专利名称：：一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及植物分子遗传学领域，具体地，本发明涉及一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法。
背景技术：
：橡胶树是我国热带地区种植的一种极为重要的经济作物。橡胶树种植业是在20世纪50年代初期，根据国家战略需要发展起来的。经过广大育种工作者和农垦职工几十年的共同努力，我国的植胶业取得了突破性发展，成为我国热区农业的支柱性产业。目前我国已成为世界第五大产胶国。我国的植胶业良种化进程也得到了快速提高，已成功培育出适合我国植胶环境条件的新一代优良橡胶树品种如热研7-33-97、大丰95、云研277-5、云研77-2、文昌11等。目前我国现有自育大规模推广级品种14个，中规模推广级品种28个。这些优良品种在我国天然橡胶生产中的推广应用，极大地促进了我国植胶业的发展。橡胶树品种的改良为我国天然橡胶产量的提高做出了具大贡献，促进了植胶业的发展，然而橡胶树品种在生产中也存在以下几方面的问题(1)橡胶树的遗传背景极其狭窄，目前各产胶大国所使用的橡胶树品种90%是由数十株来自原产地亚马逊河的野生种质繁衍而来，我国的自育品种更是来源于RRIM600、PR107、GT1等少数几个栽培品种，因此橡胶树品种在形态上差异不大，要经验丰富的技术人员才能根据植株形态特征区分部分品种；(2)橡胶树是异花授粉作物，品种的繁殖采用的是无性繁殖方式，操作方法简单，使用单位可以自行嫁接繁殖，品种来源缺乏统一管理，品种的纯度和质量难于保证；(3)橡胶树是多年生乔木，要在定植6年后才能有经济价值，加上我国属世界植胶地的最北端，各植胶区的植胶条件差异较大，不同特性品种只适合在特定的环境条件下应用，品种使用不当，将会给生产造成不可挽回的损失，其损失远远大于一年生作物。因此，对品种进行准确地鉴定，以提高品种纯度和质量，就显得尤为重要。当前橡胶树品种的鉴定主要依靠形态学鉴定方法。我国延用的是在1963年创立的以蜜腺、大叶枕、小叶柄、叶脉、叶形、株形等形态特征对品种进行区分鉴定的方法，但由于橡胶树种质材料来源狭窄，且经过50多年的选择育种和近亲繁殖，目前生产上使用的品种间形态特征差异较小，同胞和半同胞后代用形态学鉴定方法很难进行区分。而且此种方法容易受操作人员主观因素的影响。随着分子生物学研究的不断深入，DNA分子标记已广泛地应用于植物遗传育种研究的各个领域。由于DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映，不受外界环境因素的影响，所以应用DNA标记进行品种的鉴定，有利于提高鉴定的准确性。目前研究人员已在多种植物中开展了应用分子标记鉴定品种的研究，如水稻、大麦、小麦、大豆、豇豆、番茄、苹果、板栗等。在橡胶树方面，已有的研究成果也表明，分子标记可以用于品种鉴定。Low等对20种橡胶树种质和7个橡胶品种进行了RFLP指纹图谱技术的研究，结果表明RFLP标记可以将全同胞品种区分开，如PR255和PR261,RRIM901和RRIM905等。Besse等利用人源微卫星探针33.6和33.15对73个橡胶树种质进行RFLP指纹图谱分析，结果所选的73个种质逐个被区分开，而且同一品种内不同植株的DNA指纹完全相同。Saha等用4个SSR引物可将27个无性系区分开。SSR(simplesequencerepeat,简单重复序列)标记在植物遗传育种研究中己成了最为重要的分子标记。SSR又称微卫星DNA(microsatelliteDNA)或STR(shorttandemRepeat,短串联重复)，广泛分布于人类和其他动植物基因组中，是一类由几个(多为16个)碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，在100bp以内。如(GA)n，(AT)n，(GA)n，(GATA)n等重复，其中n代表重复次数。根据微卫星DNA两端序列多是相对保守序列的原理设计一对特异性引物，采用PCR技术扩增每个位点微卫星DNA序列，再通过电泳分析核心序列长度的多态性即为SSR多态性标记。SSR标记不但具有多态性高、共显性、重复性好、数量丰富和对基因组覆盖范围广等特点，而且操作简单、易检测。
发明内容本发明的目的是提供一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法，其是通过绘制橡胶树品种的DNA指纹图谱，建立了一种基于DNA水平的橡胶树品种鉴别方法，具有快速、简便、准确等优点，有效地解决了生产中橡胶树品种鉴定难的问题，并能对橡胶树品种进行知识产权保护提供依据。本发明采用的技术原理是依据SSR标记具有多态性高、重复性好等特性，可在橡胶树品种DNA水平上产生多态性的DNA指纹图谱的特性，通过比较分析，从中筛选出各品种的特异性DNA指纹图谱，建立各品种的特征指纹库，从而将各品种逐一区分开。为实现本发明的目的，所采用的技术方案是一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法，其步骤如下1、品种标准指纹图谱库的建立1)、分别用5对SSR引物(rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73)对全部135个橡胶树品种进行PCR扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得各品种对应于每个SSR位点的各个等位位点的带型分布，并对每条带进行编号。所述引物序列为rbm24F:atctgcataatagttgtaaccacarbm24R:agctctcatcatagtgaagttctggrbirGGF:catctccaccacctacarbm36R:aggagagcaataaccaacrbm50F:atcaagcaaaga犯cctcrbm50R:gtaagtgctcaacctctgtrbm55F:tatggctatgttctgctatgcrbm55R:ggactcttgatgattttggttrbm73F:tcggttggtttaccatgacarbm73R:acatcacatgagtgtatctgatctc2)、依据引物在所有品种中的多态性指数高低将5个引物进行排序，5个引物的排列顺序为rbm36>rbm24>rbm55>rbm50>rbm73。3)、分别分析各引物在所有品种中的扩增带型，建立40个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开。4)、选取多态性较强的引物rbm36和rbm24形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的95个品种中的带型，可建立55个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开。5)、选取引物rbm36、rbm24和rbm55形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的40个品种中的带型，可建立31个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开。6)、选取引物rbm36、rbm24、rbm55和rbm50形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的9个品种中的带型，可建立6个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开。7)、选取引物rbm36、rbm24、rbm55、rbm50和rbm73形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的3个品种中的带型，可建立这3个品种的特异指纹图谱，将这3个品种与其它品种区分开。8)、将用5个引物建立的135个品种的特异指纹图谱作为品种的标准指纹图谱，形成标准指纹图谱库，见附表l。2、品种检测与鉴定1)、提取待测品种的DNA，分别用rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73引物进行扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得待测品种的扩增带型。2)、分析单个引物在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作。3)、分析rbm36和rbm24引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作。4)、分析rbm36、rbm24和rbm55引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作。5)、分析rbm36、rbm24、rbm55和rbm50引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作。6)、分析rbm36、rbm24、rbm55、rbm50和rbm73引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认为待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则认定待测品种为新品种，可将其带型收入标准指纹图谱库中。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本发明工艺过程简单，采用5对多态性较强的SSR引物绘制了我国135个橡胶树品种的DNA指纹图谱，建立了一种不受环境、发育时期及人为因素影响，且快速、简便、准确的基于DNA水平的橡胶树品种鉴别方法，可用于进行橡胶树品种鉴别，解决生产中品种鉴定难的问题，并能对橡胶树品种进行知识产权保护提供依据。具体实施方式下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例1橡胶树品种RRIM600的鉴定1)、提取待测品种RRIM600的DNA，分别用rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73引物进行扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得待测品种的扩增带型，并依据片段大小对其编号，分别为00(rbm24)、EO(rbm36)、A°A3(rbm50)、Zj(rbm55)、B3B3(rbm73)。2)、分析单个引物在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，可检索到标准库中的品种RRIM600的带型为AQA3，与待测品种的带型A^A3(rbm50)相同，则认定该待测品种为RRIM600。实施例2橡胶树品种热研8-79的鉴定1)、提取待测品种热研8-79的DNA，分别用rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73引物进行扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得待测品种的扩增带型，并依据片段大小对其编号，分别为yO(rbm24)、HJ(rbm36)、A2A3(rbm50)、Zg(rbm55)、B3B3(rbm73)。2)、分析单个引物在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，未检索到相同带型的品种，则进行下步骤操作。3)、分析rbm36和rbm24弓I物组合在待测品种中的带型，即HJyO,并在标准指纹图谱库中检索，未检索到相同带型，则进行下步操作。4)、分析rbm36、rbm24和rbm55引物组合在待测品种中的带型，即HJyOZg，并在标准指纹图谱库中检索，可检测到待测品种的带型与标准库中品种热研8-79的带型相同，则认定待测品种为热研8-79。序列表<110>中国热带农业科学院橡胶研究所安，泽伟程，汉黄，华孙<120>—种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法<130>referencenumber<160>10<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>24<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>1atctgcataatagttgtaaccaca24<210>2<211>25<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>2agctctcatcatagtgaagttctgg25<210>3<211>17<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>3catctccaccacctaca17<210>4<211>18<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>4aggagagcaataaccaac18<210>5<211>18<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>5atcaagcaaagaaacctc<210>6<211>19<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>6gtaagtgctcaacctctgt<210>7<211>21<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>7tatggctatgttctgctatgc<210>8<211>21<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>8ggactcttgatgattttggtt<210>9<211>20<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>9tcggttggtttaccatgaca<210>10<211>25<212>DNA<213>Heveabrasiliensis<400>10acatcacatgagtgtatctgatctc18192121202权利要求1、一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法，其特征在于其步骤如下1)、品种标准指纹图谱库的建立①、分别用5对SSR引物(rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73)对全部135个橡胶树品种进行PCR扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得各品种对应于每个SSR位点的各个等位位点的带型分布，并对每条带进行编号；所述引物序列为rbm24Fatctgcataatagttgtaaccacarbm24Ragctctcatcatagtgaagttctggrbm36Fcatctccaccacctacarbm36Raggagagcaataaccaacrbm50Fatcaagcaaagaaacctcrbm50Rgtaagtgctcaacctctgtrbm55Ftatggctatgttctgctatgcrbm55Rggactcttgatgattttggttrbm73Ftcggttggtttaccatgacarbm73Racatcacatgagtgtatctgatctc②、依据引物在所有品种中的多态性指数高低将5个引物进行排序，5对引物的排列顺序为rbm36＞rbm24＞rbm55＞rbm50＞rbm73；③、分别分析各引物在所有品种中的扩增带型，建立40个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开；④、选取多态性较强的引物rbm36和rbm24形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的95个品种中的带型，可建立55个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开；⑤、选取引物rbm36、rbm24和rbm55形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的40个品种中的带型，可建立31个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开；⑥、选取引物rbm36、rbm24、rbm55和rbm50形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的9个品种中的带型，可建立6个品种的特异指纹图谱，将这些品种与其它品种区分开；⑦、选取引物rbm36、rbm24、rbm55、rbm50和rbm73形成引物组合，分析这一引物组合在剩余的3个品种中的带型，可建立这3个品种的特异指纹图谱，将这3个品种与其它品种区分开；⑧、将用5个引物建立的135个品种的特异指纹图谱作为品种的标准指纹图谱，形成标准指纹图谱库；2)、品种检测与鉴定①、提取待测品种的DNA，分别用rbm24、rbm36、rbm50、rbm55、rbm73引物进行扩增，在ABI3730基因分析仪上对扩增产物进行检测，获得待测品种的扩增带型；②、分析单个引物在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作；③、分析rbm36和rbm24引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作；④、分析rbm36、rbm24和rbm55引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作；⑤、分析rbm36、rbm24、rbm55和rbm50引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认定待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则进行下步操作；⑥、分析rbm36、rbm24、rbm55、rbm50和rbm73引物组合在待测品种中的带型，并在标准指纹图谱库中检索，如果待测品种的带型与标准库中的某一带型相同，则认为待测品种与标准库中的某一品种相同；如果未检索到相同带型，则认定待测品种为新品种，可将其带型收入标准指纹图谱库中。全文摘要本发明公开了一种快速高效准确的橡胶树品种鉴定方法，其是依据SSR标记具有多态性高、重复性好等特性，在橡胶树品种DNA水平上产生多态性的DNA指纹图谱的特性，通过比较分析，从中筛选出各品种的特异性DNA指纹图谱，建立各品种的特征指纹库，从而将各品种逐一区分开，其过程包括1)品种标准指纹图谱库的建立；2)品种检测与鉴定。本发明工艺过程简单，通过绘制橡胶树品种的DNA指纹图谱，建立了一种快速、简便、准确的基于DNA水平的橡胶树品种鉴别方法，可用于进行橡胶树品种鉴别，解决生产中品种鉴定难的问题，并能对橡胶树品种进行知识产权保护提供依据。文档编号C12Q1/68GK101603090SQ20091011843公开日2009年12月16日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者安泽伟,汉程,黄华孙申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所