专利名称：用于检测甲型流感病毒及甲型h1n1流感病毒的核酸纳米金生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核 酸快速检测方法及检测产品。
背景技术：
流行性感冒简称流感，是由甲型、乙型、丙型三种流感病毒引起的急性呼吸道传染 病。其中，甲型流感病毒的宿主最广、危害最大，人、禽、畜都是甲型流感病毒的宿主。根据 其表面结构(血凝素H和神经氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可分成许 多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶有9个亚型 (N1-N9)。2009年从墨西哥爆发并蔓延到全球多个国家的人感染甲型Hmi流感疫情，是由 于一种新变异的甲型Hmi流感病毒引发的，被世界卫生组织称为“国际关注的突发公共卫 生事件”，已达到了最高的6级警告标准。今年流行的甲型Hmi流感是甲型流感病毒中的一个亚型，已经蔓延到世界许多 国家，不足一个月，全球确诊的甲型Hmi流感病例已突破万例，我国也出现了多例输入性 流感病例。给人类生命安全造成了一定危害，包括我国政府在内的世界各国都采取了积极 有效的防控措施，以防止疾病的迅速蔓延。面对突然爆发的流行性疾病，开展对疾病预防、 诊断、致病机理以及治疗研究是相关领域关注和研究的重点。甲型流感病毒是RNA病毒，传统的基因检测技术有Northern杂交、Southern杂 交、Western blotting、PCR等，这些检测方法不仅费时费力，而且特异性差。在过去的十 几年中，实时荧光定量PCR已经发展成为一种重要的基因检测技术，具有高灵敏度和特异 性，但是需要昂贵的仪器及专业人员的操作。近年来兴起的DNA纳米技术是以DNA碱基严 格互补配对的特性为原理，主要应用于分子的组装，产生有功能的组装聚集物。DNA纳米技 术包括基因芯片之外，还有一种是将DNA结合到纳米颗粒上构成纳米颗粒基因探针，通过 与靶DNA之间的互补实现纳米颗粒的组装，这已成为一种新型的DNA检测系统。Mirkin等 运用金纳米颗粒基因探针与合成靶杂交，形成透射电镜下明显的聚集体，可判断合成靶存
(Chad A. Mirkin, R. L. L. , Robert C. Mucic&JgimesJ· Storhoff Nature 1996,382, 607-609)。Wang等制备金纳米颗粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探针，在玻片上目视化检测 HBV DNA 的多聚酶链反应产物(Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV and HCVbased on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J MedVirol，2003，70 :2052211)。习东等应用 Fe304 (核)/Au (壳)纳米颗粒 HBV DNA基因探针，通过尼龙膜上斑点杂交或液相中杂交研究其在检测HBV DNA中的应用 (Dong Xia, X. L. , Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli Liud Journalof Nanjing Medical University 2007，21，207-212)。但上述检测技术都存在各自的缺点，如Mirkin的 技术需要复杂昂贵的透射电镜，Wang需要昂贵的进口玻片，且需要长时间的预杂交、杂交洗涤过程，习东的检测时需要长时间的复杂的预杂交、杂交、洗膜银染过程，没有技术优点耗 时费力，且都处于试验研究阶段，没有产品化。所以仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作 简易的核酸检测工具。为配合这一研究，研究了能迅速准确检测甲型流感病毒及甲型Hmi 流感病毒的核酸纳米金生物传感器的检测方法及开发了其试剂盒，对于早期大规模筛查及 有效地控制疾病的迅速传播具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒检测技术及产品存 在的问题和不足，提供一种用于快速检测甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒(2009年流行 的新变种)的核酸纳米金生物传感器。本发明所述的一种用于检测甲型流感病毒的核酸纳米金生物传感器，包括从左到 右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳 米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该寡核苷 酸探针包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸 探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一 端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；固 定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。本发明所述的一种用于检测甲型Hmi流感病毒的核酸纳米金生物传感器，包括 从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上 涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该 寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡 核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸 水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸 序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述质控线与检测线相 距3-10mm ；所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼 此重叠l-5mm ；所述胶体金的粒径为8-lOOnm。本发明的另一目的是提供含有本发明所述的核酸纳米金生物传感器的用于检测 甲型流感病毒的试剂盒。根据本发明所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，还包括RT-不对称PCR反应 试剂，包含10倍RT-PCR缓冲液、镁离子、酶混合液、RNA酶抑制剂、上游引物、下游引物；其 中，上游引物含有如SEQ ID N0. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID N0.5所示的 核苷酸序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆转录酶5U/ μ 1以体积比1 1混合组 成。本发明还提供了含有本发明所述的核酸纳米金生物传感器的用于检测甲型Hmi 流感病毒的试剂盒。根据本发明所述的用于检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒，还包括RT_不对称PCR反应试剂，包含10倍RT-PCR缓冲液、镁离子、酶混合液、RNA酶抑制剂、上游引物、下游引 物；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10 所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Taq酶5υ/μ1和逆转录酶5υ/μ1以体积比1 1 混合组成。根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述上游引物与下游引物之间的浓度比 为 10 1-100 1。本发明的另一目的是提供一种甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的检测方法。本发明所述的一种甲型流感病毒的检测方法，包括以下步骤1)病毒RNA的提取a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0. 5ml Trizol，反复震 荡，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37°C下孵化10分钟， 40C 12000rpm下离心15分钟，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的异丙醇，20-37°C下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心
15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75%乙醇洗涤沉淀，4°C 7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使 沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆转录及不对称PCR扩增采用50 μ 1的逆转录及不对称PCR反应体系10倍RT-PCR缓冲液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制剂1 μ 1，镁离子5mM, Taq酶 5U,反转录酶5U，上游引物0.4μΜ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如 SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；反应程序50 V 30分钟，94°C 2分钟，1个循环；94 V 30秒，58 V 20秒，72 °C 30秒， 35个循环；72 °C 7分钟；3)采用核酸纳米金生物传感器对PCR产物的检测及结果分析所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃 纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸 探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID N0. 2所示的核 苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标 记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡 核苷酸探针包含如SEQ IDN0. 3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸 探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；将步骤2所得的PCR产物分别滴加入所述的甲型流感病毒核酸纳米金生物传感器 及甲型Hmi核酸纳米金生物传感器的加样孔中，观察检测线和质控线的情况进行结果分 析检测线和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；质控线出现红色，而检测线未出 现红色，表明被检样品为阴性。本发明所述的一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，包括以下步骤1)病毒RNA的提取
a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0. 5ml Trizol，反复震 荡，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37°C下孵化10分钟， 40C 12000rpm下离心15分钟，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的异丙醇，20_37°C下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心
15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75 %乙醇洗涤沉淀，4°C 7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使 沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆转录及不对称PCR扩增采用50 μ 1的逆转录及不对称PCR反应体系10倍RT-PCR缓冲液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制剂1 μ 1，镁离子5mM，Taq酶 5U,反转录酶5U，上游引物0.4μΜ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如 SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；反应程序50 V 30分钟，94°C 2分钟，1个循环；94 V 30秒，58 V 20秒，72 °C 30秒， 35个循环；72 °C 7分钟；3)采用核酸纳米金生物传感器对PCR产物的检测及结果分析所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃 纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸 探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 7所示的核 苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标 记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡 核苷酸探针包含如SEQ IDN0. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸 探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；将步骤2所得的PCR产物分别滴加入所述的甲型流感病毒核酸纳米金生物传感器 及甲型Hmi核酸纳米金生物传感器的加样孔中，观察检测线和质控线的情况进行结果分 析检测线和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；质控线出现红色，而检测线未出 现红色，表明被检样品为阴性。本发明将表面合成化学、生物化学及物理化学有机结合起来，解决目视化基因检 测技术设计与制造中的关键技术，具体构思如下胶体金是一种带负电的胶体溶液，能与巯基共价结合形成Au-S键，通过寡核苷酸 修饰巯基与胶体金偶联从而形成金标DNA探针；链霉亲合素(SA)是与亲合素(A)有类似生 物学特性的一种蛋白质，是由Sti^ptomyces avidin菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产 物。SA是一种四聚体蛋白，其每个单体通过亲水键和范德华力与一个生物素结合后两者形 成稳定且难断裂的键，因此利用生物素与链霉亲和素间的亲和力，用一个用生物素标记的 探针与链霉亲和素偶联，固定于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；将硝酸纤维素膜、金 标垫、样品垫、吸水纸固定于胶板上，组装成纳米金生物传感器。本发明的技术原理是核酸纳米金生物传感器以夹心DNA杂交为基础，其基本原 理为设计3条DNA探针，DNA探针1和DNA探针2分别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补(图1)。DNA探针1和DNA探针3分别固定在硝 酸纤维素膜的检测线(Test line)和质控线(Control line)上，DNA探针2与胶体金相连， 涂布在金标垫上。当在样品垫上滴加样品(含模板DNA)时，由于毛细作用，模板DNA随样 品液一起向前运动，当到达金标垫时，模板DNA与金标垫上的DNA探针2特异性杂交。杂交 的DNA继续向前移动，当到达检测区域时模板DNA与DNA探针1再次特异性杂交而固定在 检测线上。由于胶体金的光学性质，在检测线上聚集的胶体金颗粒显现出红色的条带，过剩 的胶体金-DNA探针2由于毛细作用继续向前移动，与质控线上的DNA探针3杂交，而在质 控线上出现红色的线。如果样品中没有模板DNA时，检测区域不出现红线，而质控线上出现 红线。因此，质控线出现红色线说明试纸条可用，而检测线出现与否是样品阴性和阳性的标 准。整个检测过程只需要10分钟左右。本发明的优点在于本发明所述的核酸纳米金生物传感器制备简便、检测迅速，病 毒RNA只需要进行逆转录和不对称PCR扩增后，即可获得大量的目标DNA，将上述PCR产物 滴于纳米金生物传感器的加样孔中，约10分钟后即可通过观察检测线及质控线来判断结 果，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备。本发明可用于检测甲型人流感、猪流感、禽 流感等流感病毒RNA，同时可以特异地检测甲型Hmi (2009流行)流感病毒RNA，进行双重 分析使检测结果更加可靠。
图1显示上游引物、下游引物、探针1、探针2和探针3之间的关系。图2显示用于检测甲型流感病毒的纳米金生物传感器检测样品DNA的结果；图2A 自左至右依次为A/ws/33 (HlNl)、A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、甲型 Hmi 样品，图2B为B型流感病毒样品；图3显示用于检测甲型Hmi流感病毒的纳米金生物传感器检测样品DNA的结果； 图 3A 自左至右依次为A/ws/33 (HlNl) ,A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、B 型流 感病毒样品；图3B为B型流感病毒样品。
具体实施例方式实施例一针对甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的特异性引物及探针的设计在NCBI http//www, ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/Database/request, cgi中 查找出所有甲型流感病毒的MP基因片段序列，通过多重比对找出甲型流感病毒的保守区 段。采用Express Primer在其保守片段上设计引物和探针。通过对甲型Hmi (2009流行)的HA基因片段序列，采用Express Primer设计引 物和探针。将所设计的引物与探针与所有病毒序列进行比对，找出变异性最强的引物和探 针。上述甲型HlNl (2009年流行)的全长HA基因序列来源于NCBI (> gi | 2278 09829 IgbIFJ966082. 1|InfluenzaAvirus(A/California/04/2009(HlNl))segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds)设计结果为甲型流感病毒的特异性探针和引物
探针1:5，-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-生物素 _3探针2 :5，-SH-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3，探针3:5，-生物素-TAGACGMTTTGTCCARAATGCCCT-3上游引物GACCRATCCTGTCACCTCTGAC下游引物AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA甲型Hmi流感病毒的特异性探针和引物探针1:5，-TTGCGAATGCATATCTCGGT-生物素-3，探针2 :5，-SH-TGCAATCGTGGACTGGTGTA-3，探针3:5，-生物素-TACACCAGTCCACGATTGCA-3，上游弓丨物AATAACATTCGAAGCAACTGGAA下游引物TGCAATCGTGGACTGGTGTA
’ SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 ’ SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5
SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 10引物、探针及模板DNA三者之间的关系为探针1位于上下游引物之间与所测样品 中模板DNA特异性互补，探针2可与下游引物相同也可位于上下游引物之间，探针3与探针 2特异性互补(图1)。实施例二本发明所述的用于检测甲型流感病毒的核酸纳米金生物传感器的制备1.纳米金(胶体金)的制备在500ML的圆底烧瓶中加入100ml 0. 01%的HAuCL4溶液，边搅拌边加热至沸腾； 向上述溶液中加入2ml 枸橼酸钠，溶液20s内变为蓝色，60s后变为酒红色，继续煮沸 lOmin，停止加热继续搅拌15min ；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度
值鉴定。2.金标寡核苷酸探针的制备用100 μ 1去离子水溶解10D DNA-探针2，加入到5 倍体积浓缩的胶体金溶液中，4°C 24小时；10%的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl 和1 %的SDS，分别至终浓度0. IM和0. 01 %，4°C过夜，12000转/分钟离心30分钟，弃上清， 沉淀用100μ 1含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新悬浮，制成悬浮液。3.金标垫的制备将本发明制备的金标寡核苷酸探针涂于玻璃纤维上，37°C干燥2个小时，制成金 标垫，备用。4.生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定链霉亲和素可以与生物素通过亲水键和范德华力相结合并形成稳定且难断裂的 键，因此本发明采用生物素标记的DNA探针与链霉亲和素混合反应，采用划膜喷金仪涂于 硝酸纤维素膜上。例如，用10 μ 1去离子水溶解10D生物素标记的DNA-探针1，加入5 μ 1 (2mg/ml) 链和亲霉素，室温下反应1小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37°C干燥 两个小时。DNA-探针3采用同样方法固定于质控线上。5.样品垫的处理玻璃纤维浸泡0.25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化钠中 4个小时后，
37 °C烘干备用。6.核酸纳米金生物传感器的组装
将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探 针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得 到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。实施例三本发明所述的用于检测甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸纳米 金生物传感器的试剂盒的制备及检测方法甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸纳米金生物传感器的试剂盒包括如下成 分RT-不对称PCR反应试剂，甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸纳米金生物传 感器；其中所述的RT-不对称PCR反应试剂包括10倍RT-PCR缓冲液150 μ 1、dNTP溶 液150 μ 1、镁离子150 μ 1、酶混合液60 μ 1、RNA酶抑制剂30 μ 1、甲型上游引物30 μ 1、甲 型下游引物30μ 1、甲型Hmi上游引物30μ 1、甲型Hmi下游引物30μ 1 ；其中，用于检测 甲型流感病毒的上游引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；用于检测甲型Hmi流感病毒的上游引物含有如SEQ ID NO. 9所 示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；所述上游引物与下游 引物之间的浓度比为20 1 ；
0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
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0100] 0101] 0102]
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0105]
0106]
0107]
0108] 0109]
所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆转录酶5U/ μ 1以体积比1 1混合组成。 检测甲型流感病毒RT不对称PCR反应液的配制
试剂
IOX缓冲液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制剂 酶混合液
甲型上游引物(20 μ Μ) 甲型下游引物(IuM) RNA提取液 DEPC 水 总体积
检测甲型Hmi流感病 试剂
IOX缓冲液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制剂 酶混合液
甲型HlNl上游引物(20 μ Μ) 甲型HlNl下游引物(ΙμΜ) RNA提取液
使用量μ 1 5 5 10 1 2 1 1
4 21
50 μ 1
RT不对称PCR反应液的配制 使用量μ 1
DEPC 水21总体积50 μ 1确立如下的反应条件50°C30分钟，94°C2分钟，1个循环；94°C 30秒，58°C 20秒， 720C 30秒，35个循环；72°C 7分钟。反应结束后将上述检测甲型流感病毒的PCR产物和检测甲型Hmi流感病毒的PCR 产物分别滴于甲型流感病毒核酸纳米金生物传感器及甲型Hmi流感病毒核酸纳米金生物 传感器的加样孔中，约 ο分钟即可进行结果判断。实施例四本发明所述的检测甲型流感病毒的方法的实验1、毒株及其来源A/ws/33 (HlNl), A/hongkong/8/68 (H3N2)由中科院广州生物医药与健康研究院提 供；A/P2/8/34(HlNl)，B型为临床分离毒株由广州呼吸疾病研究所提供；甲型Hmi由美国 疾病控制及预防中心(⑶C)提供。以上毒株信息可通过http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/FLU/Database/select, cgi ？ go = 1 查找。
0117]2、病毒RNA提取
0118]a)200-400ul样本加入0. 5ml Trizol (咽拭子来源或病毒培养液)，反复震荡，抽 吸以利于细胞裂解，室温下孵化5分钟。
0119]b)加入0. Iml的氯仿并震荡至乳糜化，室温下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心 5分钟，取上清液，转移至另一 1.5ml EP管。
0120]c)加入0. Iml的异丙醇，室温下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心15分钟，去掉
上清液，将管倒置在吸水纸上，稍微风干。
0121]d)加入0. 5ml的75%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤RNA，4°C 7500rpm下离心5 分钟，倒置于吸水纸上，除去上清液后室温下静置5分钟。
0122]e)用DEPC (焦碳酸二乙酯)水20ul溶解RNA。
0123]f)测定 RNA 浓度及 A260/A280。
0124]3、逆转录及不对称PCR扩增
0125]1)取出试剂盒(见实施例三)，于4°C解冻，各试剂于用前1000转/分钟低速离心 分钟待用。
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
2)按下列组份配制RT-不对称PCR反应液(反应液配制应在冰上进行) 检测甲型流感病毒RT不对称PCR反应液的配制 试剂使用量μ 1
5 5 10 1 2 1 1 4 21
IOX缓冲液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制剂 酶混合液 上游引物(20 μ Μ) 下游引物(IuM) RNA提取液 DEPC 水
120138]总体积
0139]检测甲型Hmi流感病毒RT:
0140]试剂
0141]IOX缓冲液
0142]dNTP混合液
0143]MgC12(25mM)
0144]RNA酶抑制剂
0145]酶混合液
0146]甲型Hmi上游引物(20 μ M)
0147]甲型HlNl下游引物(1 μ Μ)
0148]RNA提取液
0149]DEPC 水
0150]总体积
50 μ 1
RT不对称PCR反应液的配制 使用量μ 1
5 5 10
21
50 μ 1 3) RT-不对称PCR反应程序的设置设置PCR反应程序如下50°C 30分钟，94°C 2分钟，1个循环；94°C 30秒，58°C 20 秒，72 0C 30秒，35个循环；72°C 7分钟。4.检测及结果判定将上述PCR产物滴于纳米金生物传感器的样品垫上，约10分钟通过观察T线和C 线的出现情况即可判断结果。质量控制标准1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；3)C线没有出现红色的线，说明纳米生物传感器失效。A/ws/33 (HlNl)，A/hongkong/8/68(H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、甲型 Hmi 流感 病毒，经甲型核酸纳米金生物传感器检测T线、C线均出现红色的线(图2A) ；B型流 感病毒只有C线出现红色的线而T线没有出现红色的线(图2B)。A/ws/33 (HlNl)，A/ hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、B型流感病毒，经甲型Hmi核酸纳米金生物传感 器检测只有C线出现红色的线而T线没有出现红色的线(图3A)；甲型Hmi流感病毒经甲 型Hmi核酸纳米金生物传感器检测T线、C线均出现红色的线(图3B)。试验结果均符合 预期期望。序列表(SEQUENCELISTING)<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院<120>用于检测甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的核酸纳米金生物传感器<130><160>10<170>PatentIn version 3.4 13
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权利要求
一种用于检测甲型流感病毒的核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测甲型Hmi流感病毒的核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括从左 到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶 体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与 链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸 探针包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形 成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ IDN0. 6所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述质控线与检 测线相距3-10mm ；所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻 部分彼此重叠l_5mm ；所述胶体金的粒径为8-lOOnm。
4.含有如权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器的用于检测甲型流感病毒的试剂品.ο
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT-不对称PCR反应试剂，包 含10倍RT-PCR缓冲液、镁离子、酶混合液、RNA酶抑制剂、上游引物、下游引物；其中，上游 引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/μ 1和逆转录酶5U/μ 1以体积比1 1混合组成。
6.含有如权利要求2所述的核酸纳米金生物传感器的用于检测甲型Hmi流感病毒的 试齐U盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT-不对称PCR反应试剂，包 含10倍RT-PCR缓冲液、镁离子、酶混合液、RNA酶抑制剂、上游引物、下游引物；其中，上游 引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆转录酶5U/ μ 1以体积比1 1混合组成。
8.根据权利要求5或7所述的试剂盒，其特征在于所述上游引物与下游引物之间的 浓度比为10 1-100 1。
9.一种甲型流感病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)病毒RNA的提取a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0.5mlTrizol，反复震荡，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37 °C下孵化10分钟， 40C 12000rpm下离心15分钟，取上清液；C)在上清液中加入0. Iml的异丙醇，20-37°C下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心15 分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75 %乙醇洗涤沉淀，4°C 7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使沉淀 干燥，该沉淀为病毒样本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆转录及不对称PCR扩增采用50 μ 1的逆转录及不对称PCR反应体系10倍RT-PCR缓冲液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制剂1 μ 1，镁离子5mM, Taq酶5U， 反转录酶5U,上游引物0. 4 μ Μ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；反应程序50°C 30分钟，94°C 2分钟，1个循环；94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 30秒，35 个循环；72°C 7分钟；3)采用核酸纳米金生物传感器对PCR产物的检测及结果分析所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、 硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶 体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与 链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸 探针包含如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形 成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列；将步骤2所得的PCR产物分别滴加入所述的甲型流感病毒核酸纳米金生物传感器及 甲型Hmi核酸纳米金生物传感器的加样孔中，观察检测线和质控线的情况进行结果分析 检测线和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；质控线出现红色，而检测线未出现红 色，表明被检样品为阴性。
10. 一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)病毒RNA的提取a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0.5mlTrizol，反复震荡，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37 °C下孵化10分钟， 40C 12000rpm下离心15分钟，取上清液；c)在上清液中加入0.Iml的异丙醇，20-37°C下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心15 分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75 %乙醇洗涤沉淀，4°C 7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使沉淀 干燥，该沉淀为病毒样本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆转录及不对称PCR扩增采用50 μ 1的逆转录及不对称PCR反应体系10倍RT-PCR缓冲液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制剂1 μ 1，镁离子5mM, Taq酶5U，反转录酶5U,上游引物0. 4 μ Μ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；反应程序50°C 30分钟，94°C 2分钟，1个循环；94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 30秒，35 个循环；72°C 7分钟；3)采用核酸纳米金生物传感器对PCR产物的检测及结果分析 所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、 硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶 体金偶联形成的，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与 链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸 探针包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形 成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ IDN0.6所示的核苷酸序列；将步骤2所得的PCR产物分别滴加入所述的甲型流感病毒核酸纳米金生物传感器及 甲型Hmi核酸纳米金生物传感器的加样孔中，观察检测线和质控线的情况进行结果分析 检测线和质控线同 时出现红色，表明被检样品为阳性；质控线出现红色，而检测线未出现红 色，表明被检样品为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测甲型流感病毒及甲型H1N1流感病毒的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO.2或7所示的核苷酸序列；硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO.3或8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线，该寡核苷酸探针包含如SEQ ID NO.1或6所示的核苷酸序列。本发明的核酸纳米金生物传感器，制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备。
文档编号C12M1/34GK101942387SQ20091004097
公开日2011年1月12日 申请日期2009年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者刘国东, 曾令文, 顿博影 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院