专利名称：一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种将惰性吸附载体应用到出芽短梗霉
固态发酵生产e-聚苹果酸的培养方法。
背景技术：
聚苹果酸[Poly (malic-acid)或Poly malate，简称为PMLA]是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物，是一种新型的完全生物降解性高分子材料。作为一种脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性，在药物方面具有很强的用途，可以作为药物载体用于心血管及脑肿瘤方面的研究，还可作为微胶囊材料、手术缝合线及伤口 、烧伤治疗的绷带等生物医学材料，直接用于人体，还可用于化妆产品及食品包装等材料。 聚苹果酸的制备主要有化学合成法和生物发酵法，由于化学合成法有诸多的不足之处，目前研究方法主要集中在生物法。在采用生物法制备聚苹果酸方面，专利主要集中在菌种改造、液态发酵、提取工艺等领域，但微生物深层液体发酵生产聚苹果酸产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。固态发酵制备聚苹果酸的报道很少，而采用惰性载体为固相的发酵方法还未见报道。 丝状真菌适用于固态发酵生成许多有价值的代谢产物，因为发酵条件与丝状真菌的自然环境相似。由于固态发酵往往采用麸皮、豆饼、谷子、棉籽饼、马铃薯、以及其他含淀粉和纤维素的农作物产品等作为真菌培养基质。但此法不足之处就是碳源是它们的结构组成部分，在微生物发酵生长过程中，培养基被分解，底物容易结块，孔隙率也降低，结果底物的外形和物理特性都发生了变化，降低了发酵过程中的传质和传热。以惰性固态载体为固态发酵过程的固相，微生物生长的营养是吸附在载体上的培养液，能够对培养基营养成分进行合适的调节；容易了解产物中的各成分并进行分析，从而有利于发酵过程的控制以及动力学研究与模型建立等。另外，惰性载体吸附固态发酵还具有产物提取简便的优点，可以很容易地从惰性载体中提取到胞外产物，而且所得到的产物含有较少的杂质，载体还可以重复使用。 微生物细胞所处微环境对微生物生长代谢产生着重要影响，其中微环境的水分活度、PH、营养物质的种类、浓度、界面的性质、比表面积、溶氧等诸多因素都会对微生物的生长代谢以及多菌混合固态发酵过程中各种微生物的分布、数量产生重要的影响。若固相载体作为微生物营养物质的一部分参与细胞的生长代谢，在微生物生长过程中，这些固相载体容易收縮结块，使孔隙率降低，影响发酵过程中传质与传热效率并增加了系统的复杂性。而惰性载体可避免非惰性载体的坍塌缺陷，有利于供氧和维持较好的水动力学特性。同时，惰性载体表面往往含有羟基、氨基、羧基等极性基团，通过改变其数量与种类可用以调节微环境水活度、PH和界面性质等。 由于惰性载体吸附固态发酵具有传统固态发酵所不具有的优势，其将是发酵工程中的一个新的研究方向，将有助于固态发酵的过程控制、提高固态发酵效率以及反应器设计，在工业生产过程中将会发挥重要的作用。目前这一发酵方法还很不成熟，许多方面尚属空白，随着其它固态发酵技术，如压力脉动固态发酵技术和计算机过程控制技术在固态发酵过程中的应用，这一方法将会越来越完善，从而给发酵工业带来全新的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能耗低、投资小、污染少，设备利用率高，效益可观的P _聚苹果酸的惰性载体吸附固态发酵生产方法。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案为
1.培养基的制备 (1)活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH 4. 0 4. 5， 121。C高压蒸汽灭菌15min ; (2)种子培养基葡萄糖8%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%，K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%， MgS04 7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC03 2% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; (3)发酵培养基蔗糖5%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%， K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 05% ， CaC03 3% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; 2.菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25t:活化培养3 5d; 3.种子培养选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约106个/mL的孢子悬浮液，按10% (v/v)接种量接种装有lOOmL液体种子培养基的500mL三角瓶中，25°C ， 200r/m条件下培养2 3d，制得种子液。 4.发酵培养将(2)中的种子培养液以10 15% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，再按照固液比l : 1 1 : 5(w/w)的比例与经灭菌的惰性载体混合，使培养液吸附均匀。在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料，设定温度25 30°C ，调节通风系统使通风量为0. 2 1. 5vvm，搅拌转速为5 25r/min，间歇搅拌，每隔12h，搅拌20min，发酵罐内部湿度控制在60% 95%，发酵周期为6 8d。 5.聚苹果酸的检测发酵结束开启出料口，连续卸出物料，通过加水浸提获得聚苹果酸发酵液，检测聚苹果酸含量。 本发明与现有技术相比，有益效果是1)本方法是在一个具有较高均匀性、一致性的固态发酵微环境的培养基上进行惰性载体吸附固态发酵，培养体系涉及到气液、固、三相，气相为连续相，出芽短梗霉所需氧主要来自气相，减少了无菌空气的用量，而且空气通过固体层的阻力较小，能量消耗少；2)固态发酵微环境利于菌体分化，特别是出芽短梗霉丝状真菌的分化代谢，发酵结束后可以很容易地从惰性载体中提取P _聚苹果酸，高的底物浓度可以产生高的产物浓度，而且所得到的产物含有较少的杂质，提高了聚苹果酸的产率和纯度；3)并且本发明方法中的固相为惰性载体，发酵后期培养基不会塌縮变硬结块，利于传质和传热，维持较好的水动力学特性，并且惰性载体表面往往含有羟基、氨基、羧基等极性基团，通过改变其数量与种类可用以调节微环境水活度、PH和界面性质等；4)由于惰性载体可以反复使用，降低了固态废渣的排放量，有利于环保，且运行成本低廉，设备利用率高，能耗低、投资小、污染少，经济效益明显，利于工业化生产。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限
制性的，不能以此限定本发明的保护范围。 实施例1 1.培养基的配制 (1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH4. 0 4. 5， 12TC高压蒸汽灭菌15min ; (2)种子培养基葡萄糖8%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%，K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%， MgS04 7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC03 2% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; (3)发酵培养基蔗糖5%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%， K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 05% ， CaC03 3% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;
2.菌种活化 将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No. 3337)转接PDA培养基，25t:活化培养3 5d ;
3.种子培养 选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25°C ， 200r/m下培养2 3d，制得种子液;
4.惰性载体的制备 将聚氨酯泡沫塑料裁成约lcn^的小块，改性沸石经过20目样品筛筛选后洗净，烘干，按1 : 1的比例混合均匀，121。C高压蒸汽灭菌30min ;
5.固态发酵培养 将上述3中制得的种子液以10% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，再按照固液比l : 1(w/V)的比例与4中制得的惰性载体混合，使培养液吸附均匀。在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料，调节通风量为0. 2vvm，搅拌转速为25r/min，间歇搅拌，每隔12h，搅拌20min，于25°C ，发酵罐内部湿度控制在60% ，发酵培养6d ;
6.聚苹果酸的检测 发酵结束后，加入5倍体积的蒸馏水与物料混合，获得含有聚苹果酸发酵液，检测
聚苹果酸含量达到8. 5±0. 6g/L发酵培养基。 实施例2 1.培养基的配制 (1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH 4. 0 4. 5， 12TC高压蒸汽灭菌15min ; (2)种子培养基葡萄糖8%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%，K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%， MgS04 7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC03 2% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; (3)发酵培养基蔗糖5%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%， K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 05% ， CaC03 3% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;
2.菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25"C活化培养3 5d ;
3.种子培养 选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25°C ， 200r/m下培养2 3d，制得种子液;
4.惰性载体的制备 将聚氨酯和聚氯乙烯泡沫塑料裁成约30cn^的小块，经过20目样品筛筛选后洗净，烘干，三者按l : 1 : 1的比例混合均匀，12rC高压蒸汽灭菌30min;
5.固态发酵培养 将上述3中制得的种子液以15% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，再按照固液比l : 2(w/w)的比例与4中制得的惰性载体混合均匀，使培养液吸附均匀。在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口，缓慢进料，调节通风量为0. 6vvm，搅拌转速为20r/min，间歇搅拌，每隔12h，搅拌20min，发酵罐内部湿度控制在75% ，于28°C ，发酵培养7d ;
6.聚苹果酸的检测 发酵结束后，加入5倍体积的蒸馏水与物料混合，获得含有聚苹果酸发酵液，检测
聚苹果酸含量达到13. 1±0. 8g/L发酵培养基。 实施例3 1.培养基的配制 (1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH4. 0 4. 5， 12TC高压蒸汽灭菌15min ; (2)种子培养基葡萄糖8%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%，K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%， MgS04 7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC03 2% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; (3)发酵培养基蔗糖5%，丁二酸铵0.3%，丁二酸0.2%， K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 05% ， CaC03 3% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;
2.菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25。C活化培养3 5d ;
3.种子培养 选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25°C ， 200r/m下培养2 3d，制得种子液;
4.惰性载体的制备 将聚氨酯、聚氯乙烯及酚醛泡沫塑料裁成约50cm3的小块，洗净，烘干，三者按照
61:1: 1的比例混合均匀，12rC高压蒸汽灭菌30min ;
5.固态发酵培养 将上述3中制得的种子液以15% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，再按照固液比l : 4(w/w)的比例与4中的惰性载体混合均匀，使培养液吸附均匀。在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料，调节通风量为1. Ovvm，搅拌转速为10r/min，间歇搅拌，每隔12h，搅拌20min，发酵罐内部湿度控制在60% ，于30°C ，发酵培养7d ;
6.聚苹果酸的检测 发酵结束后，加入5倍体积的蒸馏水与物料混合，获得含有聚苹果酸发酵液，检测
聚苹果酸含量达到16. 3±0. 7g/L发酵培养基。 实施例4 1.培养基的配制 (1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH 4. 0 4. 5， 12TC高压蒸汽灭菌15min ; (2)种子培养基葡萄糖8%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%，K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%， MgS04 7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC03 2% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ; (3)发酵培养基蔗糖5%，丁二酸铵0. 3%，丁二酸0. 2%， K2C03 0 . 04%，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01%， ZnS04 7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 05% ， CaC03 3% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;
2.菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25"C活化培养3 5d ;
3.种子培养 选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25°C ， 200r/m下培养2 3d，制得种子液;
4.惰性载体的制备 将聚丙烯酰胺凝胶、聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶、Amberlite离子交换树脂，按照
1:1: 1的比例混合均匀，12rc高压蒸汽灭菌30min ; 5.固态发酵培养 将上述3中制得的种子液以15% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，再按照固液比l : 5(w/w)的比例与4中制得的惰性载体混合均匀，使培养液吸附均匀。在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料，调节通风量为1. 5vvm，搅拌转速为5r/min，间歇搅拌，每隔12h，搅拌20min，于28°C ，发酵罐内部湿度控制在95 % ，发酵培养6d ;
6.聚苹果酸的检测 发酵结束后，加入5倍体积的蒸馏水与物料混合，获得含有聚苹果酸发酵液，检测聚苹果酸含量达到28. 5±0. 6g/L发酵培养基。
权利要求
一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法。
2. 根据权利要求书1所述的一种惰性载体吸附固态发酵法生产P-聚苹果酸的方法，其特征在于所述惰性载体为聚氨酯泡沫塑料、聚氯乙烯泡沫塑料、酚醛泡沫塑料、聚丙烯酰胺凝胶、聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶、Amberlite离子交换树脂、多孔球型专用改性沸石和纤维素多孔微载体中的至少一种。
3. 根据权利要求书1所述的一种惰性载体吸附固态发酵法生产P-聚苹果酸的方法，其特征在于所用的培养基为(1) 活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) :土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， pH 4. 0 4. 5， 121。C高压蒸汽灭菌15min ;(2) 种子培养基葡萄糖8%， 丁二酸铵O. 3%， 丁二酸O. 2%， K2C03 0 . 04 %，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0.01%，ZnS04 7H205X 10—4%，玉米浸出液0. l%，CaC032% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;(3) 发酵培养基蔗糖5 %， 丁二酸铵O. 3 %， 丁二酸O. 2 %， K2C03 0 . 04 %，KH2P040. 01%，MgS04 *7H20 0. 01 % ， ZnS04 *7H20 5 X 10—4% ，玉米浸出液0. 1 % ， CaC033% (单独灭菌)，12rC高压蒸汽灭菌15min ;(4) 惰性载体的制备将聚氨酯泡沫塑料、聚氯乙烯泡沫塑料、酚醛泡沫塑料、聚丙烯酰胺凝胶、聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶等制成1 50cm3的小块，沸石过20目样品筛，洗净，烘干，12rC高压蒸汽灭菌30min。
4. 根据权利要求书1所述的一种惰性载体吸附固态发酵法生产P-聚苹果酸的方法，其特征在于培养方法为(1) 菌种活化将出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan) TKPM00006 (筛选自我国宁夏土壤，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCCNo. 3337))转接至PDA斜面培养基，于25。C恒温培养3 5d ;(2) 种子培养选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约1()6个/mL的孢子悬浮液，按10% (v/v)接种量接种到种子培养基中，于25t:，200r/m下培养2 3d，制得种子液；(3) 固态发酵培养将(2)中的种子培养液以10 15% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，然后与经灭菌的惰性载体混合均匀，使培养液吸附均匀，然后在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料进行固态发酵。
5. 根据权利要求书1所述的一种惰性载体吸附固态发酵法生产P-聚苹果酸的方法，其特征在于液体培养基与惰性载体按照1 : 1 5 : 的比例混合，使培养液吸附均匀，然后在无菌操作条件下，开启固态反应器进料口 ，缓慢进料进行固态发酵。
6. 根据权利要求书1所述的一种惰性载体吸附固态发酵法生产P-聚苹果酸的方法，其特征在于固态反应器发酵条件为通风量0. 2 1. 5vvm，搅拌转速为5 25r/min，间歇搅拌，每隔12h搅拌20min，发酵温度为25 30°C ，发酵罐内部湿度控制在60% 95% ，发酵周期为6 8d。
全文摘要
本发明提供一种微生物固态发酵产生β-聚苹果酸的新方法，涉及一种将惰性吸附复合材料用于出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337)固态发酵生产聚苹果酸的新工艺。包括以下步骤选择物理性吸水好、性质稳定、具有多孔结构的无毒惰性载体，按照一定比例与接种有出芽短梗霉菌种的液体培养基混合均匀，送入固态反应器进行发酵，发酵结束后用水提取固态发酵后的基质，检测聚苹果酸含量。利用本方法提高了聚苹果酸发酵效率，促进了发酵过程中氧气的传递效率；同时，由于惰性载体可重复使用，因此，极大的减少固体废弃物的排放；该技术发酵设备利用率高，发酵周期缩短，产物易于分离和提取，提高了聚苹果酸的产率和纯度，且运行成本低廉，经济效益明显，利于工业化生产。
文档编号C12R1/645GK101696430SQ20091007117
公开日2010年4月21日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者乔长晟, 徐勇虎, 王凤荣, 蒋磊, 贾士儒, 钟堃 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司;