改良多聚核苷酸合成的方法和成分的制作方法

专利名称：改良多聚核苷酸合成的方法和成分的制作方法
技术领域：
本发明涉及热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶及它作为标记蛋白，同时还涉及用 一个基团保护寡核苷酸引物的3'末端，以及提高从各种样品中扩增和分析 DNA/RNA的灵敏度和特异性的方法。该发明能广泛应用于包括医学遗传研究、 诊断，病原体检测，法医及动植物遗传应用等各种样品中进行DNA/RNA扩增和 分析。
背景技术：
多聚核苷酸合成是一个信息转移的过程，通常需要以其它多聚核苷酸分子作 为模板。一般来说，模板依赖的多聚核苷酸合成包括多聚核苷酸模板分子的变性， 引物分子的配对及在聚合酶作用下，核糖核苷一5'三磷酸在引物3'末端的延 伸。该过程常在体外重复多次，如聚合酶链式反应(PCR)。
尽管这种信息转移的过程非常准确，但在信息转移的过程中涉及的生物分子 机制没有错误校正。这些错误在自然界中是突变的来源，而在体外反应，如PCR、 随机引物标记、DNA测序和逆转录中则会引进显著的失真。引物结合到非同源 的位点(错配)，链延伸过程中在多聚核苷酸酶作用下的错误配对都会引起错误。
各种热稳定DNA聚合酶在高至95'C仍保持稳定，如从热稳定细菌rtenmw 叫wa"cws中分离的Taq DNA和从古细菌P,ococcws/wn'oww分离得到Pfii DNA 聚合酶，减少了错配，从而提高了PCR反应的灵敏度和特异性。
从7Tzerm^ Amm^M^分离得到的热稳定Tth聚合酶可具有反转录酶和 DNA聚合酶的活性(Myers and Gelfand, Biochemistry 30:7662-7666(1991)), 克服 了嗜温性滤过性毒菌反转录酶只能在低温下起作用及低温下不能"读"RNA模 板的二级结构的限制。在反转录过程中，可用Tth聚合酶在较高温度进行，从而 剔除RNA的二级结构，使合成全长cDNA成为可能。在多数的PCR反应中，引物应该特异性地结合在目标序列。从而只有在温 度较高时引物才能特异性结合，但在某一PCR反应阶段中，尤其是在达到PCR 所需的温度前将各组分混合，混合物必定经历较低的温度(如室温)，在较低温 度下，引物会与非目的序列配对，或反应混合物中的其它引物分子结合，产生非 特异性延伸产物和引物二聚体，千扰来自于目的核酸的特异性产物。这些副产物 会导致较高的背景，降低扩增的效率和反应的特异性。
尽管PCR技术新近取得了进步，但仍存在高背景的DNA错配和引物寡聚化 的问题。尤其在应用PCR技术进行诊断时，目标DNA只有少数的几个挎贝(Chou et al. Nucleic Acid Res. 20:1717-1723(1992))。已知由DNA聚合酶由引起非特异 性链延伸通常发生在热循环幵始前，所有反应物在室温下混合，从而导致非目的 假的扩增产物。
目前，报道有三种方法可减少这些副反应。第一个方法，叫"热启动"PCR， 有各种变化形式(Chou et al. Nucleic Acid Res. 20:1717-1723(1992)); D'Aquila et al. Nucleic Acid Res. 19:3749(1991))，其共同特点是所有其它试剂加热到72'C后， 才加入最后一种试剂，通常为聚合酶，这样起到防止引物错配和寡聚化的作用。 虽然这种方法确实能提高特异性，减少副产物，但在进行大批量样品时则极不方 便，反应混合物变得极容易污染及容易出错。
第二种方法(Taq启动)，在完全反应混合物中加入聚合酶的抗体与聚合酶结 合，如可把商品名为"TaqStart" Taq DNA聚合酶抗体预先与Taq DNA聚合酶 结合。该抗体能在室温下抑制聚合酶活性(Kellogg et al. Biotechniques 16:1134-1137(1994))， 一旦反应进入热循环，抗体就会因热变性而失活，释放出 活性DNA聚合酶。但是用该方法来减少非目的序列的缺点是Taq DNA聚合酶抗 体必须存放在-20。C直到使用，即试剂盒必须在控制的温度下包装和运送，从而 提高了成本。同时，每个PCR反应需要数量不少的抗体(大约1微克抗体/5 U Taq)。同时，PCR产物中的抗体干扰PCR产物的进一步免疫化学分析，如ELISA。
第三种方法，经改良的Taq DNA聚合酶，称作AmpliTaq Gold,用在PCR 反应中(Birch，D.E.etal. Nature 381:445-6(1996))。 AmpliTaq Gold聚合酶在室温 下无活性，在超过％°C下加热至少5分钟来恢复活性。因此，需要增加一步95°C 的预热PCR。虽然AmpliTaq Gold能在PCR循环中被激活，而不需要预PCR加热这一步，但是，需要增加IO个或更多的循环来得到相等的产量。此外，许多 研究者发现用AmpliTaq Gold很难扩增某些长度的目的序列，如从人类基因组 DNA中扩增4kb的片断。
因而生物技术和分子生物学需要一种更好的方法，减少错配和引物寡聚化 以提高多聚核苷酸合成的特异性。
同时，生物技术和分子生物学领域还需要标记物来研究基因表达，调节和功 能研究。例如，在功能基因组计划中需要用来确定新发现基因的表达模式。目前， 有几种方法可以用于研究基因调控和表达，包括，P-半乳糖和荧光素酶编码序列 的融合蛋白的合成(Reviewed in T.J.Silhavy and J.R.Beckw他，Microbiol. Rev.49:398(1988);and G.S.A.B. Stewart and P. Williams, J. Gen. Microbiol" 138:1289(1992))。在该领域曾报道过的可作为标记物的其它蛋白是绿色荧光蛋白 (reviewed by Misteli and Spector, Nat Biotechnol. 15(10):961-4(1997);Cormack, Curr Opin Microbiol 1(4):406-10(1998)).但是这些酶温度敏感，必须在样品准备后短期 内进行分析。
目前，这种应用方法或类似的酶确定某种配基及其浓度同样具有上述的缺 点，现在需要一种新的方法，该方法应用一种酶，它的活性容易测定而且温度提 高时活性不会迅速被破坏。

发明内容
本发明的成分之一是3'末端羟基被一基团保护的寡核苷酸引物。本发明中 3'末端经修饰的引物阻止在DNA聚合酶或者反转录酶作用下的链延伸反应。即 使所有反应必须的成分包括dNTP和金属辅因子存在也不能进行链的延伸反应。
本发明并提供了在先前存在的引物3'羟基末端增加一个核苷酸的方法包 括(A).把含有目的多聚核苷酸序列分子样品和含有以下成分的反应混合物混合 (l)引物与既定目的序列互补，引物3'羟基末端被基团保护阻止链延伸；(2)热 稳定阻断基团去除酶，即TBGRE; (3)热稳定多聚核苷酸聚合酶，(3)至少一个核 糖核苷一5' —三磷酸(B).提高混合物温度超过38'C，从而产生引物延伸产 物。首选的例子，该方法最好加一个步骤(C)变性引物延伸产物，产生至少一个 额外的引物延伸反应。本发明的另一成分是纯化的或者重组的热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶。只有 在足够高温下，3'多聚核苷酸磷酸酶才可以去除修饰引物3'末端的磷酸残基。 只有混合物处在足够高温下，3'磷酸残基去除后才能开始和持续链延伸反应， 从而阻止了非特异性扩增。本发明提供了从Pfu而来的重组热稳定3'多聚核苷 酸磷酸酶。
本发明同时提供从超高温古细菌P /"n'oy^产生重组热稳定3'多聚核苷酸磷 酸酶的方法。
本发明还包括生产来自嗜热古细菌P /W7'M肌的重组热稳定3'磷酸酶作为标
记蛋白的应用。如，本发明可快速检定体外表达系统是否成功表达目的蛋白，该 方法包括(l)将编码感兴趣蛋白的DNA序列分子与编码3'磷酸酶活性的DNA序 列融合；(2)将融合基因置于到合适的表达载体上；(3)表达融合DNA分子；(4) 将表达细胞加热至70°C; (5)检测热稳定3'磷酸酶活性。


图l，阐述改进PCR特异性和灵敏度的可仿效方法的示意图。(A)在较低的 温度，DNA聚合酶(指Pol.)作用下传统引物错配至非目的序列。新合成的DNA 序列可在随后的循环中作为模板，从而引起高背景及降低目的产物的产量。(B) PCR反应中用3'末端被阻断基团修饰的引物，3'阻断基团阻止了低温下的错配引 物延伸，而热稳定基团去除酶(3'TBGRE)只有在55'C以上才能特异、有效地去除 3'阻断基团，转化修饰引物为传统引物，在聚合酶作用下进行随后的循环中合成 DNA。结合修饰引物和3'基团去除酶的功能可提高PCR和PCR相关技术的特异 性和灵敏度。左边的温度条给出反应发生的温度。
图2，从尸"ococc^ 克隆3'多聚核苷酸磷酸酶的编码基因，构建
pET-17bPNPs酶表达载体的流程示意图。
图3最后一步用Mono Q column (HR 5/5， Pharmacia Biotech)层析纯化的P /W7'w^重组3'多聚核苷酸磷酸酶用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图4,在温度依赖方法中，户/wWM^3'多聚核苷酸磷酸酶特异性地去除寡核 苷酸引物的3'磷酸残基的放射自显影图。例子7中描述的反应混合物用16%-聚 丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。3'末端有磷酸基的寡核苷酸转迁移速度快于没有磷酸基的(箭头)。
图5，放射自显影图，引物延伸需要结合例8中的尸/"r/tm^ 3'多聚核苷酸 磷酸酶，其中5'sup.32P标记引物的3'末端被磷酸基修饰。
图6,琼脂糖凝胶电泳图，比较用修饰引物加上P. furiosus 3'多聚核苷酸磷 酸酶和用传统引物从50ng人类基因组DNA中扩增的PCR产物(用Taq和PfU DNA聚合酶扩增2.8kb(3-球蛋白基因片段)的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1是lkb 的DNA分子量标准物，泳道2， 3， 4及5是传统引物扩增的PCR产物。这些泳 道的样品含有显著的非特异性产物和引物二聚体(P-dimer)。泳道6， 7， 8， 9 和10是经修饰的一对引物和在3'末端加上3TBGRE (P. furiosus 3'多聚核苷酸磷 酸酶)扩增得到的PCR产物。
图7，琼脂糖凝胶电泳图，比较应用经修饰引物及TBGRE (纯化的3'多聚 核苷酸磷酸酶)和经传统引物扩增的PCR产物(用Taq聚合酶扩增U5bp的HIV gag基因)。泳道0是lOObp分子量的DNA标准物(Life Technologies)。如例 IO所述，泳道l、 2、 3、 4、 5和6是用一对3'经修饰的引物加上3'多聚核苷酸 磷酸酶扩增的PCR产物。泳道7、 8、 9、 10、 11和12是一对传统引物扩增的 PCR产物。所有这些PCR反应用200ng的人类基因组DNA作为模板。图上端 标示了在PCR中作为模板的HIV gag基因DNA分子。
图8，从基因推导出来的多肽(SE Q ID NO:6)的氨基酸序列对比以及来自 ZwnVbW//的Ph l卯5 (SEQ ID NO: 16)和来自P W;w7的Pab 1103 (SEQ ID NO:17)的假设开放阅读框。(*)表示一致，(:)表示相似的。
具体实施例方式
在以下的说明中，广泛利用到许多重组DNA技术术语，为了能令说明书和 权利要求书明晰且更好地理解，提供了以下术语的定义。
足够纯化"足够纯化"指的是目的纯化蛋白本质上不含有与目的蛋白所天 然结合的杂质酶的酶活性。细胞组分杂质包括，但不限于，5'磷酸酶、激酶、 连接酶、外切酶、内切酶或DNA聚合酶。
纯化此处是指相比较于培养物中的平均水平提高酶活性，即提高每单位重 量蛋白的活性，不是指将蛋白纯化得非常均一。整合此处指成为核酸(例如，DNA)分子或引物的一部分。
热稳定指能耐(抵抗)热变性的酶。嗜温性酶加热后可被失活，例如
T4的核苷酸激酶的3'磷酸酶活性在75i:/min就失去。在此发明中，相比较于 嗜温性酶如T4的核苷酸激酶，热稳定的3'磷酸酶活性更能耐受热(高温)不 失活。实际上， 一个热稳定酶并不是意味这种酶能无限制(完全)地耐高温，高 温(热)处理还是在某种程度上会降低酶的活性。相比较于嗜温性酶， 一个热稳 定酶往往具有更高的最适温度。
同源性在此用于两个不同核酸序列之间的比较。为此同源性的评价可认为
是相同碱基的百分比。不包括为了获得较好的序列对比而引入的缺口。同源性比 值可用核酸杂交技术评价，众所周知，也可通过比较两个序列的精确碱基的序列
来确定。本说明书中的"充分同源序列"指的是序列("A")能和序列("B") 杂交(序列B与本发明的序列互补)。因此在A序列和B序列之间形成的双链分 子的Tm值在2(TC范围内浮动，B序列和发明序列之间形成的双链分子的Tm值 应该在1(TC范围内浮动。
此外，同源性实质上可理解为A和B在严谨的条件，即温度介于50-70'C, 双倍浓度的SSC缓冲液(2倍NaCl 17.5 g/l及8.8 g/l柠檬酸钠)，0.1%十二烷基 硫酸钠(SDS)下杂交，然后用在相同温度下，用浓度减少的SSC缓冲液，如l 倍、1/2、 1/10强度SSC (含0.1。/。SDS)来漂洗。然而，最适条件会有很大不同， 取决于特定杂交反应。
本发明"末端用阻断基团改造的寡核苷酸"是指一个合成的或天然的寡核苷 酸在其3'末端的氧原子与阻断基团共价结合。例如阻断基团是3'磷酸基和3' 磷酸羟乙酸。
阻断基团由一个热稳定用相应的热稳定酶去除，此酶称之为"热稳定的3'-阻断基团去除酶(TBGRE)"。本发明的TBGRER指一种能在38。C以上温度有效 去除3'-阻断基团的天然的或者人工酶。TBGRE例子包括3'多聚核苷酸磷酸 酶和3'多聚核苷酸磷酸二酯酶，它们能分别去除3'磷酸基和3'磷酸羟乙酸 基。此外一个熟练的技术人员知道某些氨基酸替代物被认为不影响多肽的活性 (例如，用GCG的BESTFIT程序来判断保守氨基酸替代物)。2个多肽有相似 的序列就可能有相似的功能。两个多肽间的"相似性"通过比较氨基酸序列和它们的保守氨基酸替代物来确定。这是常见的方法，可用计算机程序如BLAST来 完成。
其它本文所用的分子、细胞生物学和DNA重组上的术语应该被该领域的普 通技术人员所掌握。
提髙多聚核苷酸合成的特异性及改进PCR反应灵敏度和特异性的方法
技术领域：
本发明通过在引物的3'羟基末端加上一个阻断基团，该基团可用相应的热稳 定3'基团去除酶去除，热稳定3'基团去除酶只有在反应开始，温度升高时才恢复 活性，从而克服了在室温下由于引物错配而引起的非目的核酸的扩增。
本发明中，提高多聚核苷酸合成的特异性和灵敏度的方法，如图1所示。(A)， 低温时，传统引物与非目的核酸发生错误配对(褪火)，然后在聚合酶作用下引 物延伸。新合成的DNA在较高的温度时，可作为模板，例如在随后的PCR循环 中，从而产生高的背景和低产量的目的产物。相反，(B)显示使用3'末端有阻 断基团修饰的引物时，3'阻断基团阻止较低温度下的错配引物延伸。而在较高的 温度时，TBGRE能特异、有效地去除相应的3'阻断基团，经修饰引物转化为传 统引物，在DNA聚合酶的作用下合成DNA。结合经修饰的引物和TBGRE的作 用能提高PCR及PCR相关技术的特异性和灵敏性。左边的垂直温度条显示了这 些反应发生的温度。
在本发明之前，从来没有人使用过以保护引物3'羟基末端来提高合成多聚核 苷酸分子的特异性。
本发明中的阻断基团具体来说可以是磷酸残基，而TBGRE相应是热稳定3' 多聚核苷酸磷酸酶。本发明中的阻断基团是磷酸羟乙酸，TBGRE是热稳定3'多 聚核苷酸磷酸二酯酶。
在本发明中，3'多聚核苷酸磷酸酶在温度低于38'C时没有任何可检测的活性， 温度高于95'C时仍有活性。该种酶的最适温度范围为高于4(TC，超过45'C较好， 超过50'C仍很好，超过55'C更好，超过60'C最好。
例如，DNA合成中，与DNA/RNA模板互补的寡核苷酸引物的3'末端的磷 酸残基，可阻止在逆转录酶(RT)或者DNA聚合酶作用下的引物延伸。在某个较 高温度(例如高于38°C)，热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶能去除引物3'末端的磷酸基团，令引物在RT或者DNA聚合酶作用下延伸。引物与非特异目的序列配对(褪 火)，结合3'末端带磷酸基团的寡核苷酸引物和3'多聚核苷酸磷酸酶作用能阻止 低温下，在RT或者DNA聚合酶作用下的非目的序列的引物延伸。
本发明采用3'末端受保护的引物和TBGRE可剔除引物错配以及引物二聚 体。适合于本发明的TBGRE，在温度低于38'C以下没有任何可检测的活性。由 于在本发明中只需要使用非常少量的TBGRE，可以避免为了与DNA聚合酶分 隔开来，而把PCR试剂和抗体封装的麻烦。
之所以存在这些优点是因为可以把3'羟基末端带修饰的引物、TBGRE与热 稳定DNA聚合酶和/或者反转录酶混合在一起。在任何温度下，即使反应混合物 中含有反应所需的各种成分，包括dNTP和金属辅因子，经修饰的引物也不会在 DNA聚合酶和/或者反转录酶的作用下延伸。当温度高于38'C时，TBGRE能有 效地去除引物的3'末端的阻断基团，使之成为DNA聚合酶和/或者反转录酶合适 的引物。
目前本发明的方法不影响扩增产物处理和分析，该方法还有另外的优点是能 应用到自动化中，而这恰好是传统方法，如用胶囊储存PCR试剂，用DNA聚合 酶的抗体或者修饰DNA聚合酶所不能做到的。
因此，在使用3'带修饰引物和相应的TBGRE下，可通过调节反应混合物温 度达到或者低于38'C来控制PCR，提高温度到达所需水平来持续反应。
本发明提供了经3'-阻断基团修饰的寡核苷酸和有特异活性去除寡核苷酸分 子3'末端阻断基团而不是5'末端的TBGRE。
3'磷酸酶的纯化
从嗜热古细菌尸,ococc^ (Pfti).中纯化热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶 是本发明另一组成部分。在4-20。/。SDS的PAGE中，通过与标准分子量(Protein BenchMarker， Life Technologies, Inc. Rockville, Md.)相比较， 3'多聚核苷酸磷酸酶分子量为31kD,温度高于38。C时，高于45'C效果较好，高 于5(TC效果更好，它能特异有效地去除引物3'末端的磷酸基团，为DNA聚合酶 和/或者反转录酶提供合适的弓I物。
这种酶的一个独特性质是在74'C有最高的活性，在37"C时或以下活性很低。因此可通过从74'C降到37'C的低温下来关闭酶的活性。
目前，已知3'多聚核苷酸磷酸酶的活性与一些参与核酸新陈代谢有关的纯化 酶，如T4多核苷酸激酶(Richardson, C. C. The Enzymes, edited by Boyer, P. D.， Academic Press, Inc， New York, N.Y. XIV: 299-314 (1981))和碱性磷酸酶 (Maunders, M. J. Methods in Molecular Biology. Edited by Burrell, M. M., Humana Press, Inc., Totowa,N丄,16:331-341 (1993))相关。有人认为可能存在特殊的3'多 聚核苷酸磷酸活性的酶，可能参与DNA损伤修复(Yang, S.W.,etal.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93(21):11534-9 (1996))。
在本方法发明之前，没有报道过存在没有其它酶活性的特异3'多聚核苷酸磷 酸酶，如5'多聚核苷酸磷酸酶活性，DNA聚合酶活性，连接酶活性等等。本方 法的发明者首次获得纯化的3'多聚核苷酸磷酸酶。可用以下的步骤进行纯化
1) . 3'多聚核苷酸磷酸酶活性检测可用不同的方法分析3'多聚核苷酸磷酸酶 (Jilani， A， et al. J. Bio. Chem. 274(34): 24176-86 (1999); Olivares M. et al J. Bio.
Chem. 274(34): 23883-86 (1999))。例1所描述的是首选的方法，它能检测到许多 杂质的活性，如外切酶，内切酶，5'磷酸酶，连接酶和DNA聚合酶。
2) . 3'磷酸酶的分离和纯化超声波处理Pfo细胞，硫酸铵沉淀，用几种商业 品化分离介质层析。
3) .在SDSPAGE上确定3'多聚核苷酸磷酸酶的蛋白带酶纯化过程中，层 析分离得到的各组分的蛋白质用SDS-PAGE分析，并检测相同组分里的酶活性， 如用图3所示的方法。仔细分析层析每个组分的蛋白质以及对应于酶活性的峰 值，再将SDS-PAGE中的蛋白用传统的复性方法(Yang， S. W.， Becker, F. R, Chan， J.Y.H.J.Bio.Chem. 265:18130-34 (1990))验证。在SDS-PAGE中，通过与蛋白 质标准分子量相比较来确定纯化酶的相对分子量。
有3'多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽及其DNA的编码序列
本发明提供有热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽，编码该多肽的核苷酸 分子，含有多聚核苷酸分子的DNA载体，含有上述分子的宿主细胞以及用上述 细胞产生重组3'多聚核苷酸磷酸酶的方法。
目前本发明中来自Pfu的3'多聚核苷酸磷酸酶基因含有846个碱基对(例如，SEQIDN0:5)，编码281个氨基酸(SEQIDNO:6)。用BLAST程序(Altschul S F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-4302 (1997))在Genbank中搜索，显示SEQ ID NO:6分别与来自户"ococcM /wnloA// OT3的假设的开放阅读框(Ph 1905)和 来自i^rococc^ 的ORF(Pab U03)各有91%禾n 88%的碱基相同。SEQ ID
NO:6和有3'多聚核苷酸磷酸酶活性的已知蛋白如T4多聚核苷酸激酶间不存在显 著的同源性(超过35%的碱基相同)。因此，很可能这两个开放阅读框(Phl905 与Pab 1103)与SEQ IDNO:6编码相似的具有3'多聚核苷酸磷酸酶功能的多肽。
本发明包括多肽和编码此多肽的DNA分子，以及在同一性或位置上有一或 多个氨基酸残基差别的SEQ IDNO:6的类似物、片段或者衍生物，涵盖了缺失 类似物即含有的特异氨基酸残基数目少于SEQIDNO:6;替代类似物即一个或多 个特异残基被其它残基取代；扩增类似物即在原来多肽的的末端或者中间部位， 加入另外的残基后仍保留一些或者所有天然酶的活性。
熟练技术人员会识别产物的类似物、片段和衍生物。本发明所包括多肽有-SEQ ID NO:6多肽，与SEQ ID NO:6至少有92%同源性的多肽(氨基酸序列至 少92%相同)，与SEQ ID NO:6至少有95%同源性的多肽(氨基酸序列至少95% 相同)，包括这类多肽的部分或片段，此多肽片段含有至少30个氨基酸或至少 50个氨基酸。众所周知两个多肽的"相似性"是通过比较两个多肽的氨基酸序 列以及它们的保守氨基酸序列来判断。可用计算机程序如BLAST来完成该种判 断。
目前本发明中的多聚核苷酸片段或部分含有至少15个核苷酸，或至少20个 核苷酸，最好是至少25个核苷酸。此多聚核苷酸片段或者部分可用于合成本发 明中的全长多聚核苷酸。
熟练的技术人员可从图8给出的序列片段来确定序列的相似性，同一性序列 和类似物设计。熟练的技术人员可通过识别图8中的判断哪些氨基酸残基是保守 的，哪些是可变的而不影响多肽的酶活性。此外，熟练的技术人员都知道某些氨 基酸替代物是被认为不影响多肽的活性的，可用GCG的BESTFIT程序来确定 保守氨基酸替代物(参见Determining the conserved amino acid substitutions using the BESTFIT program of the Genetic Computing Group, Madison, Wis.)。
本发明提供的核苷酸序列如SEQIDNO:5，与已公开的核苷酸序列有部分序
12列简并同源，本发明同样提供SEQ ID NO:5的DNA序列。简并的DNA序列也 编码SEQIDNO:6的氨基酸序列，但有部分核苷酸编码序列不同。体外表达3'多聚核苷酸磷酸酶的载体和细胞熟练的技术人员都知道3'磷酸酶的结构基因克隆可在重组宿主细胞中表达。 为了能在体外更好地表达3'磷酸酶，常见的诱导型或组成型的启动子可在重组宿 主细胞中表达高水平的3'多聚核苷酸磷酸酶结构基因。与之类似的，技术上常用 的高拷贝数的载体可用于达到高水平的表达量。可诱导出高拷贝数的载体有助于 在重组宿主细胞中提高3'磷酸酶的表达量。为了在原核细胞(such as， E. coli， B subtilis, Pseudomonas, etc.)中表达结构基 因，必须将结构基因连接上一个原核细胞的启动子。3'磷酸酶基因原有的启动子 可在原核宿主细胞中起作用，表达3'磷酸酶基因，因此可用于表达3'磷酸酶基因。为了提高本发明的3'磷酸酶在真核细胞中的表达，可使用常见的真核启动子 及真核宿主细胞。但是，最好在原核宿主细胞中表达3'磷酸酶。大量表达3'磷酸 酶的最合适的原核宿主细胞是E. coli。3'多聚核苷酸磷酸酶生产本发明中的酶是通过发酵含有可表达的3'磷酸酶的重组宿主细胞而来的。但 是，本发明所使用的酶可从任何可产生本发明3'磷酸酶的菌株中分离和纯化。同 时本发明包括含有酶活性的3'磷酸酶的片段。这类片段包括蛋白水解片段，融合 到其它多肽的片段以及各种片段。在培养基中加入各种可被含有3'磷酸酶基因的宿主细胞吸收的营养成分。根 据不同的菌株和培养基的组分选择最适的培养条件。加入抗生素以确保筛选出含 有目的基因的载体DNA。 ATCC目录等(Sambrook et al.， In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2.sup.nd ed,), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))描述了培养基的配制。首先，产生3'磷酸酶的宿主细胞可从液体培养基中分离，如用离心方法。将 收集到的微生物细胞悬浮到合适的缓冲液中，然后用超声波破细胞或者用其它常 用的方法在缓冲液中提取酶。用超声波离心或者离心去除细胞碎片后，用标准蛋 白纯化技术，如抽提、沉淀、层析、亲合层析及电泳等方法纯化3'磷酸酶。在纯化过程采用常见的分析方法检测3'磷酸酶，(例如，Jilani， A， et al. J Bio. Chem. 274(34): 24176-86 (1999); Olivares M. et al. J. Bio. Chem. 274(34): 23883-86 (1999); Yang, S. W., Burgin, A. B. Jr., Huizenga, B. N., Robertson, C. A., Yao ，K. C., and Nash, H. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(21):11534-9 (1996))，并可用经典生化 纯化方法检测这个酶。用热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶作为标记检测基因表达另一方面，本发明提供检测蛋白表达产物的方法a)构建包含编码目的蛋白 和编码热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶蛋白的DNA序列的融合DNA分子；b)把融 合DNA分子插入表达载体上；c)把表达载体转化进入合适的宿主细胞；d)在 能表达融合蛋白的条件下培养细胞；最后e)分析热稳定3'磷酸酶的活性。 用热稳定3'磷酸酶作为报告基因来研究基因表达的调节热稳定3'磷酸酶基因能用于研究基因表达调节。例如，细胞含有有源自基因 的调控元件的DNA分子，而无编码Pfu3'磷酸酶的基因，将此调控元件连接到一 段编码Pfii3'磷酸酶的DNA序列上。通过分析3'磷酸酶，可分析调控元件的功能。 细胞可从细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物或动物细胞中筛选。 最合适的动物细胞包括，但不限于，Vero细胞，HeLa细胞，Cos细胞，CV1细 胞和各种初期的哺乳动物细胞。具体来说，细菌细胞是E.coli。通过以下的例子阐述本发明。该发明不限于以下例子中特定条件或细节。本 说明书，任何或所有可获得的公开发表文献都可作为参考。例l: 3'多聚核苷酸磷酸酶活性检测化学合成3'磷酸基修饰的寡核苷酸(Midland Certified Reaget Company, Midland, Tex.)。寡核苷酸序列组成如下 5'國GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3' (SEQ ID No:7)用没有3'多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶把32P标记在寡核苷酸5' 末端(Yang， S.W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(21):11534-9(1996))。带有32P 标记寡核苷酸与纯化的3'多聚核苷酸磷酸酶混合在lxPCR反应缓冲液(10MmTris陽HCl， pH8.3' 50mM MgCl2) 72°C 5分钟。加入DNA测序缓冲液，90°C加 热2分钟，样品用12y。的聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。图4为用 Phophorlmager(MolecularDynamics)定量的样品放射自显影图。1单位的3'磷酸酶 定义为能5分钟内去除5pmo1多聚核苷酸的3'末端磷酸基。例2:从PfU中分离和提纯3'磷酸酶100克湿重的PfU细胞(从Md，巴尔的摩，马里兰州大学的海洋生物技术中 心购买)悬浮在冰浴的裂解液中，20mM Tris-HCl， Ph7.5， lmM EDTA， lmM DTT， 0.2M NaCl， 10mM巯基乙醇及2mM苯甲基硫磺氟化物。然后用超声波裂解细 胞，Sorvall GS-3 rotor 8，200rpm离心10分钟。上清加入0.05 vol的10%聚乙烯 亚胺溶液，混匀离心后用硫酸铵(饱和度45-80y。)分馏。接着用磷酸纤维素柱(P-ll; Whatman, Inc.; activity eluted .apprxeq.0.6 M NaCl)， Source 15S (Pharmacia; activity eluted.apprxeq.0.2 MNaCl)，双链DNA國纤维素(Sigma; activity eluted.apprxeq.0.15 M NaCl)， Mono S column (Pharmacia; activity eluted.apprxeq.0.35 M NaCl)及肝素 琼脂糖，MonoQ柱(Pharmacia; activity eluted.apprxeq.0.25 MNaCl)层析，最后在 Mono Q柱(Pharmacia)收集酶。3'磷酸酶在SDS-PAGE的位置用从SDS-PAGE中 割下蛋白带，然后复性的方法来确定(Yang, S. W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93(21):11534國9(1996))。在4-20%SDS-PAGE中与标准蛋白分子量标准(Life Technologies, In)比较， 纯化的3'磷酸酶相对的分子量大约31KD。例3: 3'磷酸酶N末端的縮氨酸测序部分己纯化的3'多聚核苷酸磷酸酶加入到7%SDS-Tricine PAGE中。SDS凝 胶中的蛋白质在转移缓冲液(0.5.times.TBE (pH 8.4)， 20% methanol, 0.5 mM EDTA) 中，电转移到PVDF膜上(Immobolin-PfromMillipore)， 0.5A电泳，转移1小时。 膜用考马斯亮蓝R-250染色10分钟，用100%甲醇脱色两次。切除膜上相应于3' 多聚核苷酸磷酸酶的条带。其氨基酸测序用耶鲁大学商业设备来完成。从N末 端开始以单个字母列出26个氨基酸的序列 FKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGI (SEQ ID NO: 1).15例4:从Pfo基因组中克隆编码3'磷酸酶的基因图2为3'磷酸酶基因克隆过程，简要阐述如下用BLAST程序(Altschul SF. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-4302 (1997))以N末端氨基酸序列(SEQ ID NO: 1) 査找Genebank。查找出两段氨基酸序列有96%相似的序列。其中一段识别序列 为部分的假设的i^racocw /zon'^w/z// OT3的开放阅读框(Ph 1950)，另一序列为 />>ocoa fl6>^i的部分的假设开放阅读框(Pab 1103)。两个开放阅读框都含有C 末端的23个氨基酸的相同氨基酸片段 ISESPNIEGDAILMKKKWEELKI (SEQ ID NO:2)SEQIDNO:l和已知有3'磷酸酶活性的蛋白之间没有显著的同源性(超过35%的 一致性)。为了克隆热稳定3'磷酸酶基因，本发明的发明者基于SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2，设计和化学合成了一对引物(SEQ IDNO:3和SEQ IDNO:4): 引物1:5'-GGAATTCGACATATGTTTAAAATAGACAGGCTAAGATTTGG(SEQ ID NO:3) 引物2: 5'國GGTACCTTAAATTTTTAGCTCTTCCCACTTTTT (SEQ ID NO:4)限制内切酶分别识别引物1和2的5'端的Ndel和Kpnl 。根据制造商 (Stratagene Inc., Calif.)的说明，这些引物在含有Pfli基因组DNA作为模板和PfU DNA聚合酶的PCR混合物中使用。合成的DNA片段用1%的琼脂糖凝胶电泳纯 化。用经典方法(Sambrook et al. in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2.sup.nd Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 钝化3'末端，去除5'末端的磷酸基团后，把片段连接到质粒载体pUC19上。含 有DNA片段的质粒(pUC19-PNP酶)从co// DH5a的单克隆菌株中提取，其片 段的序列(SEQ ID NO:5)可用经典方法(PE Applied Biosystems)来测定。从已知序 列推测氨基酸序列(SEQIDNO:6)。来自Pfii菌株的3'磷酸酶基因由846个碱基， 编码281个氨基酸组成。比较上述提到的另外两个推测的ORF,本发明的Pfli3' 磷酸酶氨基酸序列与Ph 1905和Pab 1103比较分别有91%和88%的相似性(见图 8)。因此这两个ORF很可能编码与SEQIDNO:6相似的，有热稳定3'磷酸酶功 能的多肽。例5:重组表达载体的构建为表达和纯化重组3'磷酸酶，用Ndel和Kpnl消化质粒DNA (pUC19-PNPtase)。含有3'磷酸酶基因的DNA片段用1%琼脂糖凝胶电泳纯化， 然后连接到co//表达载体pET-17b (Novagen，加州)上生成pET-17b-PNPtase。 连接反应混合物被转化到E coZ/DH5a细胞。通过PCR方法，用引物1和引物2 筛选出正确的克隆。用上述方法再次检测pET-17b-PNPtase中的3'磷酸酶基因的 序列。例6:表达和纯化源自Pfo的重组3'多聚核苷酸磷酸酶用例5中的重组表达载体(pET-17b-PNPtase)转化至!j Escherichia coli(BL21(DE3))。转化产物在LB培养基中培养。在收集细菌细胞前三个小时， 用异丙基硫代-B-D-吡喃乳糖苷(IPTG)]]进行诱导处理。离心从培养液中回收细 菌细胞。用缓冲液悬浮细胞并用超声波裂解细胞。细胞抽提液加热到76°C， 20 分钟。冰水中冷却10分钟，聚乙烯亚胺加入到抽提液中。回收上清，用以上所 述的硫酸铵(饱和度45-80%)方法沉淀，沉淀随后重悬于buffer R (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA， 1 mM DTT, 0.2 M NaCl， 10 mM巯基乙醇)中。短暂离心后用羟磷灰石(BioRad)柱层析，3'磷酸酶用梯度为1 mM到400 mM的磷酸基的缓冲液R洗提。含有3'磷酸酶的成分用上述的Mono S and Mono Qcolumn再处理。图3显示的纯化的3'磷酸酶，不含有影响PCR反应的外切 酶活性、DNA连接酶活性和多核苷酸激酶或者5'多聚核苷酸磷酸酶活性。例7:重组3'磷酸酶特异去除寡核苷酸3'末端的磷酸基团。用上述没有3'多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多聚核苷酸激酶在3'端有磷 酸基团的寡核苷酸(SEQ ID No.7)的5'端标记sup.32P (Yang, S. W" et al. Proc. Natl.Acad.Sci. U.S. A.93(21):11534-9 (1996))。在最适温度，把sup.32 P标记的 底物和纯化的重组3'磷酸酶混合在1X PCR缓冲液(10 mM Tri s-HCl, pH 8.3， 50 mM KC1， 2.5 mM MgCl.sub.2) 5分钟。加入DNA测序缓冲液后加热至9(TC， 2 分钟。样品用12M聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。例8:在Taq和Pfti DNA聚合酶作用下，依赖于热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶 的经修饰的寡核苷酸引物延伸反应。用sup.32 P标记的3'末端有磷酸阻断基团的寡核苷酸引物(SEQ ID No:7) 与互补模板5'-AACCTCGTAACCTTCGGTACACTCGGATGCACAGAGCAGC-3' (SEQ ID NO:8)配对，加入或者不加入纯化的重组3'多聚核苷酸磷酸酶到Taq / Pfia聚合酶中，68。C混合分别30秒和10分钟。样品加入DNA测序缓冲液，90°C 加热2分钟，然后用12e/。的聚丙烯酰胺凝胶-7M尿素电泳分析。当纯化的重组酶与经修饰的寡核苷酸引物混合在PCR反应物时，该种酶能 特异地去除引物的3'末端的磷酸基而不影响5'端(见图4)。相比之下，从Tth 而来的热稳定碱性磷酸酶，因为同时具有3'和5'磷酸酶的活性，所以不能用 于本发明以提高DNA扩增的特异性和灵敏度。5'磷酸酶的活性会破坏脱氧核 苷三磷酸((dNTP包括dATP, dTTP, dCTP及dGTP)， dNTP是PCR反应中热稳 定DNA聚合酶合成DNA的底物。如图4所示，纯化酶在55"C到8(TC温度范围内有最大的活性，这同样也是 所有用PCR方法或相关技术扩增DNA的热稳定DNA聚合酶的最适温度范围。在本实验反应混合物内没有3'多聚核苷酸磷酸酶时，3'末端经磷酸基团 修饰的引物能在68i:稳定10分钟(图5，泳道4和5)。这两个泳道没有任何延伸 产物，说明3'磷酸基团修饰的引物在68'C稳定，能遏制PfuDNA聚合酶3'外 切酶活性，Taq和PfiiDNA聚合酶作用下的引物的延伸。但是，在同样的反应混 合物中，含有纯化的重组3'多聚核苷酸磷酸酶及大约20pmol(常规PCR用量) 的修饰引物，68"C下不到30秒就开始延伸(图5，泳道2和3)。该结果说明3' 多聚核苷酸磷酸酶能非常有效地去除引物3'端的磷酸基，因此所有的经修饰引 物可以转化为传统引物开始循环而不必额外的的暂停。进一步的研究说明，3' 末端磷酸基修饰的引物可在室温下，没有3'磷酸酶的完全PCR混合物中保存 几个星期，68'C保存5天(数据没有列出)。例9:用带修饰引物和3'磷酸酶提高PCR扩增DNA片段的特异性。为了扩增人类p球蛋白基因的DNA片段，从人类p球蛋白基因中筛选一对 弓l物(Collins, F. S. and Weissman， S. M. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 31:315-462(1984)),并化学合成含有或不含有3'末端磷酸基团的引物，预期扩增 长约2.8kb的PCR产物。Primer 3: 5'-GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3' (SEQ ID NO:7)及 Primer 4: 5'-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-p-3' (SE(^ ID NO:9)
PCR混合物(IO mM Tris-HCl， pH 8.3， 50 mM KC1, 2.5 mM MgCl.sub.2, 200 .mu.M dNTP)加入纯化的重组3'多聚核苷酸磷酸酶及Taq DNA聚合酶或者 PfoDNA聚合酶，同时用一系列稀释梯度的人类基因组DNA作为模板。PCR反 应参数94。C，2分钟；55r，15秒，72°C,3分钟共30循环；94°C， 15秒。琼脂 糖凝胶电泳分析PCR产物。对照实验除了没有添加3'磷酸酶及使用与修饰引物 序列相同的传统引物之外，其它PCR条件相同。 Primer 5: 5'隱GCTGCTCTGTGCATCCGAGTGG-3' (SEQ ID NO:10)及 Primer 6: 5'-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3' (SEQ ID NO: 11). 结果见图6
例10:用修饰引物和3'多聚核苷酸磷酸酶进行PCR，提高扩增DNA片段特异性。 一对传统寡核苷酸引物分别互补到gag基因序列1551-1578和1638-1665上， 分别命名SK38和SK39，用于扩增115bp的DNA片段来直接检测外周血单核 细胞的HIV-1 (Ou， C. Y. et al， Science 239(4837):295-7 (1988))。 HIV-1的gag基因 插入质粒载体pUC19上构建作为模板的pUC19-gag。在SK38和SK39引物3' 末端化学合成磷酸基因
Primer 7: 5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-p-3' (SEQ ID NO:12)和 Primer 8: 5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-p-3' (SEQ ID NO: 13)
PCR反应中，在TaqDNA聚合酶作用下，纯化的重组3'磷酸酶及引物7和 8用于扩增115bp的DNA片段。例9描述了 PCR反应混合物含有一系列稀释梯 度的gag基因模板(pUC19-gag)和200ng的人类基因组DNA作为非特异模板。PCR 反应参数如下94"C，2分钟；55。C,15秒，72°C,3分钟，44循环；94°C， 15秒。 反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。对照实验是在相同的PCR反应中不加3'磷酸 酶并加入传统的SK38和SK39引物
Primer 9: 5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3' (SEQ ID No. 14)禾口 Primer 10: 5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3' (SEq ID No. 15). 结果见图7。序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>锦可贝基因技术公司
<120>改良多聚核苷酸合成的方法和成分 〈150〉 US 09/404,258 <151> 1999-09-22
〈160〉 17
〈170> Patentln version 3. 5
<210> 1 <211> 26 <212> PRT
<213> 激烈火球菌(Pyrococcus furiosus) 〈■ 1
Phe Lys lie Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly lie Pro Leu Ser 15 10 15
Thr Pro Lys Pro Ser Thr lie Ala Gly lie 20 25
<210> 2 〈211〉 23 <212> PRT
〈213> 激烈火球齒(Pyrococcus furiosus) <400> 2
lie Ser Glu Ser Pro Asn lie Glu Gly Asp Ala lie Leu Met Lys Lys 15 10 15
Lys Trp Glu Glu Leu Lys lie 20
<210〉3
〈211〉41
〈212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>3
gg组tcgac atatgtttaa组,cagg cta卿tttg g
20<210>4
<211>33
<212>■
〈213>人工序列
<220>
〈223〉人工序列
〈400>4
ggtaccttaa atttttagct cttcccactt ttt 33
〈210> 5
<211〉 846
<212〉 DNA
<213> 激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
〈400〉 5
atgtttaaaatagacaggctaagatttgga3CtgCtgg犯tacctctttc tactccaaaa60
ccttctacaatagctgg犯ttg犯agggtt柳g鄉ttggactagatgc catggagctt120
gsatttgtgag郷agt肌atataaggcccg肌ctggcaaagaa犯ta犯3tacgtagca180
a肌犯g犯cgacgttgtttt犯C3gCgC3tgccccatactacat幼actt a犯cgcc犯a240
tagcaaaaggagaattattcagagtgc3gs犯ggctatat300
g￡lggC3gg￡lggatggagcgtagtttttcatgctggctattacttgaaaga acatccagaa360
犯ggtttatcagaaasttgaaagcacactaaaggatatag420
gg组卿agtctggctgsgacctgsgttgacggga犯gccgacccaatt tggagatctg480
aaagaattaattaaattaaggagcttgttcttcccgcaat agactttgcc540
catgcccatgggg咖gtgtaactctg犯g3卿gtgg3g卿g3tgCt3600
gctttaattgaa肪cg3gcttgggag卿gacatgcatat tcacat犯gt660
gg犯ttgaatggg卿幼3g3ggcatctcaatct3g3ggs gsgcg3tctt720
3组ggg鄉atctactcaaagttctcaaag肌ttta犯gtt犯gggcgt tgt幼t犯gt780
gagagccccaatatagaaggggatgctctgaaaagtggga 3gagctaa犯840
atttaa846
〈210> 6
<211> 281
〈212〉 PRT
<213> 激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400> 6
Met Phe Lys lie Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly lie Pro Leu
15 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr lie Ala Gly lie Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Val Asn lie 35 40 45Arg Pro Glu Leu 50
Val Val Leu Thr 65
Glu Lys Glu Lys
Glu Arg Leu Tyr 100
Tyr Tyr Leu Lys 115
Thr Leu Lys Asp 130
Trp Leu Arg Pro 145
Lys Glu Leu lie
lie Asp Phe Ala 180
Glu Glu Glu Trp 195
Arg Glu Ala Leu 210
Thr Glu Lys Gly 225
Lys Trp Glu Asp
Val Val lie Ser 260
Lys Lys Lys Trp 275
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
〈223〉人工序列
<400〉7
Ala Lys Lys lie Lys Tyr Val Ala Lys Lys Asn Asp
55 60 Ala His Ala Pro Tyr Tyr lie Asn Leu Asn Ala Lys 70 75 80
Val Glu Ser Ser Lys Arg Arg lie lie Gin Ser Ala 85 90 95
Glu Ala Gly Gly Trp Ser Val Val Phe His Ala Gly
105 110 Glu His Pro Glu Lys Val Tyr Gin Lys lie Glu Ser
120 125 lie Glu Arg Glu Leu Lys Asp Arg Gly lie Glu Val
135 140 Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gin Phe Gly Asp Leu 150 155 160
Lys Leu Ser Gin Asn Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala 165 170 175
His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Ser
185 190 Arg Glu Met Leu Ala Leu lie Glu Asn Glu Leu Gly
200 205 Asp Asn Met His lie His lie Ser Gly lie Glu Tyr
215 220 Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Glu Glu Ser Asp Leu 230 235 240
Leu Leu Lys Val Leu Lys Glu Phe Lys Val Lys Gly 245 250 255
Glu Ser Pro Asn lie Glu Gly Asp Ala Leu Leu Met
265 270 Glu Glu Leu Lys lie 280
3'磷酸盐修饰的寡核苷酸
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
<210> 8 <211〉 40 <212>廳〈213>人工序列<220>
〈223〉人工序列寡核苷酸序列
<400> 8
aacctcgtaa ccttcggtac actcggatgc acagagcagc 40
<210> 9
<211> 22
<212> 腿<213>人工序列<220>
〈223>人工序列引物
<400> 9
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
<210> 10
〈211〉 22
〈212> 腿〈213〉人工序列<220〉
<223〉人工序列引物
<400> 10
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
〈210> 11
〈211〉 22
〈212〉 DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列引物
〈400〉 11
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
〈210〉 12
<211> 28
<212> DNA<213>人工序列〈220〉
<223>人工序列引物<400> 12
ataatccacc tatcccagta ggagaaat 28
〈210〉13
〈211〉28
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
<223>人工序列引物
<400>13
tttggtcctt gtcttatgtc〈210>14
<211>28
<212〉薩
<213>人工序列
〈220〉
〈223〉人工序列引物
<400〉14
ataatccacc tatcccagta〈210〉15
<211>28
〈212>隠
<213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列引物
28
28
<400> 15
tttggtcctt gtcttatgtc cagaatgc 28
<210> 16<211> 281<212> PRT
〈213〉 激烈火球菌(Pyrococcus horikoshii)<400> 16
Met Phe Lys lie Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly lie Pro lie
15 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr lie Ala Gly lie Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly lie Asn lieLys
lie
65
Glu
Glu
Tyr
Ala
Trp145Lys
lie
Glu
Arg
Gly225Lys
Val
Lys
Pro
50
Val
Lys
Arg
Tyr
Leu130Leu
Glu
Asp
Glu
Glu210Glu
Trp
lie
Lys
35Glu
Leu
Glu
Leu
Leu115Lys
Arg
Leu
Phe
Glu195Ala
Lys
Glu
lie
Lys275
Leu
Thr
Lys
Tyr100Lys
Glu
Pro
Val
Ala180Trp
Leu
Gly
Asp
Ser260Trp
Ala
Ala
Val
85
Glu
Gin
lie
Glu
Lys165His
Arg
Asp
Glu
Leu245Glu
Glu
Lys
His
70
Glu
Ala
Pro
Gin
Leu150Leu
Ala
Glu
Asn
Lys230Leu
Ser
Glu
Lys
55
Ala
Ala
Gly
Lys
Lys135Thr
Ser
His
Met
Met215Arg
Lys
Pro
Leu
40lie
Pro
Ser
Gly
Glu120Glu
Gly
Gin
Ala
Leu200His
His
Val
Asn
Lys280
Lys
Tyr
Lys
Trp105
Ser
Leu
Lys
Glu
Arg185Ala
lie
Leu
Leu
lie265lie
45
Tyr Val Ala Glu60
Tyr lie Asn Leu75
Arg Arg lie lie90
Ser Val Val Phe
Val Tyr Gin Lys125
Met Asp Lys Gly140
Pro Thr Gin Phe155
Leu Glu Leu Val170
Asn Lys Gly Lys
Leu lie Glu Asn205
His lie Ser Gly220
Asn Leu Glu Glu235
Lys Glu Phe Arg250
Glu Gly Asp Ala
Lys Asn AspAsnGin
His110lie
lie
Gly
Leu
Cys190Glu
lie
Ser
Val
lie270
Ala Lys80Ser Ala95
Ala Gly
Leu Ser
Lys Val
Asp Leu160Pro Ala175
Asn Thr
Leu Gly
Glu Tyr
Asp Leu240Lys Gly255
Leu Met
<210> 17<211> 281<212> PRT
〈213〉 激烈火球菌(Pyrococcus abyssi)〈400〉 17
Met Phe Lys lie Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly lie Pro lie
15 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr lie Ala Gly lie Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly lie Asn lie35 40 45
25Lys
Val
65
Glu
Glu
Tyr
Glu
Trp145Met
lie
Glu
Arg
Ser225Arg
Val
Lys
Pro
50
Val
Lys
Arg
Tyr
Leu130lie
Glu
Asp
Glu
Glu210Asp
Trp
Val
Lys
Glu
Leu
Glu
Leu
Leu115Lys
Arg
Leu
Phe
Glu195Ala
Lys
Glu
lie
Lys275
Leu
Thr
Lys
Tyr100Lys
Asp
Pro
lie
Ala180Trp
Leu
Gly
Glu
Ser260Trp
Ala
Ala
Val
85
Glu
Gin
lie
Glu
Arg165His
Arg
Asp
Glu
Leu245Glu
Glu
Lys
His
70
Glu
Ala
Pro
Glu
Leu150teu
Ala
Glu
Asn
Lys230Leu
Ser
Glu
Lys
55
Ala
Ala
Gly
Pro
Lys135Thr
Ser
His
Met
Met215Arg
Lys
Pro
Leu
lie
Pro
Ser
Gly
Glu120Glu
Gly
Gin
Ala
Leu200His
His
Thr
Asn
Lys280
Lys
Tyr
Lys
Trp105Leu
Leu
Lys
Asp
Arg185Thr
lie
Leu
Leu
lie265lie
His
Tyr
Arg
90
Ser
Val
Leu
Pro
Leu170Asn
Leu
His
Asn
Lys250Glu
Val
lie
75
Arg
Leu
Tyr
Asp
Thr155Glu
Lys
lie
lie
Leu235Glu
Gly
Ala
60
Asn
lie
Val
Glu
Arg140Gin
Leu
Gly
Glu
Ser220Gin
Phe
Asp
Lys
Leu
lie
Phe
Arg125Gly
Phe
Val
Lys
Lys205Gly
Glu
Lys
Ala
Lys
Asn
Gin
His110lie
lie
Gly
Leu
Cys190Glu
lie
Ser
Val
lie270
Asn
Ala
Ser
95
Ala
Lys
Lys
Asn
Pro175Asn
Leu
Glu
Asp
Lys255Leu
Asp
Lys
80
Ala
Gly
Ser
Val
Leu160Ala
Ser
Gly
Tyr
Met240Gly
Met
权利要求
1.一条分离的多肽，具有热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶活性，所述的多肽由SEQ IDNO6氨基酸序列组成。
2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于为一个独立的DNA分子编码。
3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于所述的一个独立的DNA分子由 SEQ ID NO:5的核苷酸序列组成。
4. 一个载体，含有权利要求2中的独立DNA分子及连接一个可调控的启动子， 其中DNA分子编码有热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽。
5. 根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述的多肽由SEQIDNO:6氨基酸序列组成。
6. 根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述的DNA分子含有从SEQ ID NO:5， Ph 1905开放阅读框及Pab 1103开放阅读框的组中筛选出来的核苷酸序 列。
7. —个含有权利要求4中表达载体的宿主细胞。
8. —种生产如权利要求1所述的热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶的方法包括(a) 提供一个含有能够表达如权利要求1所述的既定磷酸酶的表达载体的重组宿 主；(b) 在能够表达如权利要求1所述的既定磷酸酶的条件下培养既定宿主。
9. 一种检测蛋白表达的方法，包括-(1) 提供一个表达载体，该载体中含有编码感兴趣蛋白的基因，该基因与权 利要求2中的独立DNA分子融合(2) 表达表达载体；以及(3) 检验3'磷酸酶活性，存在3'磷酸酶活性表示能成功表达感兴趣蛋白。
10. 检测调控元件功能的方法，包括(1) 提供一个含有编码热稳定3'多聚核苷酸磷酸酶基因的表达载体，该基因与一 未知或已知具有调节功能的DNA序列相连接；以及(2) 检测3'磷酸酶活性，3'磷酸酶活性的表达模式显示了调控元件调节基因表达 的模式。
全文摘要
在合成多核苷酸中，通过保护寡核苷酸3′末端，然后用其作为引物可提高合成多聚核苷酸的灵敏度和特异性。保护多聚核苷酸的3′末端可以阻止非特异性的链延长。然后温度提高时在热稳定酶作用下去除阻断基团，从而进行模板特异性的多聚核苷酸合成。该发明同时也提供了3′末端带有阻断基团的寡核苷酸以及在高温下可去除阻断基团的热稳定酶。该发明中的组分及方法在多种DNA/RNA扩增和分析技术中非常有用，包括医学遗传研究、诊断，病原体检测，法医，及动植物遗传应用等。
文档编号C12P19/34GK101649307SQ200910151168
公开日2010年2月17日 申请日期2000年9月22日 优先权日1999年9月22日
发明者杨淑伟 申请人:锦可贝基因技术公司