专利名称：了哥王提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药领域，特别涉及一种了哥王提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
瑞香科植物了哥王(附fo/raem/a/"&c" (L.) C. A. Mey.)是华南地区常用 草药。了哥王入药始载于《岭南采药录》，药用部位为根茎皮，性寒、味苦、 微辛、有毒，入肺、经肝，具有消炎解毒，散瘀逐水的功能。70年代以来， 了哥王被开发成单味制剂"了哥王片"，临床上用于治疗呼吸道感染疾病和 腮腺炎、乳腺炎等症。临床研究显示，"了哥王片"治疗呼吸道感染的效果 与双黄连口服液、牛黄解毒片和感冒清不相伯仲。但是，目前"了哥王片" 的制剂均为水提浸膏，产品的科技含量偏低。
药理研究表明，了哥王提取物具有广泛的药理作用，主要包括抗菌、抗 炎镇痛和抗病毒作用等。但目前报道的了哥王提取物的抗病毒作用仅包括抗 流感病毒、乙肝病毒和艾滋病毒，江西药物研究所试验，了哥王粗提物有抗 甲3型流感病毒作用；姚新生等专利以了哥王提取物为原料制成可以治疗艾 滋病的各种制剂；王筠默报道牛蒡苷元有抗艾滋病毒作用；国外文献报道， 西瑞香素能抑制乙肝病毒在人类肝细胞内的基因表达。并没有关于了哥王抗 呼吸道合胞病毒和副流感病毒的报道。
目前已从了哥王中分离得到香豆素类、木脂素类、黄酮类、蒽醌类、甾 族类、皂苷类、萜类、酰胺类和多糖等化合物，但却没有关于了哥王抗呼吸 道病毒有效部位和有效成分的研究。
在国家知识产权局相关检索和中国期刊网、Scifmder Scholar的检索中， 未发现含有新化合物的了哥王提取物的制备方法及其在抗呼吸道病毒方面 的用途的专利和文献。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种含有新化合物的了哥王提取物。
本发明的另一目的在于提供一种上述了哥王提取物的制备方法。 本发明的再一目的在于提供上述了哥王提取物作为制备抗呼吸道病毒
的药物或保健品的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现 一种了哥王提取物，该提取物含
有4'-甲氧基瑞香黄素E (式I )和瑞香酚(式II):
式I 式II。
上述的一种了哥王提取物的制备方法，包括以下操作步骤将了哥王的 干燥根及根皮粉碎，用乙醇水溶液提取得到粗提物，再经过大孔吸附树脂柱 富集或聚酰胺柱富集得到了哥王提取物；
所述乙醇水溶液提取是指将粉碎的了哥王的干燥根及根皮用质量百分
比浓度为60 95%的乙醇水溶液回流2 3次，每次1 3个小时，合并回流 液，经减压浓縮、干燥后得到粗提物；
所述大孔吸附树脂柱富集，是将上述所得粗提物过大孔树脂柱，先用质 量百分比浓度为0 30%乙醇水溶液洗脱除去杂质，再用质量百分比浓度为 40 80%乙醇洗脱，洗脱液减压浓縮、干燥得了哥王提取物；
所述聚酰胺柱富集，是将上述所得粗提物过聚酰胺柱，先用质量百分比 浓度为0 30%乙醇水溶液洗脱除去杂质，再用质量百分比浓度为60 80% 乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩、干燥得了哥王提取物。
所述了哥王是瑞香科荛花属植物。
所述了哥王提取物含有黄酮、双黄酮和香豆素；以了哥王提取物的千品 重量计算，了哥王提取物中总黄酮的质量百分含量>50%。
上述的了哥王提取物作为制备抗呼吸道病毒的药物或保健品的用途。 所述呼吸道病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感3型病毒(PIV 3)或 甲型流感病毒(FluA， H3N2)。所述抗呼吸道病毒的药物含有治疗有效量的了哥王提取物和药学上可 接受的载体。所述药物制剂为片剂、口服液或胶囊剂。
本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果(1)从植物药了哥王 中提取并富集具有抗呼吸道病毒作用的了哥王提取物(包括黄酮、双黄酮和 香豆素类化合物)，采用体外抗病毒实验表明，该提取物具有较好的抗呼吸 道病毒(包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒和流感病毒)作用，为"了哥王
治疗呼吸道感染"的临床研究结果提供了一定的科学依据；(2)实验证明了
哥王水提物没有显示抗呼吸道病毒活性，而本发明的了哥王提取物是对了哥
王的有效成分进行富集，使之具有了较好的抗呼吸道病毒活性；在本发明基 础上，可将现有产品"了哥王片"(水提制剂)进行二次开发，富集有效成 分，达到"去粗取精"的目的，使之具有抗呼吸道病毒活性；(3)明确了哥 王提取物主要由黄酮、双黄酮和香豆素类化合物组成，其中不但有从了哥王 中首次分离的双黄酮类化合物，还有新结构的双黄酮。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限 于此。
实施例1:
将瑞香科荛花属植物了哥王(采自广东，由广州市药材公司高级工程师
麦振球鉴定)的干燥根及根皮粉碎，用质量百分比浓度为95%的乙醇水溶液 回流二次，每次3个小吋，过滤提取液，滤液用旋转蒸发仪浓縮成浸膏，在 真空干燥箱中干燥成褐色粉末，为了哥王粗提物；以粗提物干品重量计算含 有总黄酮7 14%;
称取大孔吸附树脂(AB-8) 500g，加蒸馏水800 mL，搅拌均匀，用水 浮选法除去树脂单体或碎片，然后在室温下放置24h，待树脂充分溶胀后， 将树脂抽干，再用乙醇湿法装柱，用乙醇流动清洗柱子至流出液与水(1: 5) 混合不呈白色浑浊，然后用蒸馏水充分淋洗柱子至流出液无乙醇的味道，放 置过夜平衡柱子，得到大孔树脂柱。
称取了哥王粗提物干品20g，溶于30mL质量百分比浓度为95%乙醇中， 超声波脱气后，将样品加入上述处理和平衡过的大孔树脂柱中，先用2L水 洗脱柱子，再用5L质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液洗脱柱子，收集乙 醇溶液洗脱所得的洗脱液，用FeClrEtOH试剂显色检测，合并显色的洗脱 液，减压浓縮，冷冻干燥，得到了哥王提取物；以提取物干品重量计算，了 哥王总黄酮含量>50%。实施例2:
将瑞香科荛花属植物了哥王的干燥根及根皮粉碎，用质量百分比浓度为
85%的乙醇水溶液回流二次，每次1个小时，过滤提取液，滤液用旋转蒸发 仪浓縮成浸膏，在真空干燥箱中干燥成褐色粉末，为了哥王粗提物；以粗提 物干品重量计算含有总黄酮7 14%;
称取聚酰胺粉(100 200目)600g,加质量百分比浓度为95%的乙醇 溶液1000 mL，搅拌均匀，浸泡24小时，用浮选法除去单体或碎片，将树 脂抽干，将乙醇处理过的聚酰胺粉，加蒸馏水1000mL，用超声波脱气，搅 拌均匀后，沿玻棒小心缓慢地灌到柱中，同时轻轻敲击柱壁，使聚酰胺粉沉 降均匀、紧密，然后用蒸馏水充分淋洗柱子至流出液无乙醇的味道，放置过 夜平衡柱子，得到聚酰胺柱。
称取了哥王粗提物干品20g，溶于40mL质量百分比浓度为95%的乙醇 中，超声波脱气后，将样品加入上述聚酰胺柱中，先用1L质量百分比浓度 为30%的乙醇水溶液洗脱柱子至洗脱液无色，再用5L质量百分比浓度为80% 的乙醇水溶液洗脱柱子至洗脱液无色，收集洗脱液，用FeClrEtOH试剂显 色检测，合并显色的洗脱液，减压浓縮，冷冻干燥，得到了哥王提取物；以 提取物干品重量计算，了哥王总黄酮的质量百分含量>50%。
实施例3: 了哥王提取物胶囊的制备
称取50g实施例l所得的了哥王提取物，加药用淀粉10g，混合均匀， 用60 mL水或质量百分比浓度为95%的乙醇制粒，过12目筛挤压制湿颗粒， 在60°C下真空干燥，用20目筛整粒，同时加入5g微粉硅胶，混合均匀， 颗粒填装入胶囊，得到了哥王提取物胶囊。
实施例4: 了哥王提取物片剂的制备
称取50g实施例2所得的了哥王提取物，加微晶纤维素45 g和硬脂酸5 g，混合均匀，用压片机压成①6mm的片剂，得到了哥王提取物片剂。
实施例5: 了哥王提取物的总黄酮含量测定 了哥王提取物中总黄酮含量采用比色法测定，用芦丁做标准样品。 标准曲线的制备精密称取在105。C常压干燥至恒重的芦丁对照品，用 甲醇配成1.0mg/mL的对照品溶液，分别取O.O， 2.0， 4.0， 6.0， 8.0， 10.0 mL 对照品溶液于25 mL容量瓶中，加质量百分比浓度为5%的亚硝酸钠1.0 mL,摇匀，静置6min,加质量百分比浓度为10%的硝酸铝1.0 mL,摇匀，静置 6min,加质量百分比浓度为4%的NaOH10.0mL,再加甲醇至刻度，摇匀， 静置15min，用紫外分光光度计在500 nm处测定不同浓度的标准样品吸光 度值，作标准曲线，求出标准曲线方程。
含量测定准确称取0.1 g实施例4所得的了哥王提取物干品，溶于45mL 甲醇中密闭放置10小时、水浴回流2小时，放冷，过滤，滤液置于50mL 的容量瓶中，加甲醇至刻度，即得供试液。精密量取供试液6mL于25 mL 容量瓶中，加质量百分比浓度为5%的亚硝酸钠1.0 mL，摇匀，静置6min,加 质量百分比浓度为10%的硝酸铝1.0 mL，摇匀，静置6min,加质量百分比浓 度为4。/。的NaOH 10.0 mL，摇匀，再加甲醇至刻度，摇匀，静置15min，用 紫外分光光度计在500 nm处测定吸收值，从标准曲线査得(或标准曲线方 程算得)样品中总黄酮含量。
测定结果显示，了哥王提取物中，以芦丁计，总黄酮含量>50%。
实施例6: 了哥王提取物中黄酮和香豆素的提取和结构测定
将实施例2所得了哥王提取物过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯、氯仿 -乙酸乙酯和氯仿-丙酮等溶剂体系洗脱，然后再经sephadex LH-20凝胶柱层 析分离纯化，得到一系列酚类化合物，它们的化学结构采用光谱分析结合化 学反应的方法鉴定。
结果显示了哥王提取物中含有槲皮素、芫花素、西瑞香素、雁皮素、 新狼毒素B、芫花醇B、芫花醇C、 4'-甲氧基瑞香黄素E和瑞香酚等一系 列黄酮、双黄酮和双香豆素类化合物，其中新狼毒素B、芫花醇B、芫花醇C、 4，-甲氧基瑞香黄素E和瑞香酚首次从了哥王中得到，且4'-甲氧基瑞香黄素 E和瑞香酚为新化合物。结构如下图所示
槲皮素R产OH R2=OH R3=OH 西瑞香素 芫花素R产OCH3 R2=H R3=H4'—甲氧基瑞香黄素E 瑞香酚
4'-甲氧基瑞香黄素E和瑞香酚的光谱数据和理化性质如
4'-甲氧基瑞香黄素E:淡褐色粉末。在硅胶薄层板上用不同的溶剂体系
展开，均为单点。254 nm紫外光下显暗色斑点。浓硫酸-香草醛试剂加热显 红色，FeCl3-EtOH试剂显蓝黑色。ESI-MS m/z: 555 [M-H]、 HR-ESI-MS m/z: 556.13764 [M-H]、 'H-NMR (500 MHz, CI)3。D)禾卩13C-NMR (125 MHz, CD3OD) S (ppm)数据见表1。表1 4'-甲氧基瑞香黄素E的^-NMR和13C-NMR数据
H C
25.04 (1H, dd， J = 9.4, 1.7 Hz) 2.16(1H,m)78.3
31.83 (1H, m)30.6
42.63 (2H， m)20.1
4a105.5
5165.0
66.20 (1H, s)92.1
7161.1
8107.2
8a154.1
r135.1
2',6'7.18 (2H, d, /=8.8Hz)127.8
3'，5'6.86 (2H, d, /=8,8Hz)114.7
4'160.4
2"118.8
3"79.9
4"187.1
4"3100 6
5"163.5
6"6.02 (1H, d,J=2.1 Hz)95.7
7"169.0
8"5.89 (1H, d乂-2.1 Hz)97.4
8"a465.5
r"126.4
2'〃， 6'〃7.33 (2H，8.8 Hz)129.5
3〃( 5〃'6.77 (2H， d,J=8.8Hz)115.9
斗〃'159.7
-OCH33.18 (3H， s)55,8
瑞香酚淡黄色粉末。在硅胶薄层板上用不同的溶剂体系展开，均为单
点，254nm紫外光下显暗色斑点，FeCl3-EtOH试剂显蓝黑色。ESI-MS w/z: 557 [M-Hr。HR-ESI-MS m/z: 557,10913 [M-HT。比旋光度[a]D-- -102。 (589 nm, c0,1, MeOH)。 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)和13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)5(ppm)数据见表2。表2瑞香酚的^-NMR和13C-NMR数据
HC
24.96 (1H, s)82.3
34.18(1H, brs)66.5
42.65 (1H, d,^17.5Hz)28.6
2.49 (1H,dd, 3.8, 17.3 Hz)
4a111.1
188.7
65.68 (1H, s)102.9
7170.4
887.5
8a160.3
r130.4
2'，6'6.71 (2H,8.5 Hz)129.2
3', 5'6.62 (2H， (!，■/= 8.5 Hz)116.5
4,158.6
2"6.09 (m， s)92.2
3"82.1
4"193.1
4"a102.0
5"163.1
6"6.14 (1H， d，J = 2.0 Hz)99,0
7"169.6
8"6.16 (1H， d，《/=2.0 Hz)98 4
8"a166.0
r'124,7
2'〃， 6〃'7.22 (2H， d, J=8.5 Hz)131,7
3'〃 5'〃6.83 (2H, d， J=8.5 Hz)116.7
斗'〃159.9
实施例7: 了哥王提取物抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性测定
了哥王粗提物的制备将了哥王的干燥根及根皮粉碎，用质量百分比浓
度为95%的乙醇水溶液回流二次，每次3个小时，过滤提取液，滤液用旋
转蒸发仪浓縮成浸膏，在真空干燥箱中干燥成褐色粉末，得了哥王粗提物。
了哥王水提物的制备将了哥王的干燥根及根皮粉碎，用10陪量的水
煎煮3小时，滤出煎煮液，用旋转蒸发仪将之浓縮成浸膏，在真空干燥箱中
千燥成浅褐色粉末，得了哥王水提物。
细胞、病毒和实验材料选用呼吸道合胞病毒(RSV),宿主细胞为喉
癌细胞(Hep-2);选用副流感3型病毒(PIV3)、宿主细胞为Hep-2和甲型 流感病毒(FluA， H3N2)，宿主细胞为狗肾传代细胞(MDCK)。阳性对照药为利巴韦林；细胞生长在质量百分比浓度为10%的小牛血清 (FBS)的MEM培养基中；维持液为1%FBS的MEM培养基。
样品溶液的配制将了哥王提取物、了哥王粗提物、了哥王水提物和利 巴韦林用维持液配制成500吗/mL和100 pg/mL的样品溶液。
用四唑盐(MTT)比色法测定化合物的细胞毒性将Hep-2细胞或MDCK 细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的样 品(浓度为500 15.7|ig/mL)，在37'C， 5%C02培养箱中培养3天。加入 10plMTT溶液(5mg/mL,用缓冲溶液配置)，继续培养4小时。吸出样品 溶液，加入二甲亚砜，室温下，将96孔板置于微空孔板振荡器中振荡10 分钟。用酶标仪测定各孔的OD值，测量波长为570 nm，参比波长为630 nm， 计算样品对细胞的半数致死毒性浓度(CC5C)。每组设4个平衡孔，每组实 验重复3次。计算结果，画出曲线，求出半数毒性浓度(CC5o)。
通过观察样品对细胞病变效应的抑制程度(cyt叩athic effect reduction assay )测定抗病毒活性将Hep-2细胞或MDCK细胞培养在96孔培养板 中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的100倍半数感染量 (100TCID5。)的病毒液，再加入用维持液稀释好的系列浓度样品溶液(浓 度为100 1.6吗/mL)。在37i:， 5%C02培养箱中培养3 4天。每天于倒 置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)的程度，并记录 一表示无CPE; + 表示0 25%细胞有CPE; 2+表示25 50%细胞有CPE; 3 +表示50 70 %细胞有CPE; 4+表示75 100%细胞有CPE。最后估计出半数抑制浓度 (IC5。)。选择性指数(SI) =CC5Q/IC5。。实验结果见表3:
表3 了哥王提取物的抗呼吸道病毒活性
抗病毒效果了哥王提取 物了哥王粗提 物了哥王水提 物利巴韦 林
RSV (Hep-2细胞)CC50 (吗/mL)258.0352.0>50062.5
IC50 (昭/mL) SI2,5 103.215.7 22.4>1003.1 20.2
PIV3CC50 (吗/mL)258.0352,0>50062.5
(Hep-2细胞)IC50 (吗/n止)15.762,5〉1002.6
Si16.45.624.0FluACC50 (吗/mL) 335.2 >500 >500 125.0
(MD:细IC50 (叱/mU 62.5 >画 MOO 3L3 胞)
SI 5.4 — — 4.0
从表3中的数据可见(1) 了哥王水提物对Hep-2和MDCK的细胞毒 性均大于500 ng/mL，在100 pg/mL为测定的起始浓度时，对本实验所采用 的三种呼吸道病毒(包括RSV、 PIV3和FluA)均没有显示体外抑制活性；
(2) 了哥王粗提物(醇提物)对呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感3型病 毒(PIV 3)有一定的体外抑制活性，但活性均不如阳性对照药利巴韦林； 了哥王醇提物在100 pig/mL为测定的起始浓度时，没显示抗甲型流感病毒
(FluA)活性；(3)本发明的了哥王提取物对本实验所采用的三种呼吸道病 毒均有不同程度的体外抑制活性，其中对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制 活性最好，ICso值与阳性对照药利巴韦林相当，而且，与利巴韦^t目比，了 哥王提取物的毒性较小，因此它的选择性指数SI值(103.2)大过利巴韦林； 了哥王提取物对副流感3型病毒(PIV3)和甲型流感病毒(FluA)有一定 的抑制作用，因其毒性较小，它们的选择性指数SI值与利巴韦林的相当。
上述试验结果表明，与"了哥王片"提取方法相似的了哥王水提物没有 显示明显的抗呼吸道病毒活性；了哥王醇提物(即了哥王粗提物)对呼吸道 病毒有一定的抑制活性；但是，经有效成分富集后的了哥王提取物具有较好 的抗呼吸道病毒作用，且毒性较低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。
权利要求
1、一种了哥王提取物，其特征在于该提取物含有4’-甲氧基瑞香黄素E(式I)和瑞香酚(式II)式I 式II。
2、 根据权利要求1所述的一种了哥王提取物的制备方法，其特征在于包括以下操作歩骤将了哥王的干燥根及根皮粉碎，用乙醇水溶液提取得到 粗提物，再经过大孔吸附树脂柱富集或聚酰胺柱富集得到了哥王提取物；所述乙醇水溶液提取是指将粉碎的了哥王的干燥根及根皮用质量百分比浓度为60 95%的乙醇水溶液回流2 3次，每次1 3个小时，合并回流 液，经减压浓縮、干燥后得到粗提物；所述大孔吸附树脂柱富集，是将上述所得粗提物过大孔树脂柱，先用质 量百分比浓度为0 30%的乙醇水溶液洗脱除去杂质，再用质量百分比浓度 为40 80%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓縮、干燥得了哥王提取物；所述聚酰胺柱富集，是将上述所得粗提物过聚酰胺柱，先用质量百分比 浓度为0 30%的乙醇水溶液洗脱除去杂质，再用质量百分比浓度为60 80%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓縮、干燥得了哥王提取物。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述了哥王是瑞香 科荛花属植物。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于以了哥王提取物的 干品重量计算，了哥王提取物中总黄酮质量百分含量>50%。
5、 根据权利要求1所述的了哥王提取物作为制备抗呼吸道病毒的药物 或保健品的用途。
6、 根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述呼吸道病毒是呼吸 道合胞病毒、副流感3型病毒或甲型流感病毒。
7、 根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述抗呼吸道病毒的药物含有治疗有效量的了哥王提取物和药学上可接受的载体。
8、 根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物制剂为片剂、 口服液或胶囊剂。
全文摘要
本发明公开了一种了哥王提取物及其制备方法和用途。该了哥王提取物含有4’-甲氧基瑞香黄素E和瑞香酚。了哥王提取物的制备方法是将了哥王的干燥根及根皮用乙醇水溶液提取，再经过大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱富集得到。该提取物可用于制备抗呼吸道合胞病毒、抗副流感3型病毒和抗甲型流感病毒的药物或保健品。
文档编号A23L1/30GK101601666SQ20091004099
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者岑颖洲, 李药兰, 薛珺一, 许少玉, 黄伟欢 申请人:暨南大学