专利名称：禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物法拆分制备手性环氧氯丙垸(epichlorohydrin,ECH)的方法， 具体涉及一种禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体中的应用方法。
背景技术：
手性环氧氯丙烷是一种重要的手性医药中间体，如p-受体阻断剂、L-肉碱、利萘唑 酮等多种手性药物的合成均源自手性环氧氯丙垸。另外，铁电液晶的合成也是以其作为 原料。手性环氧氯丙烷分别指(S)-环氧氯丙烷和(R)-环氧氯丙烷，它们两者通常是以外消
旋体的混合形式存在，其化学结构式为
(R)-环氧氯丙垸 (S)-环氧氯丙烷 现有技术可以把手性环氧氯丙垸的制备方法主要分为三类直接合成法、外消旋体 化学拆分法以及生物法。
直接合成法主要应用于上世纪80年代至90年代，由于其工艺路线过长，过程繁琐，
反应副产物也较多，目前已经罕被使用。
化学拆分法是目前最常用的一种手性环氧氯丙垸制备方法。化学拆分剂主要是利用
一种salen催化剂，它由salen配体和与之络合的金属两部分构成。该方法具有生产工艺 简单，拆分效率高等优点，但是由于salen催化剂使用的与之络合的金属多为钴等重金 属元素，对环境存在一定的污染。例如，每生产1吨的手性环氧氯丙垸，就要产生2吨 以上的含钴等重金属废料，对环境的污染严重。
近年来，以酶作为催化剂制备手性环氧氯丙烷的生物法引起了人们的广泛关注。生
物法由于其具有高度的立体选择性、来源广泛、生产成本低及绿色环保等优点，己经成 为了当前不对称合成手性环氧氯丙垸的主要方法之一。手性环氧氯丙烷的生物法主要可 以分为如下几种方法
A、通过拆分成手性2,3-二氯-1-丙醇来制备手性环氧氯丙垸
1989年，Nakayama等人(JP 01047397)利用从假单胞菌(i^ewJowo朋;y sp.)或者 动物脏器中分离得到的脂酶(Lipase)作为生物催化剂，催化三丁酸甘油酯和外消旋的
32,3-二氯-1-丙醇的反应，生成(S)-2，3-二氯-l-丙醇和(R)-丁酸-2,3-二氯-l-丙酯。其中 (S)-2,3-二氯-l-丙醇可以和碱反应合成手性环氧氯丙烷。
2,3-氯-1-丙醇
O O
三丁酸甘油酯
Lip3se
(S)-2,3-氯-1-丙醇 (R)-丁酸-2,3"二氯-1-丙酯
NaOH < \ 户，
OH -L>^/CI
CI
(S)-2,3-氯-1-丙醇 (R)-环氧氯丙垸 Kasai课题组(Agriculture Biology Chemistry, 1990， 54(12): 3185 3190; JP 02257895; Journal of Industrial Microbiology, 1992， 9: 97 101)禾!j用 一株子叚单胞菌(Pjewcsfowoww sp. 03《-29)立体选择性地在外消旋的2,3-二氯-1-丙醇中降解掉其11型对映体，生成(8)-2，3-二氯-l-丙醇；此外，该课题组又利用一株产碱杆菌"/c"/扭w^ sp. DS-K-S38)降解掉 其S型对映体，生成(R)-2，3-二氯-l-丙醇(Journal of Industrial Microbiology, 1992,10: 37 43; JP 06211822; Tweede Reeks, 1997， 98: 203 213)。但是，Kasai课题组的方法原料
消耗大，有70%的底物被微生物吸收，下游分离工艺复杂，不适合工业化应用。
ci
NaOH O.
2，3-氯-1-丙醇 ％
L>、/Cl (s)-环氧氯丙垸
(S)-2,3-氯-1-丙醇
(R)-环氧氯丙烷
B、以1，3-二氯-2-丙醇为原料直接制备手性环氧氯丙烷
1993年，日本的Fujio (JP 05219965)利用金杆菌"wm 6a"m'ww DH095)以1,3-二氯-2-丙醇作为底物生成了(R)-环氧氯丙垸；1998年，Yumine等人(JP 10210981)把 土壤杆菌UgroZ)a"m'wmra^o6ac&rDH094)中的卤醇环氧化酶基因导入大肠杆菌中表 达，并用该酶将1，3-二氯-2-丙醇进行立体选择性降解，制得了(S)-环氧氯丙烷；同年， Assis等人(Enzyme and Microbial Technology, 1998， 22: 545 551)发现节杆菌 "W/zraZ)"c加肌YM HlOa)能够产生脱卤酶来对1,3-二氯-2-丙醇进行手性拆分，生成
4(R)-环氧氯丙烷c
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C、通过脱卤酶手性拆分外消旋2,3-二氯-l-丙醇
1999年，Spelberg等人(Tetrahedron: Asymmetry, 1999， 10: 2863 2870; EP 1158054) 发现了土壤杆菌Ugra6"c敏/ww AD1)产生的卤醇脱卤酶能够脱去(11)-2,3-
二氯-l-丙醇分子上的氯原子，生成(S)-环氧氯丙垸和(S)-2，3-二氯-l-丙醇；到了 2004年， 该课题组(Tetrahedron: Asymmetry, 2004， 15: 1095 1102 )在这株土壤杆菌 "gro6acfen'wnraWo6acfef AD 1)进行拆分反应的同时，向反应体系中加入了 Nf离子， 成功地实现了环氧氯丙垸的动态动力学拆分，将另一个非目标对映体经酶催化后消旋 化，大大提高了原料的利用率，节约了生产成本。
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D、通过环氧水解酶(epoxide hydrolase)手性拆分外消旋环氧氯丙垸 1991年，Weijers (Enzyme and Microbial Technology, 1991， 13:306 308)筛选出一 株诺卡氏菌(M^aW&H8)，可以直接对外消旋环氧氯丙垸进行手性拆分，在水解掉(S)-环氧氯丙垸之后，得到(R)-环氧氯丙烷对映体，该工艺简单快捷，但最终的(R)-环氧氯 丙烷产率只有19%;次年，Wistuba等人(Chirality， 1992， 4: 178 184)用鼠肝酶微粒体 作为生物催化剂对一系列环氧化物进行了拆分测试，其中对环氧氯丙烷的立体选择性不 强，所得(S)-环氧氯丙垸的e.e.o/。仅有90%，同时由于鼠肝的来源稀少，故该方法成本较 高；1994年，Matsui等人(JP 06261786)用一株节杆菌U";yokzc^" rw6e//^ ATCC 21495) 产的对外消旋环氧氯丙垸进行了拆分，得到(S)-环氧氯丙烷，但是其e.e.M仅有47.0^; 1996年，该课题组(JP 08256791; JP 08256792)又用分枝杆菌(Afyco6a"en'"m sp. E-l-71-2)来拆分，得到(S)-环氧氯丙垸，其e.e.Q/。提高到了 91.2%; 1997年，Weijers课 题组(Tetrahedron: Asymmetry, 1997， 8(4): 639 647)报道了胶红酵母(及/wJo/on//" g/W/"&CIMW147)也具有拆分功能，但是由于其产酶量较低，故拆分效果并不理想， 最终生成的(R)-环氧氯丙垸的产率只有10%; 1998年，韩国的Lee课题组(Biotechnology Techniques, 1998， 12(3): 225 228)首先用一株黑曲霉(A;^g/〃w;y w/g^)对几种环氧化物进行了拆分，其中得到(S)-环氧氯丙垸的e.e，/。仅有24。/。；次年，该课题组(Journal of Bioscience and Bioengineering， 1999, 88(3): 339 341)研究表明，该黑曲霉在多种有机溶 剂中也会显现出生物活性，在有机体系中的反应可以抑制底物环氧氯丙垸的无立体选择 性地自发水解，最终生成(S)-环氧氯丙垸虽然e.e.y。达到100%，但是其产率最高只有 18%; 2004年，该课题组(BiotechnologyandBioprocessEngineering, 2004, 9:62 64; Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2007， 13(1): 159 162)将胶红酵母 (及/wJwon^ g/w加&)的中的环氧水解酶基因导入到毕赤酵母(户/c/ /" Pastors)中表 达，增大了环氧水解酶的产量，虽然没有向反应体系中加入有机溶剂，但是由于拆分效 率的提高，反应时间很短，环氧氯丙烷的自发水解可以忽略；同年，他们发现(Kongop Hwahak, 2004,15(1): 150 152)在重组体的冻干过程中加入吐温20，会让拆分反应的速 率提高2.5倍，立体选择性提高1.9倍，最终得到(R)-环氧氯丙烷的产率提高到了 76%; 该课题组(KongopHwahak,2004， 15(5): 528 532)还将胶红酵母(i^offotora/ag/wri"")
的环氧水解酶的基因导入到大肠杆菌(Esc/^7'cr似flC0//.)中，并利用表面活性剂提高了
产率达到34%; 丁奎岭等人(ZL 200510023852.3)用从微生物中分离得到的环氧水解 酶ECU1001和ECU1040分别拆分得到了(S)-环氧氯丙烷和(R)-环氧氯丙烷，在反应过程 中引入相转移催化剂构建微水体系，最终得到手性环氧氯丙垸的收率达到40%, e.e.% 达到99%。
OH
环氧氯丙烷
1-
epoxide hydrolase
0\ ， (S)-环氧氯丙垸 (R)-3-氯-1,2-丙二醇
0\ QH (R)-环氧氯丙烷 (S)-3-氯-1,2-丙二醇
综合上述几种生物拆分方法，目前外消旋环氧氯丙烷的市场价格最低，因此以外消 旋体作为原料进行手性环氧氯丙垸的制备具有较强的市场竞争力。但是，现有技术中均 是利用微生物发酵所产生的环氧水解酶来进行手性拆分且，微生物需要诱导才能产生环 氧水解酶，加之环氧水解酶的用量较大，而微生物发酵的来源既不方便也不经济；此外， 手性环氧氯丙烷的收率或产率也相对较低。因此，现有技术中利用环氧水解酶制备手性 环氧氯丙烷的应用受到了极大的限制。
发明内容
本发明需要实现的技术目的是提供一种拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体中 的新应用方法，使得该方法可以高效地立体选择性水解外消旋环氧氯丙垸制备其单一对 映体的，以克服现有技术的缺陷。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为
禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体中的应用。
具体的应用方法包括
A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备
将新鲜禽类肝脏组织剔除结缔组织后用捣碎制成匀浆，用冷冻丙酮将匀浆脱水并制 备成冷冻丙酮粉后，再用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，最后将脱脂处理后的冷 冻丙酮粉低温真空干燥、研碎，制备成的干燥丙酮粉即为含有环氧水解酶粗酶制剂；
B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体 将环氧水解酶粗酶制剂按0.1 30 g/L的加入量加入浓度为0.01 25 mol/L的外消
旋环氧氯丙垸底物溶液中，pH3 ll,进行转化反应，反应温度10 80°C，反应时间0.5 150 h，反应结束减压蒸馏，分离得到环氧氯丙烷的手性对映体。
本发明所述的步骤B中的环氧水解酶粗酶制剂的加入量，更佳的加入量为0.5 20
g/L。
本发明所述的步骤B中的外消旋环氧氯丙垸底物溶液浓度，更佳的浓度为0.05 0.5 mol/Lo
本发明所述的步骤B中的pH值，更佳的为pH5 8。 本发明所述的步骤B中的反应温度，更佳的为20 6(TC。 本发明所述的禽类肝脏，包括鸡肝、鸭肝、鹅肝、鸽肝。 本发明的有益效果在于
(1) 以禽类的肝脏组织制备的环氧水解酶粗酶制剂用于拆分外消旋环氧氯丙烷制 备手性对映体，不仅催化剂来源广泛、制备容易，而且诸如鸭肝、鹅肝等家禽肝脏的价 格低廉，制得的酶粗酶制剂稳定性高、易于保存，催化效率高，因此，使用禽类的肝脏 组织制备的环氧水解酶粗酶制剂可大幅度降低手性环氧氯丙烷的生产成本，且得到极高 的酶转化率；
(2) 采用本发明所述的技术方案得到的环氧氯丙垸手性对映体可以通过常规的蒸 馏方法轻易地从酶转化体系中分离，而副产物(R)-3-氯-l,2-丙二醇或(S)-3-氯-l，2-丙二醇
7也具有e.e.。/。在卯％以上的光学纯度，可以利用其制备其它手性药物中间体，因而整个 酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，催化剂价格低廉易得，具有非常良好 的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业和日用化学工业的需要。
具体实施例方式
本发明实施例中所使用的对手性对映体的测定方法为气相色谱法，气相色谱条件:
中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心的ZKAT-Chiral B手性色谱柱， 乙醚作为溶剂，异丙醚作内标，汽化室150'C，柱温10(TC， FID检测器250 。C。 其中，产物手性环氧氯丙烷的转化率的计算方法为
^W， _剩余环氧氯丙垸对映体的摩尔量 —初始环氧氯丙垸对映体的摩尔量
产物手性环氧氯丙垸的e.e.y。的计算方法为
M —風
e.e.%of(R)-ECH =
或者e.e.% of (S)-ECH = Ms - A
其中，M代表手性环氧氯丙垸的摩尔量。
实施例l
A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备
环氧水解酶粗酶制剂的制备将新鲜鸡肝剔除结缔组织，用组织捣碎机粉碎制成匀 浆，用2倍体积的冷冻丙酮(-20°C)将匀浆脱水，过滤去除丙酮，制备成冷冻丙酮粉。 用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于35'C辜空干燥3h，研碎，制备成干燥丙酮 粉。lkg新鲜鸡肝可制备210g干燥丙酮粉，并置于4t:冰箱中冷藏备用。
B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体 将0.0002moL的外消旋环氧氯丙垸溶于20mLpH值为3的乙酸盐缓冲液中，得到
外消旋环氧氯丙垸含量为0.01 mol/L的底物溶液。将该底物溶液置于50 mL具塞锥形瓶 中，加入步骤A中所述的环氧水解酶粗酶制剂0.002 g，塞紧磨口瓶塞，于10 °C、120 r/min 的旋转式水浴摇床上反应0.5h。反应结束后，过滤除去粗酶制剂，在2mmHg压力下分 别80 'C下蒸出(S)-环氧氯丙烷和(R)-3-氯-l，2-丙二醇。用气相色谱测试(R)-环氧氯丙垸的
8转化率为88%,得到(S)-环氧氯丙烷的e.e.e/。为95%。
实施例2
A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备
环氧水解酶粗酶制剂的制备将新鲜鸭肝剔除结缔组织，用组织捣碎机粉碎制成匀 浆，用2倍体积的冷冻丙酮(-2(TC)将匀浆脱水，过滤去除丙酮，制备成冷冻丙酮粉。 用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于4(TC真空干燥4h，研碎，制备成干燥丙酮 粉。lkg新鲜鸡肝可制备220g干燥丙酮粉，并置于4'C冰箱中冷藏备用。
B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体
将0.5 moL的外消旋环氧氯丙垸溶于20 mL pH值为11的甘氨酸一氢氧化钠缓冲液 中，得到外消旋环氧氯丙垸含量为25 mol/L的底物溶液。将该底物溶液置于50 mL具 塞锥形瓶中，加入步骤A中所述的环氧水解酶粗酶制剂0.6g，塞紧磨口瓶塞，于80'C、 120r/min的旋转式水浴摇床上反应150 h。反应结束后，过滤除去粗酶制剂，在2 mmHg 压力下分别80 'C下蒸出(S)-环氧氯丙垸和(R)-3-氯-l，2-丙二醇。用气相色谱测试(R)-环氧 氯丙垸的转化率为99%，得到(S)-环氧氯丙垸的".％为83%。
实施例3
A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备
环氧水解酶粗酶制剂的制备将新鲜鹅肝剔除结缔组织，用组织捣碎机粉碎制成匀 浆，用2倍体积的冷冻丙酮(-20'C)将匀浆脱水，过滤去除丙酮，制备成冷冻丙酮粉。 用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于45'C真空干燥3h，研碎，制备成干燥丙酮 粉。lkg新鲜鸡肝可制备210g干燥丙酮粉，并置于4"C冰箱中冷藏备用。
B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体
将0.001 moL的外消旋环氧氯丙垸溶于20 mL pH值为5的磷酸盐缓冲液中，得到 外消旋环氧氯丙烷含量为0.05 mol/L的底物溶液。将该底物溶液置于50 mL具塞锥形瓶 中，加入步骤A中所述的环氧水解酶粗酶制剂0.01 g，塞紧磨口瓶塞，于20 °C 、 120 r/min 的旋转式水浴摇床上反应80h。反应结束后，过滤除去粗酶制剂，在2mmHg压力下分 别80 'C下蒸出(S)-环氧氯丙烷和(R)-3-氯-l，2-丙二醇。用气相色谱测试(R)-环氧氯丙垸的 转化率为93%，得到(S)-环氧氯丙垸的e.e /。为95%。
9实施例4
A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备
环氧水解酶粗酶制剂的制备将新鲜鸽肝剔除结缔组织，用组织捣碎机粉碎制成匀
浆，用2倍体积的冷冻丙酮(-2(TC)将匀浆脱水，过滤去除丙酮，制备成冷冻丙酮粉。 用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于5(TC真空干燥2h，研碎，制备成干燥丙酮 粉。lkg新鲜鸡肝可制备190g干燥丙酮粉，并置于4。C冰箱中冷藏备用。
B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体-
将0.01 moL的外消旋环氧氯丙烷溶于20 mL pH值为8的磷酸盐缓冲液中，得到外 消旋环氧氯丙烷含量为0.5 mol/L的底物溶液。将该底物溶液置于50 mL具塞锥形瓶中， 加入步骤A中所述的环氧水解酶粗酶制剂0.4g，塞紧磨口瓶塞，于60'C、 120r/min的 旋转式水浴摇床上反应120 h。反应结束后，过滤除去粗酶制剂，在2mmHg压力下分 别80 'C下蒸出(R)-环氧氯丙垸和(S)-3-氯-l,2-丙二醇。用气相色谱测试(S)-环氧氯丙垸的 转化率为91%，得到(R)-环氧氯丙烷的e.e /。为97%。
10
权利要求
1、禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体中的应用。
2、 根据权利要求1所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映 体中的应用，其特征在于所述的具体应用方法为-A、 环氧水解酶粗酶制剂的制备将新鲜禽类肝脏组织剔除结缔组织后用捣碎制成勾浆，用冷冻丙酮将匀浆脱 水并制备成冷冻丙酮粉后，再用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，最后将脱 脂处理后的冷冻丙酮粉低温真空干燥、研碎，制备成的干燥丙酮粉即为含有环氧 水解酶粗酶制剂；B、 利用环氧水解酶粗酶制剂拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映体 将环氧水解酶粗酶制剂按0.1 30 g/L的加入量加入浓度为0.01 25 mol/L的外消旋环氧氯丙烷底物溶液中，pH3 11，反应温度在10 8(TC，进行转化反 应，反应时间0.5 150h，反应结束减压蒸馏，分离得到环氧氯丙烷的手性对映 体。
3、 根据权利要求2所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映 体中的应用，其特征在于所述的步骤B中的环氧水解酶粗酶制剂的加入量为 0.5 20g/L。
4、 根据权利要求2所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙垸制备手性对映 体中的应用，其特征在于所述的步骤B中的外消旋环氧氯丙烷底物溶液的浓度 为0.05 0.5 mol/L。
5、 根据权利要求2所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映 体中的应用，其特征在于所述的步骤B中的pH值为5 8。
6、 根据权利要求2所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映 体中的应用，其特征在于所述的步骤B中的反应温度在20 60'C。
7、 根据权利要求1至6之一所述的禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备 手性对映体中的应用，其特征在于所述的禽类肝脏包括鸡肝、鸭肝、鹅肝、鸽肝。
全文摘要
本发明涉及禽类肝脏在拆分外消旋环氧氯丙烷制备手性对映体中的应用。将新鲜禽类肝脏组织剔除结缔组织后用捣碎制成匀浆，用冷冻丙酮将匀浆脱水并制备成冷冻丙酮粉后，再用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，最后将脱脂处理后的冷冻丙酮粉低温真空干燥、研碎，制备成的干燥丙酮粉即为含有环氧水解酶粗酶制剂；将环氧水解酶粗酶制剂按0.01～30g/L的加入量加入浓度为0.01～25mol/L的外消旋环氧氯丙烷底物溶液中，pH3～11，反应温度在10～80℃，进行转化反应，反应时间0.5～150h，反应结束减压蒸馏，分离得到环氧氯丙烷的手性对映体。本发明的技术方案具有无废弃物产生、无环境污染、禽类肝脏价格低廉易得，生产成本低等优点。
文档编号C12P17/02GK101580863SQ20091003272
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者凌岫泉, 卢定强, 欧阳平凯, 涂清波, 俊 王 申请人:南京工业大学