专利名称：一种促进丁酸梭菌生长的菊粉酶解产物的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及生物制药技术及功能 性食品生产加工技术。
背景技术：
菊粉(Inulin)是由D"呋喃果糖以P -2， 1-糖苷键连接的多聚果糖， 其还原端接一个葡萄糖基，呈直链结构，聚合度一般在30左右，广泛 存在于菊芋(//e,/a"^2ws rt^ems1—、 菊苣(CTw'co^y z'w(y6船)、牛蒡 G4^^m)等多种尚未开发利用的植物中。干燥的菊粉为白色无定形粉 末，吸湿性很强，比重135。纯净菊粉无味。菊粉微溶于冷水，易溶 于热水，溶解度随温度的升高而增加。菊粉对热具有较强的稳定性， 在10(TC下加热也不易降解。菊粉溶液在pH小于4、高温下保持一段 时间可水解为果糖和葡萄糖。
利用菊粉酶，控制水解条件，菊粉能水解成为低聚果糖、果糖桨 甚至结晶果糖。果糖是一种天然营养甜味剂，适宜于高血脂、高血压 及肥胖病患者和糖尿病人食用。低聚果糖(fructooligosaccharide, FOS) 是一种功能性低聚寡糖，是指在蔗糖分子(GF)的果糖残基上通过P — l一2糖苷键连接l一3个D—果糖基而成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四 糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)组成的混合物。低聚果糖具有低热值、稳定、 安全无毒、黏度大、吸湿性强、不被胃肠道消化等理化特性，以及具 有改善肠道微生物区系、降低血清胆固醇和中性脂肪含量、改善血糖 含量、排毒清肠、防止龋齿和肥胖、促进Ca、 Mg、 Fe等矿物质的吸 收、有利于维生素合成、增强人体免疫力、美容等生理功能。
菊粉和低聚果糖都是益生素。益生素(Prebiotics)是一种不被消化的食物成分，能够选择性地刺激和促进一种或几种大肠内对宿主健 康有益的微生物(如双歧杆菌、乳酸杆菌)的生长和活力，改善宿主
健康。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是一种厌氧的革兰氏阳性芽 饱杆菌，发现其也具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌， 促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。有文献称，菊粉可以 与益生菌或益生素结合使用，具有协同作用，添加在食品中，促进益 生菌增殖，有益人体健康。
菊粉在菊芋块茎中的含量可占其干重的70%以上，而且菊芋这 种植物耐贫瘠、易种植、产量高，适应性强，在我国南方、北方、华 南、西北等很多省份均有广泛种植，极具开发价值。目前国内低聚果 糖的年生产能力约为3000~5000吨，据推算，我国目前低聚糖的市场 容量约为1 3万吨/年，预计2008年国内市场将达到8万吨。实际上， 据估计美国人平均每天消费菊粉和低聚果糖l一4g，欧洲人平均每天 消费3 — 10g(VanLoo等，1995)。利用菊粉酶直接水解菊粉生产果糖 和低聚果糖，无疑是开发利用菊粉资源的最佳途径，具有广阔的市场 前景。此外，如能将菊粉酶解后的产物与丁酸梭菌一起制成一种胶囊 药物，服用后便能改善人体肠道微生态环境，促进有益菌增殖和抑制 病原菌，具有预防和治疗某些疾病的功能，将十分有意义。
发明内容
本发明提供一种促进丁酸梭菌生长的菊粉酶解产物的制备方法。 一种促进丁酸梭菌生长的菊粉酶解产物的制备方法，在反应容器 中加入稀释的菊粉酶、质量百分比浓度为1% 20%菊粉液(菊粉的 水溶液)、pH为3 6的醋酸盐缓冲液；在4(TC 6(TC反应，反应结 束后，加热使菊粉酶失活，得到菊粉酶解产物；其中，所述的稀释的 菊粉酶、菊粉液和醋酸盐缓冲液的体积比为0.2 1: 5: 4。
加热使菊粉酶失活时，可以将反应容器置入沸水中，加热8 15
4分钟，优选10分钟，当然也可以在90 11(TC采用其他加热方式。 所述的稀释的菊粉酶，是采用市售的菊粉酶用水稀释得到。菊粉
酶进行稀释主要为了使其更好的分散并便于加入反应容器，稀释的比
例并没有严格限制，但为了保证反应效果，稀释菊粉酶的水的质量一
般为菊粉酶干品质量的5 20倍，优选10倍。
作为优选，所述的菊粉液的质量百分比浓度1% 15%，更优选
14.728%。
所述的pH为3 6的醋酸盐缓冲液是用0.2mol/LNaAc与 0.2mol/LHAc按一定比例调配，用精密pH计测定后达到所需pH的 缓冲溶液；优选pH为4.5，在此pH和菊粉液下酶解产生的低聚果糖 和果糖最多。
所述的在4(TC 6(TC温度下反应时间为lh 8h，酶解反应在6h后随 着时间增长变化不大，综合考虑优选6h
所述的菊粉酶解产物里成分是主要果糖和低聚果糖，其中
果糖的浓度为6.8mg/mL 58.4mg/mL;
低聚果糖的浓度为0.3mg/mL 28.3mg/mL。
经过酶解的产物用间苯二酚法和蒽酮比色法测定其中果糖和总 糖含量，从而来检测不同酶解条件下果糖和低聚果糖的变化情况。
所述的间苯二酚法测果糖含量，其主要步骤为:在10ml容量瓶中， 依次加果糖标准溶液、蒸馏水、待测样品液各0.5ml，显色剂各9.0ml， 加水定容。置于装有冷水的水浴锅中。将水浴加热至100'C并恒温8 min。取出后将容量瓶通过自来水流水冷却10min。用1 cm比色皿， 以试剂空白为参比，于473 nm处测其吸光度。绘制标准曲线，根据 样品溶液的吸光度查标准曲线，得出果糖含量。
所述的蒽酮比色法测定总糖含量，其主要步骤为吸取系列标准 溶液、样品溶液(含糖20 80ppm)和蒸馏水各2ml，分别放入8只 具塞比色管中，沿管壁各加入蒽酮试剂10ml，立即摇匀，放入沸水 浴中准确加热IO分钟，取出，迅速冷却至室温，在暗处放置IO分钟，用lcm比色杯，以零管调仪器零点，在620nm波长下测定吸光度， 绘制标准曲线。根据样品溶液的吸光度查标准曲线，得出糖含量。 低聚果糖浓度(mg/mL)-总糖浓度(mg/mL)-果糖浓度(mg/mL)。
本发明制备方法操作简便，对益生菌丁酸梭菌的生长有很好的促 进作用，具有极大的开发利用价值。
具体实施例方式
各实施中稀释的菊粉酶都是按1: 10稀释(稀释菊粉酶的水的质 量为菊粉酶干品质量的10倍)
实施例l
在容积25mL的比色管中，加入0.5mL稀释的菊粉酶，分别加入 5mL质量分数(质量百分比浓度)为1.272%的菊粉液，加入4mLpH 为5.0的醋酸盐缓冲液，在5(TC水浴下反应6h，反应结束后，取出 比色管放置于沸水中IO分钟，以使菊粉酶失活，随后冷却到室温，用 间苯二酚法测果糖含量和蒽酮比色法测定总糖含量，得出其中果糖浓 度为6.8mg/mL，低聚糖浓度为3.3 mg/mL。
实施例2
在容积25mL的比色管中，加入lmL稀释的菊粉酶，分别加入 5mL质量分数为14.728%的菊粉液，加入4mL pH为5.0的醋酸盐缓 冲液，在50。C水浴下反应6h，反应结束后，取出比色管放置于沸水 中10分钟，以使菊粉酶失活，随后冷却到室温，用间苯二酚法测果 糖含量和蒽酮比色法测定总糖含量，得出其中果糖浓度为58.4mg/mL, 低聚糖浓度为2.5 mg/mL。
实施例3
在容积25mL的比色管中，加入lmL稀释的菊粉酶，分别加入 5mL质量分数为12%的菊粉液，加入4mLpH为4.5的醋酸盐缓冲液,在45'C水浴下反应6h，反应结束后，取出比色管放置于沸水中10分 钟，以使菊粉酶失活，随后冷却到室温，用间苯二酚法测果糖含量和 蒽酮比色法测定总糖含量，得出其中果糖浓度38.0 mg/mL,低聚糖浓度 为28.3 mg/mL。
实施例4
在容积25mL的比色管中，加入lmL稀释的菊粉酶，分别加入 5mL质量分数为4%的菊粉液，加入4mL pH为3.5的醋酸盐缓冲液, 在55'C水浴下反应6h，反应结束后，取出比色管放置于沸水中10分 钟，以使菊粉酶失活，随后冷却到室温，用间苯二酚法测果糖含量和 蒽酮比色法测定总糖含量，得出其中果糖浓度13.7 mg/mL，低聚糖浓度为0.3 mg/mL。
菊粉酶解液促进丁酸梭菌的生长试验
采用MRS基础培养基添加实施例4制备的菊粉酶解产物10%对 丁酸梭菌进行培养，以不加酶解产物的培养基为空白对照，培养时间 为48h，培养基和计数方法如下 丁酸梭菌的培养和接种
培养基配方葡萄糖2.44%,酵母膏2.08%， NaHC03 0.1%, MnS04 H20 0.02%， MgS04 7H20 0.02%, CaCl2 0.002%,胰蛋白 胨1%， (NH4)2SO40.1%， PH8.55(用稀NaOH、 HCl调节)。
使用冲氮罐对培养基进行冲氮以排除氧气，冲氮一分钟后用塞子 塞紧，在12rC灭菌20min。在无菌室中，用灭过菌的针头按5% 10 %的接种量插入橡胶塞中进行接种。37"C培养箱培养24 48小时。 丁酸梭菌计数血球计数板法
取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片。将待测菌液充分摇匀后， 用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘加入计数板，计数室内不能有气泡。 静置片刻，用显微镜观察并计数。计数时若使用刻度为25X16 (大格)的计数板，则数四角的4个大格(即100小格)内的菌数。如用 刻度为16X25 (大格)的计数板，除数四角的4个大格外，还需数 中央1个大格的菌数(即80小格)。每小格中菌数以5-10个为宜， 如菌液过浓可适当稀释。每个样品重复计数3次，取其平均值，按下 式计算样品中的菌数。
每ml菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数X4X106X
菌液稀释倍数。
培养结束后，含有酶解产物的培养基中测出培养48小时丁酸梭菌 细胞数为6.56Xl()8CFU/ml,空白为3.04X 108CFU/ml,这说明菊粉的酶
解产物能促进丁酸梭菌的生长。
权利要求
1、一种促进丁酸梭菌生长的菊粉酶解产物的制备方法，其特征在于，在反应容器中加入稀释的菊粉酶、质量百分比浓度为1％～20％菊粉水溶液、pH值为3～6的醋酸盐缓冲液；在40℃～60℃反应，反应结束后，加热使菊粉酶失活，得到菊粉酶解产物；其中，所述的稀释的菊粉酶、菊粉水溶液和醋酸盐缓冲液的体积比为0.2～1∶5∶4。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加热使菊粉酶 失活时，将反应容器置入沸水中，加热8 15分钟。
3、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的稀释的 菊粉酶，是菊粉酶用水稀释得到，稀释菊粉酶的水的质量为菊粉酶干 品质量的5 20倍。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的菊粉水 溶液的质量百分比浓度1% 15%。
5、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的醋酸盐 缓冲液的pH值为4.5。
6、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的在4(TC 6(TC温度下反应时间为lh 8h。
7、 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的在4(TC 6(TC温度下反应时间为6h。
全文摘要
本发明公开了一种促进丁酸梭菌生长的菊粉酶解产物的制备方法，在反应容器中加入稀释的菊粉酶、质量百分比浓度为1％～20％菊粉液(菊粉的水溶液)、pH为3～6的醋酸盐缓冲液；在40℃～60℃反应，反应结束后，加热使菊粉酶失活，得到菊粉酶解产物；其中，所述的稀释的菊粉酶、菊粉液和醋酸盐缓冲液的体积比为0.2～1∶5∶4。本发明制备方法操作简便，对益生菌丁酸梭菌的生长有很好的促进作用，具有极大的开发利用价值。
文档编号C12P19/00GK101624611SQ20091010155
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者何国庆, 傅明亮, 婧 刘, 章海锋, 辉 阮, 陈启和 申请人:浙江大学