专利名称：：甲烷氧化混合菌的保存方法
技术领域：
：本发明涉及一种甲垸氧化混合菌的保存方法。
背景技术：
：甲烷氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，以甲烷为唯一碳源及能源，广泛存在于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲垸氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其独特的性质和多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体治理以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。甲烷氧化菌纯培养生长极为缓慢，功能不稳定，且甲烷氧化菌纯菌资源较少。甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌为主体的不同共生菌体的组合，相比纯菌更有利于工业应用。罗明芳等人研究表明，甲垸氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效积累环氧丙烷的能力(罗明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物学报，2007，47(1):103~109.)。在应用混合菌时，其功能的稳定，取决于稳定的菌群结构。平板传代过程会丢失混合菌中的大量菌种，所以甲烷氧化混合菌的保存，不能使用纯菌保存常用的平板传代法。因此，迫切需要既简便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群结构和功能的高效保存方法。
发明内容本发明的目的是提供一种甲烷氧化混合菌的保存方法。本发明提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括将甲烷氧化混合菌菌体置于-70。C-8(TC冻存的步骤。可先离心收集菌体，然后将菌体进行冻存。所述甲烷氧化混合菌菌体的湿重为50mg以上。应用本发明的方法保存甲烷氧化混合菌时，建议每一年转接活化一次。所述甲烷氧化混合菌的制备方法可包括如下步骤1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；2)将步骤l)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小时向密封瓶中置换入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15):(95-85);传至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。所述步骤2)具体可为初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18);每48小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲垸和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18)。所述步骤3)具体可为每10天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代(培养方法同步骤2));步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为10:90;传至第10代，得到甲垸氧化混合菌。所述NMS培养基配制方法具体如下将100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至1L，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到NMS培养基；每升所述溶液A的配制方法为将鹏310g，MgS(V7H2010g，CaCl2-2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法为Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2-4H200.02g，CoCl2.6H200.05g，H3BO30.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04'7H200.4g，NiCl2'6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法为Na2HPCV12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值调至6.8。由于甲垸氧化菌的生长速度远远慢于其他细菌，当有非甲烷的碳源存在时，很容易改变甲垸氧化混合菌的菌群结构，从而导致混合菌功能上的变化，所以在甲垸氧化混合菌保存时，不能采用通常的添加保水性有机物(如甘油等)的菌种冷冻保存方法，避免引入其他碳源从而改变菌群结构。本发明提供的保存甲烷氧化混合菌的方法没有引入其它碳源，可以稳定地保持混合菌群的结构和功能，并且操作方便，需要使用时，将冻存的菌体倒入培养基中培养即可。本发明将在甲烷氧化混合菌的保存及其工业化应用中发挥重要作用。图1为甲烷氧化混合菌的变性梯度凝胶电泳图。1:一直传代培养的甲烷氧化混合菌；2:-80°(:冻存后的甲垸氧化混合菌。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。甲垸去除率的检测方法如下在250ml的可密封的玻璃培养瓶中分装50mlNMS液体培养基，在液体培养基中接种lmlOD6^1.0的甲垸氧化混合菌，加盖密封橡胶塞，在上层空气中置换入30ml甲垸(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5:1)'。30°C、170rpm空气浴摇床培养，每24小时用气相色谱检测甲垸的剩余量(％，体积百分含量)。每次检测完甲烷剩余含量之后，打开密封盖，使内部气体与外部气体流通，然后重新加盖密封橡胶塞，并重新在上层空气中置换入30ml甲垸(使瓶中空气与甲垸的体积比约为5:1)，同时用气相色谱检测甲垸起始量(％，体积百分含量)。甲烷去除率^甲垸起始量-甲烷剩余量)/甲烷起始量xiooy。。实施例l、甲烷氧化混合菌的获得一、土样采集和培养基配制土壤样品从河南省新峰矿物局的一个高瓦斯煤矿四矿采样，样品取自该煤矿排风口处表层5cm深土壤,土壤样品的基本性质见表l。表1新峰煤矿土壤样品性质(取样日期2006年10月9日)检测参数样品性质煤矿参数CH4浓度(%v/v)0.3C02浓度(％v/v)0.1空气流速(mVmin)3800土壤参数土壤含水量(％，质量百分含量)31.4土壤温度rc)26-27土壤pH9.4甲烷吸收速度(umol/每天每克土壤)3.0用于培养和筛选甲垸氧化混合菌的培养基为NMS培养基，配制方法如下:溶液A(每升):跳10g，MgS04.7H2010g，CaCl2'2H202g，去离子水定容至1L;溶液B(每升):Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2-4H200.02g，CoCl2-6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04.7H200.4g，NiCl2.6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，去离子水定容至IL;溶液C(每升):Na2HP04'12H2071.6g，KH2P0426g，去离子水定容至1L，pH值调至6.8，高温(121°C)灭菌；NMS培养基100ml溶液A，lml溶液B，去离子水定容至1L，高温(12rC)灭菌；在高温灭菌后的混合液中加入10ml灭菌后的溶液C(如配置固体培养基则加入15g琼脂粉)。二、甲烷氧化混合菌的培养摇瓶培养采用250ml螺口摇瓶，装50mlNMS液体培养基，加入5g土壤样品，利用带有聚四氟乙烯密封垫的瓶盖密封，在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5:1);30°C，170rpm空气浴摇床培养；每48小时重新置换入30ml甲垸(使瓶中空气与甲垸的体积比约为5:1)。三、甲烷氧化混合菌的传代每10天接种1(F。的培养液至新的NMS培养基中，作为一次传代，培养方法同步骤二。对传至第10代的甲垸氧化混合菌进行群落多样性鉴定，方法为对稳定菌群的部分变性梯度凝胶电泳(DGGE，DenaturingGradientGelElectrophoresis)条带进行测序，并使用RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)方法进行克隆建库分析，通过序列比对分析，表明甲烷氧化混合菌中包括的细菌至少包括下面的菌属甲基单胞菌属(#ez^r7o/Ho/jas)、嗜甲基菌属(#e^^o/7^7iAs)、甲基孢囊菌属(ifet力y7ocys〃s)、ifetAK7osi""s、甲基杆菌属(ifet/y7ote"er)、噬氢菌属(场^ro《e/70/力3卵)、类芽胞杆菌属(尸aew'力aci7J"s)、鞘脂单胞菌属(5)3/j'"go历。"a50、芽孢杆菌属(feciJJiAs)。实施例2、甲垸氧化混合菌的保存和保存效果鉴定一、甲烷氧化混合菌的保存取50ml实施例l获得的第10代的甲烷氧化混合菌(培养至对数生长期)，使用灭菌离心管离心上述培养好的混合菌，倒掉上清，收集湿重50mg以上的菌体，直接将盛有菌体的离心管置于-8(TC冻存。二、保存效果鉴定1、甲垸氧化混合菌的活化甲垸氧化混合菌-8(TC冻存六个月后，进行活化，具体如下将冻存的甲垸氧化混合菌接种于50ml的NMS培养基中，置换加入甲烷(使瓶中含有30ml甲垸)，30。C、170rpm空气浴摇床培养4天，每48小时重新置换入甲烷。将活化后的甲烷氧化混合菌分别进行以下步骤2、3、4的鉴定。同时，将实施例1获得的第10代的甲垸氧化混合菌一直传代培养，作为对照，进行如下步骤2、3、4的鉴定。另外，将甘油保存(15%甘油，-80'C冻存六个月)的实施例1获得的第10代的甲垸氧化混合菌进行同样的活化，然后进行如下步骤2和步骤3的实验。2、生长速度鉴定将步骤l的甲烷氧化混合菌接入50mlNMS培养基中，使初始浓度0D660为0.05,每天充入新的甲烷30ml，密封，30°C、170rpm空气浴摇床培养。培养四天后，-8(TC冻存的甲垸氧化混合菌的0D66。达到1以上，与一直传代培养6的甲烷氧化混合菌的生长速度相当，而甘油保存的甲垸氧化混合菌的0D,为0.3。结果说明，经本发明的保存方法保存后，甲垸氧化混合菌仍能保持较快的生长速度。3、耗甲垸能力的鉴定检测步骤l的甲烷氧化混合菌的甲烷去除率。试验设置3瓶重复，结果取平均值，结果见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验结果表明，本发明保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍然具有高效的去除甲烷的能力。4、菌群结构的鉴定分别提取步骤1的甲烷氧化混合菌的基因组DNA，通过PCR-DGGE的方法考察微生物群落的变化。PCR扩增所使用的引物如下341f—GC(序列表的序列l):907r(序列表的序列2):5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3'。PCR的反应条件为94'C预变性5min，循环过程为94'Clmin、退火温度lmin、72。C3min(其中退火温度从6555。C，每个温度2个循环)，72。C延伸7min。PCR反应产物用l.0%琼脂糖变性梯度凝胶电泳检验。琼脂糖凝胶电泳条件为6%的聚丙烯凝胶，40%-70%的变性剂梯度，85V恒压，60°C，840min。走胶结束后，采用SYBRGold(MolecularProbesTM，InvitrogenCo.，CA)染色lh，用紫外检测并照相。电泳图见图l。结果表明，采用本发明的方法保存后的甲垸氧化混合菌的DNA指纹和一直传代培养的甲垸氧化混合菌非常接近，说明本发明的保存方法能很好的保持菌群结构的多样性。序列表<110>清华大学<120>甲烷氧化混合菌的保存方法<130>CGGNARY92525<160>2<210>1<211>57<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>1cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgcccgcctacgggaggcagcag57<210>2<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223><400>2ccgtcaattcmtttgagttt20权利要求1、一种甲烷氧化混合菌的保存方法，包括将甲烷氧化混合菌菌体置于-70℃～-80℃冻存的步骤。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于每个保存容器中，所述甲烷氧化混合菌菌体的湿重为50mg以上。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化混合菌的制备方法包括如下步骤1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；2)将步骤1)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小时向密封瓶中置换入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲垸和空气的体积比为(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15):(95-85);传至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18);每48小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5:(2.5-3.5):(15-18)。5、如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，每10天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为10:90;传至第10代，得到甲垸氧化混合菌。6、如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于所述画S培养基配制方法如下将100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至lL，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到NMS培养基；每升所述溶液A的配制方法为将KN03lOg，MgS(V7H2010g，CaCl2.2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法为Fe-EDTAO.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl24H200.02g，CoCl2'6H200.05g，H3B030.015g，Na—EDTA0.25g，ZnS04'7H200.4g，NiCl2'6H20O.Olg，CuS04-5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法为Na2HP04'12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值调至6.8。全文摘要本发明公开了一种甲烷氧化混合菌的保存方法。本发明的方法中，包括将甲烷氧化混合菌菌体置于-70℃～-80℃冻存的步骤。本发明提供的保存甲烷氧化混合菌的方法没有引入其他碳源，可以稳定地保持混合菌群的结构和功能，并且操作方便，需要使用时，将冻存的菌体倒入培养基中培养即可。本发明将在甲烷氧化混合菌的保存及其工业化应用中发挥重要作用。文档编号C12N1/20GK101638631SQ20091009235公开日2010年2月3日申请日期2009年9月7日优先权日2009年9月7日发明者昊吴,翀张,程杨,皓江,邢新会,冰韩申请人:清华大学