专利名称：一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码黑曲霉(A/ ^^7/M m'gw) WX-07 BGL酶的DNA序列 及其表达，构建高效表达(3-葡萄糖苷酶的酵母基因工程菌，以及P-葡萄糖苷酶 制剂和(3-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的方法。属于酶基因工程和酶 工程领域。
背景技术：
龙胆低聚糖是一类由葡萄糖以(3-l， 6糖苷键结合的新型功能性低聚糖，包括 龙胆二糖，少量的三糖和四糖。作为功能性食品配料，龙胆低聚糖除了具有低 热量，低龋齿，整肠等生理功能外，与其他功能性低聚糖相比，它还能更好地 促进人体小肠中双歧菌和乳酸菌的繁殖；并且耐热、耐酸，可应用于其他一些 低聚糖不适宜使用的保健食品中。虽然龙胆低聚糖具有广阔的应用前景，但目 前只有日本的NihonShokuhinKako公司进行工业化生产，主要在日本销售。龙 胆低聚糖的制取方法很多。早期采取从植物中提取，因为受到原料的限制，产 量不高。目前酶法制取成为最有效地降低成本，大规模生产的途径。工业上采 用高浓度的葡萄糖为原料，经(3-葡萄糖苷酶转糖苷和縮合，再经分离精制得到不 同规格的龙胆低聚糖成品。
(3陽葡萄糖苷酶((3-glucosidase， BGL， EC 3.2丄21)属于水解酶类，但也具有转 糖苷活性，可使低聚糖的非还原末端糖苷键断裂，释放出葡萄糖，并将游离的 葡萄糖基以P-1， 6糖苷键形式转移到其他糖底物上获得龙胆低聚糖。BGL广泛存 在于自然界许多植物和微生物中，但酶活普遍较低，且不易纯化，所以运用基 因工程手段构建高效表达BGL的工程菌成为当今研究P-葡萄糖苷酶的热点。
到目前为止，已有上百个微生物(3-葡萄糖苷酶基因得到克隆，其中一些获得 异源表达。早期主要选用大肠杆菌为宿主，近年来随着真核表达体系的建立与 完善，研究表明p-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中表达的表达量和 酶活性普遍要高些，所以酵母表达系统被广泛应用。由于(3-葡萄糖苷酶的水解活 性在纤维素的完全降解中起到至关重要的作用，目前对于P-葡萄糖苷酶的研究大 多集中于其水解活性，转苷活性的报道很少。Heather F. Seidle等人曾研究过黑曲 霉来源的P-葡萄糖苷酶转苷活性与pH的关系，虽提到龙胆二糖是转苷产物，但 是在其研究过程中以纤维二糖为底物龙胆糖产物量仅有约5.4g/L。国内学者主要 致力于克隆表达(3-葡萄糖苷酶基因以及研究其水解酶学性质，没有涉及转苷活 性。至于利用重组p-葡萄糖苷酶的转苷活性酶法生产龙胆低聚糖未见报道。本发明的一个目的是提供包含P-葡萄糖苷酶基因的酵母基因工程菌。本发
明的另一个目的是提供本发明基因工程菌生产(3-葡萄糖苷酶制剂，本发明的再 一个目的是提供以P-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的生产工艺。
本发明的技术方案
一种P-葡萄糖苷酶，縮写为BGL酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。 所述的(3-葡萄糖苷酶的基因，縮写为6g/基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l 所示。
所述的e-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达方法，由黑曲霉WX-07总RNA逆 转录合成6g/的cDNASEQIDNO:l， 基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕 赤酵母KM71为表达宿主，实现6g/基因的可溶性表达；黑曲霉WX-07己在中 国酿造2007年第5期公开。
(1) 黑曲霉WX-07总RNA的提取
黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓 冲液清洗菌体一次，加入lmL TRI REAGENT (购于Sigma公司)，用移液枪反 复吹吸以裂解细胞；12,000xg、 4T:离心10min以移除不溶物；将上清转移到一 个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s， 在室温下放置10min， 12,000xg、 4。C离心15min，取上层无色水相于一干净的 离心管，加入500pL异丙醇，混匀，在室温下放置10min， 12，000xg， 4'C离心 10min，弃上清，加入lmL由DEPC-H20 (购于宝生物工程有限公司)配制的 质量浓度75%乙醇，漩涡混匀，然后12，000xg、 4。C离心5min，弃上清，让RNA 自然干燥10min，加40nLDEPC-H2O溶解RNA沉淀，为模板RNA， -20°0保存；
(2) P-葡萄糖苷酶编码基因的克隆
以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下 PrimeScript RTase、 5 XPrimeScript Buffer、 RNase Inhibitor、 dNTP Mixture、 Oligo dT Primer 、 Random 6mers、 Rnase free H20均来自于试剂盒"PrimeScriptTMlst Strand cDNA Synthesis Kit",购于宝生物工程有限公司)，
①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液
50|iM的Oligo dT Primer或 Random 6mers l(iL，
10mM的dNTP Mixture 1 (iL,
总RNA l吗，
和Rnase free H20 添加至总体系lOjaL;
② 65'C保温5min后冰上急冷；
③ 在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液
步骤①配制的RNA/Primer混合液 1 O^iL,
65 X PrimeScript Buffer 4fiL ，
40U/VL的RNase Inhibitor 0.5 pL ， 200U/|iL的PrimeScript RTase 1 ，
RnasefreeH20 4.5|aL; ④在5(TC下保温1小时；
若步骤①中使用Random Primer时，需先在30'C保温10min，然后再在50 'C下保温1小时；
⑤7(TC保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合 成；以cDNA第一条链为模板，以P1， P2为上下游引物扩增出6g/基因 引物P1: 5 ，-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC曙3' 引物P2: 5，- ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3' PCR反应在50iiL体系中进行5xPCR缓冲液5fiL，2.5 mmol/L dNTPs 4 |iL， 10pmol/L上下游引物各1.5 pL，模板DNA2mL， Taq酶0.5 |iL，加双蒸水至总 体系50 ^L;
PCR反应条件为在95'C变性5min后开始循环，然后95'C变性45s， 58 。C退火45s， 72。C延伸3min，共30个循环后，再于72 °。延伸10min，扩增得 到PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化 大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37°C 培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 10h后提取质粒，将此质粒进行 序列测定；
(3) 6g〃pPIC9K质粒的构建 用于构建重组质粒的表达载体是pPIC9K，带有"-Factor信号肽，将pPIC
9K质粒和扩增的6g/基因进行A^I和五co及I酶切，酶切产物割胶回收后，再用 T4连接酶16。C连接过夜，连接产物转化Eco/z'JM109感受态细胞，经37。C培养 过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒， 得到富集的6gZ/pPIC 9K质粒；
(4) 毕赤酵母KM71转化和筛选重组菌
将质粒6g〃pPIC 9K 17 nL， 10xH buffer 2 ^L，万g/ II 1 (iL， 37。C酶切1.5 h 后回收含有目的基因的条带，溶于20pL无菌水中，得到线性化的DNA;
在80nL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2pL线性化的DNA，混匀，转 入lmm预冷的电转杯中，电击，转化物中加入lmLlmol/L的山梨醇，30。C温 育lh，取200nL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30'C培养72小时；挑取回复 突变菌株接种于YPD/G418平板上，30'C培养48 h至长出单菌落，为获得多拷 贝的6g/基因的重组菌，G418浓度筛选梯度依次为0.5 mg/mL、 1 mg/mL、 2
7pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照； (5 )重组毕赤酵母KM 71/6g〃pPIC 9K的PCR鉴定
选取含1 mg/mLG418的YPD/G418上单菌落，以引物P1、 P2作引物，用 前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到6g/全基因；重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM 71/Z>g//pPIC 9K用于后续实验；
(6) 重组毕赤酵母{^71/^/* 1€9&的培养
将鉴定正确的单菌落KM 71/6g〃pPIC 9K接种至5 mL YPD培养基， 200r/min， 30 。C培养16 h;以10%的接种量接入装50rnL BMGY培养基的250mL 三角瓶中，30 。C培养24 h，离心收集全部菌体；转入50mL BMMY培养基的 250mL三角瓶中，3tTC，培养120h，在该培养阶段中每24h补加0.5%的甲醇， 并取样200 pL，用于SDS-PAGE检测；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K 培养方法同上；
(7) 重组(3-葡萄糖苷酶的转苷检测
步骤(6)所取表达产物样品进行SDS-PAGE检测，表达产物在12kDa应有 条带；收集步骤(6)的重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓縮，硫酸铵沉 淀，透析，制成BGL粗酶液；
检验转苷活性如下用pH4.5的醋酸缓冲液配制50%的葡萄糖溶液10 mL， 加入400pLBGL粗酶液，50。C反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC 以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成。
所述P-葡萄糖苷酶的应用，用于龙胆低聚糖的制备
(a) (3-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化
底物葡萄糖质量浓度为80%， pH4.5， P-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖 60U，添加lmmol/L的K+，转化温度为60°C ，转化时间为48h;
(b) 龙胆低聚糖的分离精制
将步骤(b)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在3(TC下用带有保温夹 套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。
本发明的有益效果本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成6g/基因 SEQ ID NO:l， 6g/的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母为表达宿 主，实现6g/基因在胞外的可溶性表达；Z^/的cDNA全长2523个核苷酸，编码 841个氨基酸，真核表达质粒6g//pPIC9K构建成功后，转化P / ostoA KM71可 表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优 化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精致，达到较好的 效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整 肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。
图1重组BGL酶SDS-PAGE图谱。图中泳道1:重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱；图中泳道M:蛋白质分子量标准；图中泳 道2:重组毕赤酵母KM 71/6g//pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱。
图2重组BGL酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的HPLC图谱。
具体实施例方式
实施例1:本实施例说明黑曲霉WX-07总RNA的提取。 黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓 冲液清洗菌体一次，加入lmL TRI REAGENT (购于Sigma公司)，用移液枪反 复吹吸以裂解细胞；12，000xg、 4'C离心lOmin以移除不溶物；将上清转移到一 个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s， 在室温下放置10min，12,000xg、 4"C离心15min，取上层无色水相于一干净的 离心管，加入500^iL异丙醇，混匀，在室温下放置10min， 12,000xg, 4'C离心 10min，弃上清，加入lmL由DEPC-H20 (购于宝生物工程有限公司)配制的 质量浓度75%乙醇，漩涡混匀，然后12，000xg、 4。C离心5min，弃上清，让RNA 自然干燥10min，加40nLDEPC-H2O溶解RNA沉淀，为模板RNA， -2(TC保存； 实施例2:本实施例说明P-葡萄糖苷酶编码基因的克隆。 以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下 PrimeScriptRTase 、 5 XPrimeScript Buffer 、 RNase Inhibitor、 dNTP Mixture 、 Oligo dT Primer 、 Random 6mers、 Rnase free H20均来自于试剂盒"PrimeScriptTMlst Strand cDNA Synthesis Kit"，购于宝生物工程有限公司)， ①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液
50|xM的Oligo dT Primer或 Random 6mers ljxL,
10mM的dNTP Mixture 1 ，
总RNA l吗，
和Rnase free H20 添加至总体系10pL;
② 65"C保温5min后冰上急冷；
③ 在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液
步骤①配制的RNA/Primer混合液 10^L，
5 X PrimeScript Buffer 4|iL ，
40U/|xL的RNase Inhibitor 0.5pL，
200U/(iL的PrimeScript RTase 1 joL ，
Rnase free H20 4,5(oL; 在5(TC下保温1小时；
若步骤①中使用Random Primer时，需先在3(TC保温10min，然后再在50
9'C下保温1小时;
7(TC保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合 成；以cDNA第一条链为模板，以P1， P2为上下游引物扩增出6g/基因 引物P1: 5 ，-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3' 引物P2: 5 ，- ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3' PCR反应在50pL体系中进行5xPCR缓冲液5|iL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 jiL， 10|imol/L上下游引物各1.5pL，模板DNA2^iL， Taq酶0.5iiL，加双蒸水至总 体系50 nL;
PCR反应条件为在95'C变性5min后开始循环，然后95"C变性45s， 58 。C退火45s， 72"C延伸3min，共30个循环后，再于72 。C延伸10min，扩增得 到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物 转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经 37匸培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 10h后提取质粒，将此质粒
进行序列测定；
实施例3:本实施例说明6g/基因在表达载体上的构建。 用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有"-i^tor信号肽，将pPIC 9K 质粒和扩增的Z)g/基因进行7Vort和&oi I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4 连接酶16。C连接过夜，连接产物转化五.co"JM109感受态细胞，经37。C培养过 夜，挑选转化子于100 mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得 到富集的6g//pPIC 9K质粒。
实施例4:本实施例说明毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌。 将表达载体6g〃pPIC 9K 17 (4L ， 10xHbuffer 2 |iL ，」8g/H 1 ^L， 37 。C酶 切1.5 h后回收含有目的基因的条带，溶于20 无菌水中，得到线性化的DNA;
在80pL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2 pL线性化的DNA，混匀，转 入1 mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入lmL lmol/L的山梨醇，30 °C温育lh，取200 (oL的山梨醇重悬液涂布MD平板， 30 。C培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30 。C培养48 h至长出单菌落，为获得多拷贝的6g/基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5 mg/mL、 1 mg/mL、 2 mg/mL;
pPIC9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照。 实施例5:本实施例说明重组P-葡萄糖苷酶的转苷检测。 SDS-PAGE检测表达产物在12kDa有条带。收集重组毕赤酵母发酵培养的 上清液经PEG浓縮，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验转苷活性如下用 pH4.5的醋酸缓冲液配制50。/。的葡萄糖溶液10mL， 400 pL粗酶液，50 。C反应 24 h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成；
HPLC条件示差折光检测器，色谱柱HypersilNH2， 250 mm X 4. 6 mm;
柱温30 。C;池温(检测器)30 °C;流动相76%乙腈；流速lmL/min; 进样量5(aL。
质谱条件离子方式ESI-、 ESI+，离子源温度100°C，脱溶剂气温度 250°C，质量范围100—800 m/z，选择离子ESI+: 365.5Da; ESI-:341.4Da， 光电倍增器电压650 Volts， Analyser Vacuum: 2.6e-5mBar， Gas Flow: 4.21it/hr。
实施例6
重组卩-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化龙胆低聚糖的分离精制 通过对龙胆低聚糖酶法生产的关键条件的考察，确定最佳条件当底物葡
萄糖浓度为80%,反应pH4.5，温度为6(TC，加酶量为每克葡萄糖60U,添加 lmmol/L的K+，转化周期为48h;将酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，用带有保 温夹套的16mmX500mm树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02(钙型)进行分离提 纯进样量5mL，温度30 °C，以水为洗脱剂，洗脱速度lmL/min。
ii序
列
表
<210> SEQIDNO:l
<211> 2523
<212> DNA
<213> 黑曲霉(^^erg/〃w "/ge" WX-07
<400> 1
gatgaattggcctsctcccc3CCgt3tt3CCC3tCCCCttgggccaatggccsgggcgsc60
tgggcgcsggcatsccsgcgcgctgttgatsttgtctcgcgg3tg3g33g120
gtcaatctgaccacaggaactgg3tggg33ttgg33ctstgtgttggtc3gsctggcggt180
gttccccg3ttgggsgttccggg33tgtgttt3caggstsgccctctgggcgttcgcgac240
tccgsct3C3actctgctttccctgccggcstgs3cgtggctgcgscctg300
ctggcataccttcgcggc33ggctstgggtcaggaatttagtgsc33gggtgccgatatc360
caattgggtccsgctgccggccctctcggt3g33gtcccg3cggtggtcg420
ggcttctccccsgsccctgccctssgtggtgtgctctttgccgagsccstC33gggt3tc彻
caagatgctggtgtggttgcgscggctssgC3ctsc3ttgcttacgsgcsagagcatttc540
cgtcsggcgcctg33gccc3sggttttggsttt33t3tttccgsgsgtgg3sgtgcgssc600
ctcg3tg3tscgsgctgtacctctggcccttcgcggstgccaitccgtgc3660
ggtgctggcgctgtgstgtgCtCCtSC33C3C3gttstggctgccsg33C720
3gct3C3CtCgctcasggccgsgctgggcttccagggctttgtcstgsgt780
gattgggctgctcsccstgctggtgtgagtggtgctttggcsggsttggststgtctstg840
ccsggsgscgtcgactacgaC3gtggtscgtcttsctggggtsc333Cttgsccsttagc900
gtgctcaacggsscggtgcccc3atggcgtgttgatgac3tggctgtccgcstcatggcc960
gcctactsca3ggtcggccgtgaiccgtctgtggactcctccc33cttcsgctc3tggscc1020
agagatgaatgt3Ct3Ct3Cgtgtcggaggg3ccgtscgaig33ggtc33c1080
cagtscgtga3tgtgc3scgC33CC3C3gCgaactgsttcgccgcsttgg3gcggsc3gc1140
3cggtgctcccggcgctctgcctttgsctggtaaggagcgcctggtcgcg1200
cttstcggagaagatgcgggCtCC33CCCttstggtgcc33cggctgcsgtg3ccgtgga1260
tgcgsc33tggsaic3ttggcgstgggctggggasgtggt3ctgccsscttccc3t3cctg1320
gtgscccccg3gc3ggcc3tctc333cg3ggtgcttssgctgt3ttC3CC1380
gccaccgsts3ctgggctstcgstcsgsttgaiggcgcttgct33g3ccgccsgtgtctctl楊
cttgtctttgtc33cgccg3ctctggtgsgggttacatcsstgtggscgg333cctgggt1500
gaccgcsgg33CCtg3CCCtgtggsgg33cggcg3tsatgtgstc33ggctgctgct3gc1560
3C3C33tcgttgtcsttcsctctgtcggsccsgtcttggtt3scgsgtgg1620
tacgacaacccc33tgttsccgctstcctctggggtggtttgcccggtcaiggsgtctggc1680
aactctcttgccgscgtcctctstggccgtgtcssccccggtgcc33gtcgcccttt3cc1740
tggggc3sgsctcgtgsggcCt3CC33g3Ctscttggtcaccg3gcccs31800
ggagcccctc3gg3sgsctttgtcgsgggcgtcttcsttg3Ctaccgtggatttgscaag1860
ccccg3tct3cgsgttcggct3tggtctgsgct3C3CC3CtttC33Ct3C1920
tcgasccttg3ggtgcsggtgctgsgcgcccctgcstaicgsgcctgcttcgggtgsgscc1980
gsggcsgcgcC33ccttcgg3gsggttggs33tgcgtcggattacctct3ccccsgcggs2040
ttgctgagsstt3CC33gttC3tCt3CCCCtggctcsscggt3ccg3tctcgsggCstct2100
tccggggstgctsgctscgggc3ggsctcctccgsctstcttcccgsggg3gccsccgat2160
12<formula>formula see original document page 13</formula>Met Cys Ser Tyr
Ser Tyr Thr Leu
Gly Phe Val Met
Gly Ala Leu Ala
Tyr Asp Ser Gly
Val Leu Asn Gly
Val Arg lie Met
Trp Thr Pro Pro
Tyr Lys Tyr Tyr
Gin Tyr Val Asn
lie Gly Ala Asp
Pro Leu Thr Gly
Ala Gly Ser Asn
Cys Asp Asn Gly
Asn Phe Pro Tyr
Val Leu Lys His
Ala lie Asp Gin
Leu Val Phe Val
Asp Gly Gly A印 lie Val Tyr Asp
Asn Leu Asn Vsl Val lie Asn Pro
Asn Gin lie Asn Asn Ser
230 235
Asn Lys Leu Leu Lys Ala
245 250
Ser Asp Trp Ala Ala His
260 265
Gly Leu Asp Met Ser Met
275 280
Thr Ser Tyr Trp Gly Thr
290 295
Thr Val Pro Gin Trp Arg
305 310
Ala Ala Tyr Tyr Lys Val
320 325
Asn Phe Ser Ser Trp Thr
335 340
Tyr Val Ser Glu Gly Pro
350 355
Val Gin Arg Asn His Ser
365 370
Ser Thr Val Leu Leu Lys
380 385
Lys Glu Arg Leu Val Ala
395 400
Pro Tyr Gly Ala Asn Gly
410 415
Thr Leu Ala Met Gly Trp
425 430
Leu Val Thr Pro Glu Gin
440 445
Lys Asn Gly Val Phe Thr
455 460
lie Glu Ala Leu Ala Lys
470 475
Asn Ala Asp Ser Gly Glu
485 490
Gly Asp Arg Arg Asn Leu
500 505
lie Lys Ala Ala Ala Ser
515 520
His Ser Val Gly Pro Val
530 535
Asn Val Thr Ala lie Leu
545 550
Tyr Gly Cys Gin Asn 240
Glu Leu Gly Phe Gin 255
His Ala Gly Val Ser 270
Pro Gly Asp Val Asp 285
Asn Leu Thr lie Ser 300
Val Asp Asp Met Ala 315
Gly 'Arg Asp Arg Leu 330
Arg Asp Glu Tyr Gly 345
Tyr Glu Lys Val Asn 360
Glu Leu lie Arg Arg 375
Asn Asp Gly Ala Leu 390
Leu lie Gly Glu Asp 405
Cys Ser Asp Arg Gly 420
Gly Ser Gly Thr Ala 435
Ala lie Ser Asn Glu 450
Ala Thr Asp Asn Trp 465
Thr Ala Ser Val Ser 480
Gly Tyr lie Asn Val 495
Thr Leu Trp Arg Asn 510
Asn Cys Asn Asn Thr 525
Leu Val Asn Glu Trp 540
Trp Gly Gly Leu Pro 555Gly Gin Glu Ser Gly 560
Val Asn Pro Gly Ala 575
Glu Ala Tyr Gin Asp 590
Gly Ala Pro Gin Glu 605
Arg Gly Phe Asp Lys 620
Tyr Gly Leu Ser Tyr 635
Gin Val Leu Ser Ala 650
Glu Ala Ala Pro Thr 665
Leu Tyr Pro Ser Gly 680
Trp Leu Asn Gly Thr 695
Tyr Gly Gin Asp Ser 710
Gly Ser Ala Gin Pro 725
Asn Pro Arg Leu Tyr 740
Lys Asn Thr Gly Lys 755
Val Ser Leu Gly Gly 770
Phe Glu Arg lie Thr 785
Thr Thr Leu Thr Arg 簡
Gin Asp Trp Glu lie 815
Ser Ser Ser Arg Lys 830
His 841
Asn Ser Leu Ala Asp 565
Lys Ser Pro Phe Thr 580
Tyr Leu Val Thr Glu 595
Asp Phe Val Glu Gly 610
Arg Asn Glu Thr Pro 625
Thr Thr Phe Asn Tyr 640
Pro Ala Tyr Glu Pro 655
Phe Gly Glu Val Gly 670
Leu Leu Arg lie Thr 685
Asp Leu Glu Ala Ser 700
Ser Asp Tyr Leu Pro 715
lie Leu Pro Ala Gly 730
Asp Glu Leu lie Arg 745
Val Ala Gly Asp Glu 760
Pro Asn Glu Pro Lys 775
Leu Gin Pro Ser Glu 790
Arg Asp Leu Ala Asn 805
Thr Ser Tyr Pro Lys 820
Leu Pro Leu Arg Ala 835
Val Leu Tyr Gly Arg 570
Trp Gly Lys Thr Arg 585
Pro Asn Asn Gly Asn 600
Val Phe lie Asp Tyr 615
lie Tyr Glu Phe Gly 630
Ser Asn Leu Glu Val 645
Ala Ser Gly Glu Thr 660
Asn Ala Ser Asp Tyr 675
Lys Phe lie Tyr Pro 690
Ser Gly Asp Ala Ser 705
Glu Gly Ala Thr Asp 720
Gly Gly Pro Gly Gly 735
Val Ser Val Thr lie 750
Veil Pro Gin Leu Tyr 765
lie Val Leu Arg Gin 780
Glu Thr Lys Trp Ser 795
Trp Asn Val Glu Lys 810
Met Val Phe Val Gly 825
Ser teu Pro lie Val 840
<210> SEQIDNO:
<400> 3
15P1: 5 ，-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC國3' P2: 5 ，画ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG國3 ，
1权利要求
1、一种β-葡萄糖苷酶，缩写为BGL酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2、 一种编码权利要求l所述的P-葡萄糖苷酶的基因，縮写为6g/基因，其 核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3、 一种如权利要求2所述的e-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达方法，其特征 是由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成6g/的cDNA SEQ ID NO: 1 ， 6g/基因以 质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现6g/基因的可溶 性表达；(1) 黑曲霉WX-07总RNA的提取黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓 冲液清洗菌体一次，加入lmLTRIREAGENT,用移液枪反复吹吸以裂解细胞； 12，000xg、 4'C离心10min以移除不溶物；将上清转移到一个干净的离心管，将 样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min， 12,000xg、 4"C离心15min;取上层无色水相于一干净的离心管，加入500pL异 丙醇，混匀，在室温下放置10min， 12，000xg、 4'C离心10min，弃上清；加入 lmL由DEPC-H20配制的质量浓度75%乙醇，漩涡混匀，然后12,000xg、 4°C 离心5min，弃上清；让RNA自然干燥10min，加40^iL DEPC-H20溶解RNA沉 淀，为模板RNA， -2(TC保存；(2) e-葡萄糖苷酶编码基因的克隆以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链， ①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液50|_iM的Oligo dT Primer或 Random 6mers lpL，10mM的dNTP Mixture 1 pL ， 总RNA l昭，和Rnase free H20 添加至总体系10|iL;② 65"C保温5min后冰上急冷；③ 在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液步骤①配制的RNA/Primer混合液 10pL ，5 X PrimeScript Buffer 4(jL ，40U/^iL的RNase Inhibitor 0.5pL,200U/pL的PrimeScript RTase 1 ，Rnase free H20 4,5(xL;④ 在50'C下保温1小时；若步骤①中使用Random Primer时，需先在3(TC保温10min，然后再在50 "C下保温1小时；⑤7(TC保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合 成；以cDNA第一条链为模板，以P1， P2为上下游引物扩增出Z)g/基因 引物P1: 5 ，-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3' 引物P2: 5，- ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3' PCR反应在50pL体系中进行5xPCR缓冲液5pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 (iL， 10(imol/L上下游引物各1.5 |iL，模板DNA2^L， Taq酶0.5 ^L，加双蒸水至总 体系50 nL;PCR反应条件为在95。C变性5min后开始循环，然后95'C变性45s， 58 r退火45s, 72。C延伸3min，共30个循环后，再于72 。C延伸10min，扩增得 到PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化 大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37°C 培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 10h后提取质粒，将此质粒进行 序列测定；(3 ) 6g〃pPIC 9K质粒的构建用于构建重组质粒的表达载体是pPIC9K，带有"-i^c欣信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的6g/基因进行A^I和五co/2I酶切，酶切产物割胶回收后，再用 T4连接酶16'C连接过夜，连接产物转化五.co/z'JM109感受态细胞，经37'C培养 过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒， 得到富集的6g//pPIC 9K质粒；(4)毕赤酵母KM71转化和筛选重组菌将质粒Z g〃pPIC 9K 17 iaL， 10xH buffer 2 ^L， 5g/ II 1 ^L， 37。C酶切1.5 h 后回收含有目的基因的条带，溶于20pL无菌水中，得到线性化的DNA;在80pL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2 线性化的DNA，混匀，转 入lmm预冷的电转杯中，电击，转化物中加入lmLlmol/L的山梨醇，3(TC温 育lh，取200nL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30。C培养72小时；挑取回复 突变菌株接种于YPD/G418平板上，3(TC培养48 h至长出单菌落，为获得多拷 贝的基因的重组菌，G418浓度筛选梯度依次为0.5 mg/mL、 1 mg/mL、 2 mg/mL;pPIC9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照； (5 )重组毕赤酵母KM 71/6g〃pPIC 9K的PCR鉴定选取含1 mg/mLG418的YPD/G418上单菌落，以引物P1、 P2作弓i物，用 前述的PCR方法,检验是否能够扩增得到6g/全基因；重组毕赤酵母KM 71/pPIC 9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM 71/6g//pPIC 9K用于后续实验；(6) 重组毕赤酵母,71/^//^^9]<:的培养将鉴定正确的单菌落KM 71/6g//pPIC 9K接种至5 mL YPD培养基，200r/min、 30 。C培养16 h;以10%的接种量接入装50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30 。C培养24 h，离心收集全部菌体；转入50mL BMMY培养基的250mL三角瓶中，30°C、培养120h，在该培养阶段中每24h补加0.5%的甲醇，并取样200 pL,用于SDS-PAGE检测；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；(7) 重组P-葡萄糖苷酶的转苷检测步骤(6)所取表达产物样品进行SDS-PAGE检测，表达产物在12kDa应有条带；收集步骤(6)的重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓縮，硫酸铵沉淀，透析，制成BGL粗酶液；检验转苷活性如下用pH4.5的醋酸缓冲液配制50%的葡萄糖溶液10 mL，加入400pLBGL粗酶液，50。C反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成。
4、 一种权利要求l所述P-葡萄糖苷酶的应用，其特征是用于龙胆低聚糖的制备(a) (3-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化底物葡萄糖质量浓度为80%， pH4.5，卩-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖60U，添加lmmol/L的K+,转化温度为6(TC，转化时间为48h;(b) 龙胆低聚糖的分离精制将步骤(a)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在3(TC下用带有保温夹套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。
全文摘要
一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因(bgl)SEQ ID NO1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的bgl/pPIC9K转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精制，达到较好效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。
文档编号C12N9/24GK101492661SQ20091002905
公开日2009年7月29日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者刘玲玲, 敬 吴, 坚 陈 申请人:江南大学