基，但是这些额外的核苷酸碱基在实质上不影响所述核酸序列的功能。除细胞类型特异性以外，治疗基因的高水平表达对于癌症治疗通常是需要的。与其他细胞启动子相比，GFAP启动子具有相当强的活性，能够驱动构成总脑蛋白最多至约0.2%的转基因表达(Smithetal.,NeurobiolAging.(1998)Sep-Oct；19(5):407-13)。所述核酸分子还含有多个miRNA靶序列。“miRNA靶序列”是为miRNA分子(包括整合至RISC中的miRNA分子)所识别并能够结合所述miRNA分子的核酸序列。在基因的3’UTR中插入miRNA靶序列可导致为包含结合所述靶序列的miRNA的RISC所识别和结合；并可最终导致该基因的表达下降，包括该基因的mRNA转录物的翻译下降。miRNA靶序列能够结合miRNA，意味着所述靶序列与所述miRNA序列至少部分互补，并且能够据浓度、细胞环境、环境条件和其他结合分子的存在为所述miRNA所识别并可结合于所述miRNA。类似的，提及“用于结合”miRNA或“结合”miRNA的miRNA靶序列是指所述靶序列能够结合所述miRNA，但并非意味着所述靶序列必须在任何给定时间均为结合的miRNA或RISC所占据。所述多个miRNA靶序列中包含的每个miRNA靶序列均基于miRNA在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中的相对水平进行选择。靶序列的选择针对的是在正常神经胶质细胞中相比于在神经胶质瘤细胞中丰富、从而在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中相对下调的miRNA。例如，所述miRNA在神经胶质细胞中的水平可为在神经胶质瘤细胞中的约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多或约10倍或更^^οmiRNA在神经胶质细胞或神经胶质瘤细胞中的水平可使用常规实验方法(包括RNA定量技术例如RNA微阵列方法)来评估。也可使用评估miRNA在神经胶质细胞或神经胶质瘤细胞中的活性的方法，例如测定给定miRNA沉默包含合适的miRNA靶序列的报告基因的能力的方法。这些用于评估miRNA水平的技术的实例包括在下面实施例中描述的那些。适合在核酸分子中使用的miRNA的靶序列包括has_miR-31、has-miR-127或has-miR-143的靶序列。在具体实施方案中，每个miRNA靶序列包含has_miR-31、has-miR-127或has-miR-143，或者基本由这些序列构成，或者由这些序列构成，这些序列如下所示Has-miR-31[SEQIDNO3]CAGCTATGCCAGCATCTTGCCHas-miR-127[SEQIDNO4]:AGCCAAGCTCAGACGGATCCGAHas-miR-143[SEQIDNO:5]TGAGCTACAGTGCTTCATCTCA所述多个miRNA靶序列内的每个miRNA靶序列与另一个miRNA靶序列均可相同或不同。在某一实施方案中，每个miRNA靶序列均为相同的靶序列。在另一实施方案中，每个miRNA靶序列均为不同的靶序列。在另一实施方案中，所述多个靶序列包含多于一种不同的靶序列，但各个(individual)miRNA靶序列中的至少两个是相同的。所述核酸分子包含多个miRNA靶序列。所述多个miRNA靶序列中的各个miRNA靶序列的数目为足以使转基因在正常神经胶质细胞中的表达下调但同时可使所述转基因在神经胶质瘤细胞中表达的数目。例如，所述多个miRNA靶序列可为2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或者10个或更多个各个miRNA靶序列。在某些实施方案中，所述多个miRNA靶序列包含3个靶序列、6个靶序列或9个靶序列。在具体实施方案中，所述多个miRNA靶序列包含has_miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各一个；或者包含3个靶序列，其中全部3个均为has-miR-31、has-miR-127或has-miR-143的靶序列。在其他实施方案中，所述多个miRNA靶序列包含has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各1个，重复2次总计6个靶序列；或者包含has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143的靶序列各1个，重复3次总计9个靶序列。不囿于任何具体理论的，观察到的miRNA的抑制水平可随着靶序列数目的增加而增加，暗示mRNA中miRNA靶位点的数目可影响转基因抑制的水平，这可能是由于单个必需结合事件发生的可能性提高的结果。同样，已证明靶mRNA的抑制通过不同miRNA种类的组合作用实现(BartelandChen，2004)，并且在下面实施例部分中陈述的本发明结果表明，不同miRNA可共同作用以降低转基因表达。尽管在动物中只知晓少数几个miRNA:mRNA相互作用对，然而已有实例发现不同miRNA种类调节可相同靶标(BartelandChen，2004)，例如miRNAlin-4和let-7及其靶mRNAlin-14、lin-28、lin-41和hbl-1(Reinhartetal.，2000；Abrahanteetal.，2003；Linetal.，2003；Sempereetal.，2004)。沉默复合体可相互稳定，或者共同相互作用以更有效地抑制转基因表达，或者这两种机制可同时起作用(Doenchetal.，200。这些实例，与其他生物调节系统一样，最显著的是，基因调节的共同相互作用可通过调节不同miRNA与mRNA的3’UTR结合的程度使得细胞微调mRNA的表达(BartelandChen，2004)。miRNA调节的这种性质可有利地用于本发明所述的核酸分子以增强正常神经胶质细胞中转基因表达的抑制。在所述核酸分子内的所述miRNA靶序列可由接头序列相互隔开。例如，可在所述多个miRNA靶序列内的每个miRNA靶序列之间插入2、4、6、8、10或更多个核苷酸碱基。如上所述，所述神经胶质特异性启动子和多个miRNA靶序列可操作地连接于转基因编码序列。当第一个核酸序列和第二个核酸序列处于功能关系中时，第一个核酸序列就与第二个核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子激活编码序列的转录，那么所述编码序列就与所述启动子可操作地连接。在另一实例中，如果调节序列例如miRNA靶序列一包括在与其他顺式或反式作用因子例如RISC合作的情况下一能够调节编码序列的表达，那么所述调节序列就与所述编码序列可操作地连接。因此，所述转基因的转录至少部分地受到神经胶质特异性启动子的调节，所述转基因的翻译至少部分地受到结合于miRNA靶序列的miRNA的调节。这种安排降低了所述转基因在非神经胶质源的细胞中的表达，同时所述miRNA控制降低了所述转基因在相关miRNA相对丰富的正常神经胶质细胞中的表达。所述转基因可为任何需要在神经胶质瘤细胞中表达的转基因，例如为了诊断、检测或治疗。所述转基因可编码任何在临床上有用的表达产物，例如参与神经胶质瘤预防或治疗的基因产物或蛋白，或者具有涉及神经胶质瘤预防或治疗的调节作用的基因产物或蛋白。所述转基因产物可为蛋白或肽。在某些实施方案中，所述转基因产物直接靶向肿瘤细胞生长或存活所需的特定基因的表达。在某些实施方案中，所述转基因产物包括治疗蛋白或肽。所述治疗蛋白或肽可以替代神经胶质瘤细胞中有缺陷或缺失的基因产物、蛋白或细胞调节作用，从而能够杀死神经胶质瘤细胞或者预防或治疗神经胶质瘤癌。治疗蛋白或肽包括导致被转染或感染的神经胶质瘤细胞被直接杀死的基因产物(包括HSV-tk，细胞毒素，肿瘤抑制蛋白例如p53、p51或p71，凋亡诱导物)、免疫调节蛋白(例如IL-2、IL-4、IL-12、IFN和TNF-α)、血管生成抑制蛋白、肿瘤抑制蛋白、自杀蛋白、凋亡蛋白、抗血管生成蛋白和抗体(包括抗体的功能片段)。所述治疗蛋白还可为细菌DT-A蛋白。在一个具体实施方案中，所述治疗蛋白包括ρ53蛋白或ρ53蛋白凋亡通路中的蛋白(“Ρ53通路蛋白”)，所述蛋白在神经胶质瘤细胞中表达时可导致神经胶质瘤细胞的细胞周期停止或凋亡。Ρ53通路蛋白是处于ρ53凋亡通路中的参与在细胞中实现或诱导凋亡的蛋白，并可在Ρ53凋亡通路中处于ρ53的上游或下游。例如，所述ρ53通路蛋白可为激活Ρ53的蛋白、调节ρ53活性或表达的蛋白、为ρ53所激活的蛋白或因ρ53激活而表达的蛋白以及参与与Ρ53激活有关的凋亡反应的蛋白。野生型ρ53基因的过表达是一种通过凋亡抑制肿瘤细胞生长或促进所述细胞死亡的方法，该方法基于如下结果许多肿瘤的不受控制生长至少部分是由于Ρ53基因的丢失或突变导致的。当与放疗和化疗结合使用时，恢复正常野生型Ρ53功能还可增强这些疗法的凋亡作用。已对数个病毒载体测试了Ρ53基因递送。一项研究报告了携带在CMV启动子控制之下的Ρ53基因的杆状病毒载体杀死&10S-2肿瘤细胞的应用(Songetal.,ExpMolMed.(2001)Mar31；33(1):46-53)。在另一具体实施方案中，所述治疗蛋白为DT-A蛋白。在细胞类型或肿瘤特异性启动子的控制之下，已在癌症疗法中对DT-A基因进行了测试(Massuda，Ε.S.，etal.ProcNatlAcadSciUSA(1997)9414701-6)。这种细菌蛋白在引入到真核细胞的细胞质中时具有很高的毒性，并且通过催化细胞延伸因子2的白喉酰胺部分的ADP核糖基化抑制蛋白合成，并且通过凋亡通路杀死细胞(Michl，P.andGress，Τ.Μ.CurrCancerDrugTargets(2004)4:689-702)。在另一具体实施方案中，所述治疗蛋白是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)。所述胸苷激酶将无毒前药更昔洛韦(ganciclovir)转化为一种对细胞有毒的化合物。因此，先表达胸苷激酶，再进行更昔洛韦治疗，是一种现行的用于诱导肿瘤细胞死亡的方法。包含均可操作地连接于转基因编码序列的神经胶质特异性启动子序列和多个miRNA靴序列的上述核酸分子可使用例如在Sambrooketal.(2001)MolecularCloningaLaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarbourLaboratoryPress中^的*令^已知的标准分子生物学和分子克隆技术合成。为了用于可支持从神经胶质特异性启动子转录的合适表达系统中，可将所述核酸分子插入用于递送至表达系统并在其中稳定的表达载体。例如，所述核酸分子可包括在质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。因此，提供了包含本发明核酸分子的表达载体。如上所述，所述表达载体可为质粒、包括人工染色体的染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段。在某些实施方案中，所提供的表达载体是一种病毒载体。杆状病毒载体特别适合在神经元细胞或神经胶质细胞特别是星形细胞和源于星形细胞的细胞中表达转基因。杆状病毒感染不会导致其自身基因在哺乳动物细胞中表达或在其中进行病毒复制(Carbonelletal.,JVirol.(1985)Oct；56(1):153-60；Hofmannetal.,ProcNatlAcadSciUSA(1995)92:10099-10103；Stanbridgeetal.，JBiomedBiotechnol.(2003)2003(2):79-91)。因此，即使病毒的某些序列可作为转录的启动子或增强子起作用，它们也会因缺少支持因子而在哺乳动物细胞中沉默，并且不太可能影响插入到杆状病毒载体中的哺乳动物启动子的细胞类型特异性。因此，在一个具体实施方案中，所述病毒载体是杆状病毒苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)0基于AcMNPV的载体作为新一代的基因递送载体出现(Hofmarmetal.，(1995)，见上文；Boyceetal.，ProcNatlAcadSciUSA(1996)93:2348-2352；Sarkisetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.(2000)97:14638-43；Ghoshetal.，MolTher(2002)6:5-11；KostandCondreay,TrendsBiotechnol(2002)20:173-180；KostΤΑ,etal.,NatBiotechnol.(2005)23567-75)。杆状病毒在哺乳动物细胞中不能有效地复制和表达病毒蛋白，这意味着这些病毒可进入哺乳动物细胞但不在其中复制，因此显著降低了哺乳动物中业已存在的抗病毒体液和细胞免疫的可能性。使AcMNPV作为基因递送载体的选择具有吸引力的其他固有优点包括对增殖和非增殖细胞的广泛向性、无明显细胞病变效应、高克隆能力以及容易制备高效价病毒。当作为系统递送的基因载体使用时，杆状病毒在暴露于血清补体后容易失活(Hofmannetal.，GeneTher(1998)5:531-536)。受血脑屏障(BBB)保护的中枢神经系统(CNS)实际上是与包括补体组分在内的循环免疫因子隔离的(CarsonandSutcliffe,JNeurosciRes(1999)55:1_8)，用作杆状病毒介导的基因表达的合适器官。向脑中直接注射杆状病毒载体一使用细针和慢注射速度以避免出血一通常可获得器官中满意水平的转基因表达(Sarkisetal.，(2000)，见上文；Lietal.，MolTher.(2004)10:1121-9；Lietal.ExpPhysiol.O005)90:39-44)。具有吸引力的是，杆状病毒表现出对神经胶质细胞的高向性(Sarkisetal.,(2000)，见上文)。以前使用Cy3标记的杆状病毒的研究证明了纹状体中约70%的病毒感染细胞为神经胶质细胞(Lietal.,(2004)，见上文)。由于该因子与本发明核酸分子一其整合一个神经胶质特异性启动子和在神经胶质瘤细胞中相对在正常神经胶质细胞中下调的相关miRNA的靶序列一的结合，所述转基因的表达会主要被限制于神经胶质瘤细胞，藉此使对中枢神经系统的具有重要功能的健康细胞的可能副作用最小化，否则所述副作用可能被外源基因的表达诱发。主要被限制于神经胶质瘤细胞是指在如上所述的非神经胶质瘤细胞中的表达基本更低。本领域技术人员能够使用已知的分子生物学和克隆技术构建合适的表达载体，包括病毒载体特别是杆状病毒载体，并且能够测试所构建的载体将所述核酸分子递送至神经胶质瘤细胞的能力。类似地，技术人员能够使用常规测试一例如通过在不同细胞类型中使用不同载体构建体来监测报告基因的表达一确定具体病毒载体是否影响从本发明杂合启动子表达的细胞特异性。特别地，杆状病毒是众所周知并良好表征的，并且杆状病毒载体用于哺乳动物基因转染包括应用苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)也是已知的(参见例如Sarkis，C.etal.(2000)ProcNatlAcadSci97(26)14638-43)。本领域技术人员可容易地构建任何合适的杆状病毒载体用于本发明。可使用技术人员已知的标准技术例如PCR和分子克隆技术改造所述杆状病毒。例如，可使用市售的克隆和表达系统例如Bac-To-Bac杆状病毒表达系统(GibcoBRL,LifeTechnologies,USA)容易地改造杆状病毒。所述核酸分子一包括在整合至合适表达载体时一可用于在神经胶质瘤细胞例如星形细胞瘤细胞或者源于神经胶质瘤或星形细胞瘤细胞的组织培养系中表达转基因。因此，本发明提供了一种在神经胶质瘤细胞中表达转基因的方法。用所述核酸分子例如包含上述核酸分子的表达载体转染神经胶质瘤细胞。转染方法取决于要转染的细胞的性质、培养或培育要转染的细胞的方法以及要使用的具体表达载体。所述神经胶质瘤细胞可为任何神经胶质瘤细胞，包括星形细胞瘤细胞、赘生性神经胶质细胞、肿瘤性神经胶质细胞。所述神经胶质瘤细胞可为体外细胞包括从受试者体内移出的离体细胞，或者可为受试者体内的神经胶质瘤细胞。用核酸分子转染哺乳动物细胞的标准转染方法是已知的，包括使用载体分子例如脂质体、阳离子聚合物、阳离子脂质和磷酸钙的转染，通过显微注射、无针注射、电穿孔和使用裸DNA的转染。当所述表达载体为病毒载体时，所述转染可通过在可使细胞被病毒转染的条件下，使所述细胞暴露于含有具体病毒表达载体DNA的病毒颗粒而实现，所述暴露例如向培养基中加入活病毒或使所述活病毒接触细胞外部。在用所述表达载体转染后，在允许从所述神经胶质特异性启动子表达的条件下培养所转染的细胞，所述条件包括任何从所用具体启动子转录所需的转录因子或细胞信号的存在。例如，如果所述启动子是一种需要通常不在神经胶质细胞中表达的病毒蛋白或特定细胞蛋白的杂合启动子，那么就应在生长培养基中提供或在所转染的细胞中表达这一生长因子或蛋白，例如通过使编码这一因子的基因包括在表达载体中但处在不需这一因子的启动子的控制下。在另一实施方案中，提供了一种治疗受试者体内可能为星形细胞瘤的神经胶质瘤的方法。“治疗”是指获得益处或所需结果包括临床结果的方法。益处或所需临床结果可包括但不限于一个或多个症状或病况的减轻或改善、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定、疾病发生的预防、疾病扩散的预防、疾病进展的延缓或减慢、疾病发作的延缓或减慢、疾病状态的改善或减轻，以及缓解(部分或全部)。“治疗”还可指相对不进行治疗的预期存活时间延长患者的存活时间。“治疗”还可指抑制疾病的进展、暂时减慢疾病的进展，但更优选参与永久性停止疾病的进展。所述方法包括对受试者给予上述核酸分子，例如插入表达载体中的核酸分子。所述受试者是需要这种治疗的任何受试者，包括哺乳动物特别是人受试者。将所述核酸分子引入哺乳动物体内细胞的方法是已知的，并可用于对受试者给予本发明的核酸分子例如表达载体以治疗神经胶质瘤。可使用例如以下方法将本发明的核酸递送至受试者体内的细胞DNA直接注射、受体介导的DNA摄取、病毒介导的转染或非病毒转染以及基于脂质的转染，其中所有这些方法均可包括使用本文所述的表达载体。可使用将DNA注射到体内细胞中的递送装置(例如“基因枪”)。这种装置可市售获得(例如自BioRad)。为将所述核酸分子特异性地递送至脑部具体区域的神经胶质瘤或星状细胞瘤细胞，可通过注射(包括本领域已知的立体定位显微注射)给予所述核酸分子，特别是病毒表达载体。对于人患者，可将立体定位基架固定在颅骨内，然后使用高分辨率MRI对带有所述立体定位基架的脑部成像。使用合适的立体定位软件，将所述图像翻译为适合用于载体DNA靶向注射的所述立体定位框架的三维坐标。可以以足以获得所需结果例如转基因在靶细胞中表达的量给予所述核酸分子。例如，可以以对表达足够量的治疗产物必需的量和剂量给予所述核酸分子，所述治疗产物的功能是用于缓解神经胶质瘤、改善神经胶质瘤、减轻神经胶质瘤、改良神经胶质瘤、稳定神经胶质瘤、抑制神经胶质瘤、预防神经胶质瘤包括预防神经胶质瘤的扩散、减慢或延缓神经胶质瘤的进展，或者治愈神经胶质瘤。要给予患者的有效量可根据许多因素而变化，所述因素例如核酸分子的药效学性质，给药模式，受试者的年龄、健康和体重，病况或疾病状态的性质和程度，治疗频率以及，如果有的话，并存治疗的类型。本领域技术人员可基于上述因素确定合适的量。可首先以合适的量给予所述核酸分子，所述合适的量可以根据患者的临床反应按照需要进行调整。核酸分子的有效量可根据经验并根据所述核酸分子可安全给药的最大量来确定。当所述核酸分子构成病毒表达载体时，所述病毒的毒力和效价将是确定所述有效量的一个因素。具体地，当所述核酸分子以杆状病毒的形式存在时，由于杆状病毒在脊椎动物中只有很小或没有细胞毒性，因此可耐受较大剂量。然而，所给予的杆状病毒的量应为获得所需结果的最小量。在多个实施方案中，将对人患者给予剂量为约IO9空斑形成单位(“pfu”)的本文所述的杆状病毒。在其他实施方案中，可在单剂中给予约IO2到约IO9Pfiu约IO6到约Kfpfu、约IO5到约107pfu或约IO5到约IO6Pfu0可根据初始治疗方案的效果多次给予有效量的杆状病毒。给药通常周期地进行，同时监测任何反应。技术人员会认识到，可根据选择的给药计划和途径，给予较上述剂量更低或更高的剂量。所述核酸分子可作为唯一疗法给药，或者可结合其他疗法(包括化疗、放疗或其他基因治疗)给药。例如，所述核酸分子可在手术去除原发肿瘤之前或之后，或者在治疗例如给予放疗或常规化疗药物之前、同时或之后给药。在一个实施方案中，可共同地或以序贯的方式给予所述核酸分子和一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒诱导被该病毒感染的细胞的溶解。本发明还考虑本文所述的多种核酸分子构建体用于在神经胶质瘤细胞中表达转基因，以及用于治疗受试者的神经细胞瘤的应用。还考虑本文所述的多种核酸分子构建体用于制备治疗受试者的神经细胞瘤的药物的应用。还考虑包含本发明核酸分子或表达载体的转基因细胞和转基因非人动物。为利于给药，可将所述核酸分子或表达载体制剂成药物组合物的成分。所述组合物可常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和多种相容的载体或稀释剂。对于所有形式的递送，均可将所述核酸分子或表达载体配制在生理盐水中。所述可药用稀释剂的比例和对其的认同(identity)通过以下因素确定所选择的给药途径、与核酸分子的相容性、在适当的时候与活病毒的相容性以及标准制药实践。通常用不会明显损害所述核酸一特别是当其是杆状病毒表达载体时一的生物学性质的组分配制所述药物组合物。在例如Remington’sPharmaceuticalSciences(Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,USA1985)中描述了合适的溶剂和稀释剂。可在生理学合适的缓冲剂中配制所述核酸分子的溶液。在正常的保存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长，但不会使所述核酸分子失活或降解的防腐剂。本领域技术人员会知晓如何制备合适的制剂。在例如Remington，sPharmaceuticalkiences和1999^djlKWTheUnitedStatesPharmacopeia:TheNationalFormulary(USP24NF19)中描述了用于选择和制备合适制剂的常规方法和成分。适合注射用的药物组合物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临用前配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末，其中术语无菌的范围不涉及可包含要给予的核酸分子的活病毒。在所有情况下，所述形式都必须无菌并且必须为存在易可注射性的流体。还考虑包含本文所述核酸分子构建体(包括表达载体)的试剂盒和商业包装体，或者包含本文所述药物组合物的试剂盒和商业包装体。这一试剂盒或商业包装体还会包含有关所包含核酸分子或药物组合物的应用一例如用于治疗神经胶质瘤或用于在神经胶质瘤细胞中表达转基因一的说明书。本发明的核酸分子、表达载体、方法和应用通过以下非限制性实施例进行进一步示例性说明。实施例1为验证如下假设构建了一种杆状病毒载体以在脑中表达神经胶质瘤自杀基因使用组织特异性启动子可增加优先在特定类型的组织或细胞中的转基因表达，而另外使用miRNA调节将提供使转基因在相同谱系的肿瘤细胞和正常细胞间差异表达的另一层控制。所述杆状病毒载体包含一个基因工程胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子以驱动自杀基因在神经胶质源的细胞中的表达，而在肿瘤内注射载体发生局部或系统泄漏的情况下使脑中和其他器官中具有重要功能的神经元和其他类型细胞免遭破坏。在本研究中，使用了GFAP启动子以使HSVtk基因的表达靶向至神经胶质源的细胞，从而避免对中枢神经系统(CNQ内部或外部的非神经胶质细胞的任何非希望的有害作用。然而，如同许多其他组织特异性启动子一样，GFAP启动子的表达谱在相同谱系的正常和肿瘤细胞之间没有明显差异，并且先表达HSVtk自杀基因、随后用GCV处理对正常星形细胞有毒性(Maronetal.,1997；Cowsilletal.，2000)，使得必须使用其他控制机制来保护正常神经胶质细胞，所述正常神经胶质细胞在CNS中丰富并在维持神经元的存活和生理功能中起关键作用。因此，所述载体的表达盒还包含在神经胶质细胞中丰富但在神经胶质瘤细胞中下调的三种miRNA的靶序列，以大大避免从肿瘤泄漏出的载体对附近正常神经胶质细胞的副作用，而不干扰自杀基因在肿瘤细胞中的表达。一个基因工程胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子和在神经胶质细胞中丰富但在成胶质细胞瘤细胞中下调的三种microRNA的重复靶序列在单一表达载体中的结合使用导致自杀基因表达的体内选择性显著提高。将miRNA调节整合至转录靶向载体中对防止脱靶转基因表达增加了另外一层面的安全性。下面描述的此实施例部分证明这种使用转录靶向和miRNA调节的双重控制导致了脑中脱靶转基因表达的显著减少。材料和方法细胞培养在此研究中使用的人细胞为U87、H4、T98G、U118、U138、U251、A172、CCF、SW1783和SW1088成胶质细胞瘤细胞系，正常人星形细胞(NHA)以及人胚胎干细胞衍生的神经元。所有成胶质细胞瘤细胞系均从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。U87、H4、T98G、U118、U138、U251、A172和CCF细胞在37°C下和5%CO2中培养在添加有10%胎牛血清(FBQ、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.lmg/ml链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中；SW1783和SW1088在含有100%空气的湿润培养箱中培养在添加有胎牛血清(10%),2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.lmg/ml链霉素的Leibovitz，sL-15培养基中。按照前人所述建立稳定表达萤光素酶的U87-1UC细胞(Wangetal.2006)。将来自CloneticsPrimaryCellSystems(Lonza,Basel,Switzerland)的正常人星形细胞(NHA)培养在添加有AGMSingleQuots(Lonza)并添加有10μg/ml人表皮生长因子、10mg/ml胰岛素、25μg/ml孕酮、50mg/ml转铁蛋白、50mg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素和10%FBS的特殊星形细胞基础培养基(ABM)中。这些原代星形细胞培养物是从正常人脑组织建立的，并在第二代或第三代后冷藏保存。人胚胎干细胞衍生的神经元基于Reubinoff等人(Reubinoffetal.2001)所述的方案生成。miRNA表达分析对于miRNA分析，使用PureLinkmiRNAIsolationKit(Invitrogen)依照厂商说明书从成胶质细胞瘤细胞系和正常人星形细胞中分离小RNA。通过分光光度法对小RNA样品进行定量并在Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,Inc.CA,USA)上使用RNA6000NanoChip测定其纯度。使用NCodeMulti-SpeciesmiRNAMicroarrayVersion2(Invitrogen)进行高通量分析。所述阵列由印刷在环氧化物包被的玻片上的针对miRBaseSequenceDatabase,Release9.O(Griffiths-Jonesetal.2006)中记录的所有成熟miRNA优化的探针序列构成。在所述阵列上有553个对应人miRNA的一式三份的探针。采用双色标记系统来比较成胶质细胞瘤中miRNA的表达水平与NHA水平。根据NCodemiRNALabelingSystem(Invitrogen)在聚腺苷酸加尾后用AlexaFluorf连接混合物对来自NHA的小RNA(500ng)进行序列标记。类似地，但独立地，用AleXaFluor5连接混合物对来自神经胶质瘤细胞系的等量小RNA进行标记。所述连接混合物将一个捕获序列标记至所述小RNA，为AlexaFluorf捕获剂或AlexaFluor5捕获剂与所述杂交的miRNA的序列的在后结合提供特异性。将标记的NHA和神经细胞瘤样品在每种神经胶质瘤细胞系的一式三份阵列上共杂交过夜。在此初始杂交后，将AlexaFluor3和AlexaFluor5标记的3DNA树枝状大分子(Genisphere)的混合物施加于每个用于检测的微阵列，进行4小时的第二次杂交。除了与连接在杂交的miRNA上的标签互补的特异性序列以外，所述树枝状大分子还携带约900个AlexaFluor荧光团，并可检测短的杂交靶。所有中间和最终洗涤步骤都按推荐进行，然后在GenePix4000B扫描仪(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA,USA)上在532和635nm下分别扫描玻片的AlexaFluor3(绿色)和AlexaFluor5(红色)信号。所有杂交均在BiopolisSharedFacilities(A*Star,Singapore)的MicroarrayCentre使用带有MAUIMixer杂交箱的MAUIHybridisation系统(BiomicroSystems,SaltLakeCity,Utah)进行。强度数据在可视地标记无探针点或人工产物(artefactual)杂交并手动调整网格以对齐所扫描玻片图像上的点之后使用GenePixPrO6.0软件(MolecularDevices)获得。将所产生的*.GPR(GenePixResults)文件导入GeneSpringGX7.3(SiliconGenetics,RedwoodCity,CA)进行进一步分析。每个探针点均含有NHA(绿色/对照)和神经胶质瘤(红色/原始)的强度值。中位数像素强度值已减去背景值，并且每片玻片上的一式三份斑点均通过GeneSpring对于两个通道自动处理为其平均值。对于每个玻片，每个点标准化均使用GeneSpring上的标准化选项，通过用每个点的强度除以其对照通道值来进行；如果对照通道小于10，那么使用10代替。每个玻片标准化被处理成对具体玻片的测量值的第50个百分位数。对成胶质细胞瘤细胞系与NHA的每个组合的一式三份生物学玻片进行分组并取平均值来代表一种情况，生成具有以神经胶质瘤(红色)信号比NHA(绿色)信号计算的强度比值的10种情况。为获得仅针对认为存在的miRNA探针的可靠数据，将考虑的每个数据文件在“标示筛过滤器(Flagfilter)”上过滤以排除无探针点。为鉴定在成胶质细胞瘤细胞系中差异表达的miRNA，使用了2X的倍数变化截值(强度比<0.5或>2)并进一步应用了严格的统计显著性过滤(t检验的ρ值<0.05)。microRNA的实时PCR是基于报道的方案(ShiandChiang，2005)稍加修改进行的。使用TRIzol试剂(Invitrogen,Singapore)从三种成胶质细胞瘤细胞系(U87、H4和T98G)和NHA中分离总RNA，并用TURBODNA-freeDNase(Ambion)处理。将经DNAse处理的总RNA(Iyg)分别使用Poly(A)TailingKit(Ambion)根据厂商说明书通过聚腺苷酸聚合酶用ATP聚腺苷酸化。聚腺苷酸化的总RNA通过RNeasyMiniKit(Qiagen)使用适合的方案进行纯化。简而言之，将100%乙醇加入聚腺苷酸化的RNA与裂解缓冲液的混合物中至70%ν/ν的乙醇终浓度，这使得所述小RNA级分可与所述柱结合。将纯化的聚腺苷酸化的RNA用200USuperscriptIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)禾口0.5μg聚胸苷酸接头[FirstChoiceRLM-RACE试剂盒中的互补DNA末端3，’快速扩增(RACE)接头；Ambion]根据厂商说明书进行反转录。实时PCR分析的正向引物基于整个已知成熟miRNA序列设计，在3’’端添加3个“A”提高扩增特异性。hsa-miR-143引物是一个例外其在5’’端被截去2个碱基，因为该成熟miRNA序列的前后4个碱基之间的互补性。选择了5SrRNA作为PCR定量的内参基因。所用引物的序列如下hsa-miR-31(5‘-GGCAAGAUGCUGGCAUAGCUGAAA)[SEQIDNO.:6]、hsa-miR-127(5‘-UCGGAUCC⑶CUGAGCUUGGCUAAA)[SEQIDNO.:7]、hsa-miR-143(5‘-AGAUGAAGCACUGUAGCUCAAA)[SEQIDNO.:8]禾口5S(5'CCGCCTGGGAATACCGGGTGCTGTAGGCTTT)[SEQIDNO.:9]。所用反向引物为3，接头引物(FirstChoiceRLM-RACE试剂盒中的3’RACE外引物)。为确定绝对拷贝数，使用合成的miR16aRNA寡核苷酸(lstBase，Singapore)形成了标准曲线。假设每个细胞含有30pg总RNA，那么每个样品反应的CT值就可基于此曲线转化为绝对拷贝数。所用的全部引物均由Sigma-ProligoSingaporePteLtd(BiopolisWay,Singapore)合成。弓I物优化根据Two-StepRT-PCRMasterMixforPrimerOptimization(AppliedBiosystems)的方案进行。实时PCR在Rotor-Gene6000(CorbettLifeScience)上以如下条件进行95°C10分钟，然后扩增45个循环(95°C15秒，60°C1分钟)。全部反应均一式三份进行。通过熔解曲线检查PCR特异性。基因转移载体的构建为构建质粒载体，使用了之前生成并含有基因工程细胞类型特异性启动子的重组PFastBacl载体pFB-CMVE/GFAP-luc(Wangetal.，2006)作为起始骨架。此构建体含有在胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)编码基因的启动子控制之下的萤火虫萤光素酶(Iuc)基因，该基因的活性通过将人巨细胞病毒即刻早期基因的增强子置于所述GFAP启动子的上游而提高(CMVE,WangandWang，2006)。pFB_CMVE/GFAP-luc载体中紧接在Iuc基因之后的HindIII位点用于插入miRNA靶序列。所选miRNA的成熟miRNA序列从miRNARegistry(Griffiths-Jonesetal.,2006)中获得。设计了称为X-mir-31、3X-miR-127、3X-miR-143和Mix_mir的四种寡核苷酸。前三种包含被设计为与相应miRNA完美互补的序列(以小写字母表示)的三个串联拷贝，而Mix-mir构建体以所给出的顺序包含三种不同miRNA互补序列的各一个拷贝(表1和图2a)。每个miRNA靶序列都由一个4核苷酸接头隔开。首先使用T4PolynucleotideKinase(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)使所述寡核苷酸在5’端处磷酸化。将分别磷酸化的所述寡核苷酸的正义和反义链退火并亚克隆到HindIII位点上。测序后选择以正向和反向包含不同拷贝的插入物(miRNA互补序列)的构建体。为构建杆状病毒载体，使用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)。选择两种含有萤光素酶的PFB构建体(pFB-CMVE/GFAP-luc和pFBmix-9F)用于杆粒生产。为生成包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的杆状病毒载体，将pFB-CMVE/GFAP-luc和pFBmix-9F载体中的萤光素酶基因替换为pORF-HSVtk(InvivoGen，SanDiego,CA,USA)中的HSVtk基因。重组杆状病毒在已预先适应Sf-900II无血清培养基(Invitrogen)的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)昆虫细胞中产生和增殖。Sf9细胞在27.5°C下在旋转式烧瓶中培养。采集在所述昆虫细胞培养基中的出芽病毒并通过0.45-μm孔径过滤器(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤以除去任何污染物，并通过以28，OOOg超离心60分钟浓缩。将病毒沉淀物重悬浮于合适体积的0.IM磷酸盐缓冲盐水(PBQ中，其感染效价(空斑形成单位，Pfu)通过对Sf9细胞的空斑试验确定。体外转染、转导和转基因表达分析将细胞以20，000/孔的密度分开接种在48孔板中，一天后转染。用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行不同构建体和无任何miRNA靶序列的对照质粒(pFB-CMVE/GFAP-Luc)的转染。对于每个转染反应，将稀释在OPTI-MEMIReducedSerumMedium中的0·2μg的质粒DNA禾口0·5μL·Lipofectamine加入细胞并在37°C,5%CO2下孵育4小时。孵育后，将含有转染复合物的OPTI-MEMI替换为普通生长培养基并在37°C下再培养一天。对于杆状病毒转导，将细胞与杆状病毒孵育1小时，然后除去病毒并加入普通生长培养基。将细胞在37°C下再孵育1天，然后用于转基因表达分析。对于萤光素酶活性测定，将所转染的细胞用PBS洗涤一次，然后用100μL报告细胞裂解缓冲液(ftOmega，WI,USA)冻融。将10μL所述细胞提取物用!Iomega的测定试剂盒进行萤光素酶测定。测量在单管型光度计(BertholdLumatLB9507,Badffildbad,Germany)中进行。将相对光单位(RLU)标准化为用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测量的蛋白浓度。HSVtk基因表达使用蛋白质印迹分析检查。在病毒转导M小时后采集并裂解细胞。将含有5μg总蛋白的裂解物装入4-12%NuPAGE梯度凝胶(Invitrogen)中进行蛋白分离。在将蛋白转移至硝酸纤维素膜上后，使用化学发光(ECL)检测系统(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ,USA)进行蛋白检测。所用一抗为以11000的稀释度使用的HSVtk(YaleUniversity,NewHaven,Connecticut白勺DrWilliamSummers馈赠)。兔IgG二抗(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0,USA)以1:3000的稀释度使用。微管蛋白用作上样对照并使用15000稀释的抗β-微管蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma)检测。细胞毒性测定将细胞以10，000/孔的密度接种在48孔板中。在使细胞生长过夜后，将培养基更换为含有不同浓度更昔洛韦(GCV)anvivoGen)的新鲜生长培养基。在37°C下孵育一天后，将细胞用感染复数(MOI)为50的杆状病毒载体(BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F)感染。在初次接种后每两天将培养基更换为含有适量更昔洛韦(GCV)(InvivoGen)的新鲜生长培养基。病毒感染6天后，将每孔替换以不含GCV的新鲜生长培养基，并将50μ1增殖测定溶液(CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay,Promega)加入每孔，然后在含有5%C02的湿润培养箱中于37°C孵育4小时。将培养板转移微板读数仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)以测量在490nm的波长下的吸光度。对每种处理进行一式三份的测量。相对于对照细胞(未经GCV处理的感染细胞)的相对细胞生长(％)计算如下(样品吸光度-空白吸光度)/(对照吸光度-空白吸光度)X100%。动物实验使用成年雌性Balb/c无胸腺无免疫活性裸鼠(重20g，6_8周龄)。将动物用150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪麻醉并置于压尺(nosebar)在0处的立体定位装置中。使用与30G针头连接的10μ1Hamilton注射器以0.6μ1/分钟的速度将3μ1在PBS中的杆状病毒(107pfu)注射到小鼠脑的纹状体的任一侧(前囟点和硬脑膜的前后向0.0mm,中侧向+2.0mm，和背腹向-3.Omrn)。在5分钟的注射完成后缓慢抽出针头。对于研究对正常脑的HSV-TK/GCV处理的效果的实验，在杆状病毒载体的脑注射后每天进行剂量为50mg/kg的GCV或PBS的腹膜内注射，持续7天。用过量的氯胺酮和/甲苯噻嗪使小鼠安乐死，用PBS进行心脏灌注并采集脑组织用抗GFAP的一抗(Chemicon)进行蛋白质印迹分析。对于免疫细胞化学染色，在PBS的心脏灌注后用新鲜制备的冷多聚甲醛的PBS溶液)灌注。将脑样本留在冷的4%多聚甲醛中4小时至过夜，通过在30%蔗糖中孵育进行冷冻保护直至样本下沉，在包埋介质(Jung组织冷冻介质，LeicaInstruments,Germany)中冷冻后在_20°C下切成25μm切片。将切片用漂片(free-floating)法染色。在4°C下，将切片在含有1100稀释的抗GFAP的一抗以及0.3%Triton-X和3%兔血清的PBS中孵育过夜。之后是三次PBS洗涤步骤，随后在室温下用1100稀释度的FITC缀合的抗小鼠免疫球蛋白的二抗(Sigma)孵育2小时。在PBS洗涤后，将脑切片用封片介质(Vectashield)封片。在Olympus显微镜下观察并保存图像。对于研究治疗效果的实验，首先将0.5XIO6的人神经胶质瘤U87-萤光素酶(U87-luc)细胞接种到小鼠的纹状体的两侧。一周后，将杆状病毒载体注射到肿瘤内，然后每天进行GCV的腹膜内注射。通过对异氟烷气体麻醉的动物中的U87-1UC细胞的生物发光成像监测小鼠脑中的肿瘤生长。用D-萤光素(!Iomega)以100mg/kg(溶于PBS)对动物进行腹膜内注射，然后立即成像。然后在萤光素注射后10分钟和20分钟时用与冷CCD照相机(Xenogen，Alameda,CA,USA)连接的IVIS成像系统进行生物发光成像。通过从ROI信号中减去背景信号采集图像并测量生物发光信号，并用Xenogen活体成像软件v2.5分析光子强度。在对动物的处理和护理中，遵守由NationalAdvisoryCommitteeforLaboratoryAnimalResearch,Singapore发布的theGuidelinesontheCareandUseofAnimalsforScientificPurposes。本石if究的实验方案由InstitutionalAnimalCareandUseCommittee(IACUC),NationalUniversityofSingaporeandBiologicalResourceCenter,theAgencyforScience,TechnologyandResearch(A*STAR),Singapore批准。结果对内源性miRNA表达作谱对于预测miRNA活性以及实现受miRNA调节的载体的合理设计是重要的。使用能够同时检测553个人miRNA的miRNA微阵列芯片，在10种人神经胶质瘤细胞系中评价了相对于正常人星形细胞的miRNA总表达变化。在所有样品中表达的肿瘤样品/正常样品比值彡2的miRNA均被认为是上调的miRNA，而在该比值<0.5的miRNA被认为是下调的miRNA。鉴定出57个上调的miRNA和1个下调的miRNA。基于10个微阵列测定的平均信号强度和实时PCR定量的miR-31的绝对拷贝数估计了正常星形细胞中不同miRNA的拷贝数。使用在神经胶质瘤细胞中显著下调和在正常星形细胞中的高拷贝数作为标准，并且考虑公开的在原发性神经胶质瘤样本中和在正常脑中的miRNA表达水平(Ciafreetal.,2005；Landgrafetal.，2007)，选择了三种miRNA—has-miR-31、has-miR-127和has-miR-143(图la)—来设计含有双重控制系统的基因转移载体。定量实时PCR分析确认了3种miRNA在神经胶质瘤细胞中的下调及其在正常星形细胞中的相对较高水平(图lb)。为构建双重控制载体，使用基因工程的GFAP启动子(Wangetal，2006)将转基因表达局限于神经胶质细胞系，并将与miR-31、miR-127或miR-143完美互补的miRNA靶序列引入转基因的3’非翻译区，以将转基因表达局限于神经胶质瘤细胞(图加)。将每种miRNA靶序列的三个连续重复序列(形成3个拷贝的具体miRNA靶序列)，或所述三种miRNA靶序列的1个、2个或3个套系连续序列(形成混杂的3、6和9个拷贝的所述不同类型靶序列)插入每种载体中，并通过一个4核苷酸接头将这些靶序列的拷贝物隔开(表1)。因为仅使用一个限制酶位点(HindIII)进行插入，因此选择正向或反向的构建体。在将上述调节元件纳入带有萤火虫萤光素酶报告基因的质粒表达载体中后，测试了在转染到正常人星形细胞和U87神经胶质瘤细胞中后miRNA靶序列抑制萤光素酶基因表达的能力(图2b)。在肿瘤细胞中，抑制水平通常低于20%，但具有混杂的3种靶序列并且插入方向为正向的构建体的抑制水平为40%。在正常星形细胞中，对于含有3个串联拷贝的一种类型的靶序列的构建体，抑制水平也较低。然而，通过使用携带混杂组合的三种miRNA结合位点的构建体，特别是当结合位点的数目增加至总计6或9个靶序列时，实现了高得多的抑制水平。因此，pFBmix-6F和pFBmix-9F—其分别具有2个和3个拷贝的所选3种miRNA的靶序列的每一种一在正常人星形细胞中出现转基因表达的80%抑制。以前已证明了昆虫杆状病毒是有效载体，能够转导星形细胞和成胶质细胞瘤细胞并且能够通过毒性自杀基因的过表达抑制体内神经胶质瘤细胞的生长(Wangetal.,2006)。在此研究中，测试了杆状病毒载体中的miRNA调控的功能性。由于具有共计9个拷贝的三种类型miRNA靶序列的组合(mix9F)是抑制转基因表达最有效的构建体，因此在后续实验中将其用于杆状病毒载体中来抑制转基因表达。含有萤光素酶基因和miRNA靶序列的杆状病毒载体命名为BV-luc-mix9F，对照杆状病毒载体命名为BV-luc-ctrl(图加)。当比较所述两种载体在神经胶质瘤细胞系中的转导效率时，通过miRNA靶序列的整合，观察到轻微至中度的降低，从在U87细胞中降低7%，在H4细胞中降低14%至在T98G细胞中降低40%(图2c)。转基因表达的不同抑制水平与所述三种miRNA在所述三种神经神经胶质瘤细胞系中的相对丰度有关(图lb)，表达最低水平的所述三种miRNA的U87细胞受影响较小。然而，在表达高水平的所述三种miRNA的正常人星形细胞中，观察到了91%的基因表达水平的降低(图2c)。为研究杆状病毒载体的体内抑制，比较了上述两种病毒载体在小鼠脑中的转导效率，由于miRNA序列在人和小鼠之间的保守性，小鼠的脑表达了在体外实验中检测的三种人miRNA的准确同源物(exacthomolog)。在将所述病毒载体注射到裸鼠纹状体中后两天，观察到了低水平的来自BV-luc-miX9F的萤光素酶表达。尽管miRNA靶序列的体内抑制作用比在体外更加温和，然而抑制仍为大约4倍(图2d)。为检测mix9FmiRNA靶序列是否能够抑制功能基因的表达，构建了两种含有在基因工程GFAP启动子控制下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自杀基因的杆状病毒载体，一种具有mix9F靶序列(BV-HSVtk-mix9F)，另一种不含所述靶序列(BV-HSVtk-ctrl)。使用蛋白质印迹分析，在人U87成胶质细胞瘤细胞中检测了HSVtk表达，在使用BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk-mix9F转导后表达水平无差异(图3a)。在正常人星形细胞和小鼠纹状体中，在BV-HSVtk-ctrl转导后观察到了HSVtk表达，但在BV-HSVtk_mix9F转导后未观察到(图3a)。在源于人胚胎干细胞的HSVtk-ctrl或BV-HSVtk-mix9F转导后的神经元中，均未检测到HSVtk表达(图3a)。进一步研究了HSVtk表达后进行更昔洛韦(GCV)处理的体外作用，在人正常星形细胞和U87细胞中均发现了GCV剂量依赖的细胞活力的降低，但在人神经元中不明显(图3b)。在U87细胞中，在BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F之间没有明显的细胞毒效差异，表明mix9FmiRNA靶序列的整合不影响神经胶质瘤细胞中HSVtk有关的细胞杀死作用。在正常人星形细胞中，两种杆状病毒载体的杀死曲线非常不同，在ΙΟμΜ及以上的GCV浓度下，BV-HSVtk-ctrl诱导比BV-HSVtk_mix9F显著更多的细胞死亡。在所测试的最高剂量(300μΜ)下，BV-HSVtk-ctrl诱导了多于90%的细胞的死亡，而BV-HSVtk-mix9F诱导了约55%的细胞的死亡。在用BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F分别转导后，GCV处理得到的IC5tl值(将细胞存活抑制了50%的GCV浓度)在U87成纤维细胞瘤细胞中为0.8μM和1μM，在正常星形细胞中为7μM和30μΜ，说明在非靶正常星形细胞中对HSVtk/GCV介导的细胞毒性的耐受的4倍提高。BV-HSVtk-ctrl在U87细胞和正常星形细胞中不同的细胞杀死效力说明GCV对DNA合成的抑制对于活跃增殖的肿瘤细胞的毒性更强。在U87肿瘤细胞和正常星形细胞之间由BV-HSVtk-mix9F引起的不同至少部分地归因于mix9F靶序列的存在以及所述两种类型的细胞对GCV的不同敏感度。综上所述，这些结果说明神经胶质瘤细胞和正常星形细胞对HSVtk/GCV介导的细胞毒性呈现不同的易损性，尤其包括在使用BV-HSVtk-mix9F时。为检查mix9FmiRNA靶序列是否可在脑中提供抵抗HSVtk/GCV诱导的细胞毒性的体内保护，将BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk-mix9F注射到裸鼠的纹状体中，之后7天每天进行GCV的腹膜内注射。脑切片的免疫染色说明在以BV-HSVtk-ctrl注射的纹状体中的GFAP阳性细胞的数目明显减少，但在以BV-HSVtk-mix9F注射的同一脑的对侧上众多细胞被抗GFAP的抗体强染色(图3c)。类似地，纹状体组织的蛋白质印迹分析显示在以BV-HSVtk-ctr1/GCV注射的动物中GFAP带的染色强度明显降低，但在以BV-HSVtk_mix9F/GCV注射的动物中GFAP带无明显变化。这些结果说明mix9F介导的抑制可有效保护脑中正常星形细胞。为研究包含miRNA靶序列的杆状病毒载体在体内是否保持抗肿瘤效力，将一种稳定表达萤光素酶的改造人成胶质细胞瘤细胞系U87-1UC细胞接种到裸鼠的纹状体中，然后在7天后将杆状病毒载体单次注射到U87成胶质细胞瘤异种移植物中，并在随后5天每天进行GCV的腹膜内注射。使用非侵入性生物发光成像方法监测活小鼠脑内的肿瘤生长。图4a示出了从在病毒注射前接种的U87-1UC细胞容易检测出发光活性，并且在肿瘤异种移植物中以BV-HSVtk-ctrl和BV-HSVtk_mix9F注射、但未进行GCV注射的动物的5天观察期中持续增加。在肿瘤内注射杆状病毒载体后接受GCV注射的动物中，在病毒载体注射后第5天几乎检测不到萤光素酶活性。对于每种处理，来自4只小鼠的一组的定量结果汇总于图4b，表明在单次注射BV-HSVtk-ctrl或BV-HSVtk_mix9F然后进行5天的GCV注射可明显消除肿瘤，在这两种病毒载体之间的肿瘤抑制作用无显著差异。在对照动物中的肿瘤生长和在接受病毒和GCV注射的动物中的抑制通过组织学检查得以确证(图如)。参考文献IAbrahanteJEetal.TheCaenorhabditiseleganshunchback-likegenelin-57/hbl-lcontrolsdevelopmentaltimeandisregulatedbymicroRNAs.DevCell2003；4:625-637.2BabakTetal.ProbirngmicroRNAswithmicroarrays:tissuespecificityandfunctionalinference.Rna2004；10:1813-1819.3Barte1DP,ChenCZ.Micromanagersofgeneexpression:thepotentiallywidespreadinfluenceofmetazoanmicroRNAs.NatRevGenet2004；5396-400.4BimeyEetal.Identificationandanalysisoffunctionalelementsin1%ofthehumangenomebytheENCODEpilotproject.Nature2007；447:799-816.5BrownBDetal.EndogenousmicroRNAcanbebroadlyexploitedtoregulatetransgeneexpressionaccordingtotissue,lineageanddifferentiationstate.NatBiotechnol2007；25:1457-1467.6BrownBDetal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.NatMed2006；12:585-591.7BushatiN,CohenSM.microRNAfunctions.AnnuRevCellDevBiol2007；23175-205.8ChenJetal.Aglial-specific，repressible，adenovirusvectorforbraintumourgenetherapy.CancerRes1998；58:3504-3507.9CiafreSAetal.ExtensivemodulationofasetofmicroRNAsinprimaryglioblastoma.BiochemBiophysResCommun2005；334:1351-1358.IOCondorelliDFetal.Tissue-speciffcDNAmethylationpatternsoftheratglialfibrillaryacidicproteingene.JNeurosciRes1994；39:694-707.IlCowsillCetal.Centralnervoussystemtoxicityoftwoadenoviralvectorsencodingvariantsoftheherpessimplexvirustype1thymidinekinasereducedcytotoxicityofatruncatedHSVl-TK.GeneTher2000；7:679-685.12DoenchJG,PetersenCP，SharpPA.siRNAscanfunctionasmiRNAs.GenesDev2003；17:438-442.13EngLF.Glialfibrillaryacidicprotein(GFAP):themajorproteinofglialintermediatefilamentsindifferentiatedastrocytes.JNeuroimmunol1985；8:203-214.14EsqueIa-KerscherA，SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatRevCancer2006；6:259-269.15Fi1ipowiczW,BhattacharyyaSN,SonenbergN.Mechanismsofpost-transcriptionalregulationbymicroRNAs:aretheanswersinsight？NatRevGenet2008；9:102-114.16FukuyamaKetal.Analysisofglialfibrillaryacidicproteingenemethylationinhumanmalignantgliomas.AnticancerRes1996；16:1251-1257.17HarringtonKJ,LinardakisE，VileRG.Transcriptionalcontrol:anessentialcomponentofcancergenetherapystrategies？AdvDrugDelivRev2000；44:167-184.18HorstMetal.Targetingmalignantgliomaswithaglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)-selectiveoncolyticadenovirus.JGeneMed2007；91071-1079.19JohnBetal.HumanMicroRNAtargets.PLoSBiol2004；2:e363.20KloostermanWP,PlasterkRH.ThediversefunctionsofmicroRNAsihanimaldevelopmentanddisease.DevCell2006；11:441-450.2IKrichevskyAMetal.AmicroRNAarrayrevealsextensiveregulationofmicroRNAsduringbraindevelopment.Rna2003；9:1274-1281.22LandgrafPetal.AmammalianmicroRNAexpressionatlasbasedonsmallRNAlibrarysequencing.Cell2007；129:1401-1414.23LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines,indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets.Cell2005；120:15-20.24LinSYetal·TheCeleganshunchbackhomolog，hbl_l，controlstemporalpatterningandisaprobablemicroRNAtarget.DevCell2003；4:639-650.25LuJetal·MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature2005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