专利名称：抗cd 20抗体及其融合蛋白和使用方法
抗CD 20抗体及其融合蛋白和使用方法本申请是以下申请的分案申请申请日2003年2月14日；申请号 03808357. 4(PCT/GB03/00665)；发明名称同上。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及人源化、嵌合型和人抗CD20抗体，特别是人源化、嵌合型和人抗CD20 抗体的单克隆抗体(MAb)治疗和诊断缀合物，和涉及用人源化、嵌合型和人抗CD20抗体来 治疗B-细胞淋巴瘤和白血病以及多种自身免疫病的方法。本发明涉及抗体融合蛋白或者 其片段，它们含有至少两个抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少一种抗CD20 MAb或其片段 和至少一种除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二种MAb或其片段。人源化、嵌合型和人 抗CD20 MAb、其片段、其抗体融合蛋白或其片段可以单独进行施用，作为治疗缀合物(cong jugate)或者与治疗免疫缀合物、与其他裸露的抗体或与治疗试剂联合进行施用，或者作为 诊断缀合物进行施用。本发明涉及编码人源化、嵌合型和人抗CD20抗体和抗体融合蛋白的 DNA序列、含有该DNA序列的载体和宿主细胞以及制造人源化、嵌合型和人抗CD20抗体的方 法。2.背景脊椎动物的免疫系统由许多器官和细胞类型组成，它们已经进化成可准确地识别 外来抗原，并特异性地与这些外来抗原结合和去除/破坏这些外来抗原。其中，淋巴细胞对 于免疫系统是关键性的。淋巴细胞划分为两个主要亚群，即T-细胞和B-细胞。虽然是相 互依赖的，但是T-细胞主要在细胞介导的免疫中起作用，而B-细胞主要在抗体产生(体液 免疫)中起作用。在人中，每个B-细胞能够产生大量的抗体分子。这种抗体的产生一般在外来抗原 已被中和的时候停止(或者基本上减退了)。可是，有时特殊B-细胞的增殖会持续地不减 弱，从而可以导致称为B-细胞淋巴瘤的癌症。B-细胞淋巴瘤例如非Hodgkin’ s淋巴瘤的 B-细胞亚型对于癌症死亡率起着重要的作用。混合了 B-细胞恶性肿瘤对于多种形式的治 疗的反应。例如，在可能对非Hodgkin's淋巴瘤进行恰当的临床分期的情况下，场放射疗法 能够提供令人满意的治疗。但是仍有大约一半的患者死于该疾病。Devesa等人，J.Nat’ 1 Cancer Inst. 79 701(1987)。慢性淋巴细胞白血病的大部分是B-细胞系的。Freedman，Hemato 1. Oncol. Clin. North Am. 4 :405(1990)。这一类型的B-细胞恶性肿瘤在西方世界中是最普遍的白血病。 Goodman等人，Leukemia andLymphoma 22:1(1996)。慢性淋巴细胞白血病的天然病史分成 几个阶段。在早期阶段中，慢性淋巴细胞白血病是无痛感的疾病，其特征在于积聚了小的、 成熟的、功能不全的恶性B-细胞，它们具有延长的寿命。最后，恶性B-细胞的倍增时间减 少，和患者的症状增加。虽然治疗能够提供症状的缓解，但是患者的总存活率只是最低程度 地受到了影响。慢性淋巴细胞白血病的后期阶段的特征为贫血和/或血小板减少。在这一 点上，中值存活时间小于两年。Foon等人，Annals Int. Medicine 113:525(1990)。由于非 常低的细胞增殖率，慢性淋巴细胞白血病对于细胞毒性药物治疗具有抗性。
包括化学疗法和放射疗法在内的治疗B-细胞恶性肿瘤的传统方法由于毒副作用 而具有有限的应用。使用单克隆抗体来引导放射性核素、毒素或其他治疗试剂提供了这样 的可能性，即这些试剂可以选择性地递送到肿瘤部位，因此限制了对于正常组织的毒性。此 外，在这些B-细胞恶性肿瘤上B-细胞抗原的存在使得它们成为使用未缀合的B-细胞抗体 (例如抗B-细胞上的CD19、CD20、CD21、CD23和CD22标记)的疗法的最佳目标。HLA-DR和 其他抗原可以用作正常和恶性B-细胞的目标，虽然它们也在其他细胞类型上表达。此外， 某些MUC1、MUC2、MUC3和MUC4抗原(优选为MUC1)也在不同的造血恶性肿瘤中表达，包括 表达⑶20和其他B-细胞标记的B-细胞肿瘤。另外的其他抗原目标，如那些与肿瘤的血管 内皮相联系的抗原，包括腱生蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(P1GF)，以 及其他类别的与B-细胞恶性肿瘤相联系的抗原如癌基因产物，它们也是在本发明中使用 的该互补性抗体的合适的目标。B-细胞具有可用作用于区分和鉴定的标记的细胞表面蛋白。一种这样的人B-细 胞标记为人局限于B-淋巴细胞的分化抗原Bp35，称为⑶20。⑶20在前B-细胞的发育早 期期间进行表达，并保持到浆细胞的分化。CD20在正常的B-细胞和恶性B-细胞上表达， 恶性B-细胞的不正常生长能够导致B-细胞淋巴瘤。已经研究了抗CD20抗原的抗体用于 B-细胞淋巴瘤的治疗。例如，标示为“IDEC-C2B8”的嵌合型抗CD20抗体当以下列条件进行 施用时具有抗B-细胞淋巴瘤的活性，即以未缀合的抗体形式进行提供，并以每次注射超过 500mg 的剂量进行重复的注射。Maloney 等人，Blood 84:2457(1994) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 =353(1996)。大约50%的具有低级无痛感形式的非Hodgkin，s患者在用这一治疗 方法进行治疗时显示出反应。当以每次注射超过600mg的剂量进行重复给药时，治疗反应 也可以通过使用131I标记的抗⑶20鼠类单克隆抗体Bl来获得。Kaminski等人，N. Engl. J. Med. 329 459(1993) ；Press 等人，N. Engl. J. Med. 329 1219 (1993) ；Press 等人，Lancet 346 :336(1995)。可是，这些以未缀合的形式或者以放射性标记的形式提供的抗体在具有更 普遍和致死形式的B-细胞淋巴瘤(中间或侵染性形式)的患者中没有显示出高比率的客 观和持久的反应。因此，存在需要来形成对于B-细胞恶性肿瘤的免疫疗法，其可获得具有 明显持续时间的治疗反应。已经用抗⑶20鼠类单克隆抗体IF5验证了另外的将⑶20表面抗原作为目标的研 究，IF5通过持续的静脉内输注而施用于B-细胞淋巴瘤患者。据报道，需要非常高水平(> 2克)的IF5来减少循环的肿瘤细胞，该结果被Press等人(人B-细胞淋巴瘤的单克隆抗 # IF5 ( CD20) 青去(Monoclonal Antibody IF5 (Anti-CD20)Serotherapy ofHuman B-Cell Lymphomas)，Blood 69/2 =584-591 (1987))描述为“短暂的”。可是，该方法的潜在 问题是非人单克隆抗体(例如鼠类单克隆抗体)通常缺乏人效应物功能性，即它们不能够 介导依赖补体的裂解，或者通过依赖抗体的细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用来裂解人 靶细胞。此外，非人单克隆抗体能够被人宿主识别为外源蛋白质，因此重复注射这种外源抗 体可以引起导致有害过敏反应的免疫反应。对于基于鼠类的单克隆抗体，这常常称为人抗 鼠抗体(HAMA)反应。使用嵌合型抗体是更加优选的，因为它们不会引起与鼠类抗体一样强的HAMA反 应。嵌合型抗体是含有来自两个或更多个不同物种的部分的抗体。例如Liu，A.Y.等 人(具有有效的Fc依赖性生物活性的抗CD20小鼠-人嵌合型单克隆抗体的生产(Production of a Mouse-HumanChimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-DependentBiologic Activity)，J. Immun. 139/10 :3521_3526 (1987))描述了 导向抗 CD20抗原的小鼠/人嵌合型抗体。也可见PCT发表号W088/04936。可是，在该文献中没有提 供关于使用这种嵌合型抗体对于治疗B-细胞紊乱的能力、效用或实用性的信息。要注意的 是，体外功能测定(例如依赖补体的裂解(CDC)；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)等等)不能自 然地预测嵌合型抗体破坏或减少表达特异性抗原的靶细胞的体内能力。见例如，Robinson， R.D.等人，介导不同的抗肿瘤细胞生物活性的嵌合型小鼠-人抗癌抗体(Chimeric mouse-humananti—carcinoma antibodies that mediate different anti—tumorcell biological activities), Hum. Antibod. Hybridomas 2 :84_93 (1991)(具有无法觉察的 ADCC活性的嵌合型小鼠_人抗体)。因此，嵌合型抗体的潜在治疗效能只能真正地通过体 内实验来评测，优选地在用于特异性疗法的目标物种中进行实验。有一种方法已经改善了鼠类单克隆抗体的能力以使其在治疗B-细胞紊乱中是 有效的，这一方法将放射性标记或化疗试剂与抗体缀合，从而标记或试剂可定位于肿瘤 部位。例如，上面所提及的IF5抗体和其他B-细胞抗体用131I进行标记，并据报道对于 在两个患者中的生物分布进行评价。见Eary，J. F.等人，B-细胞淋巴瘤的成像和治疗 (Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma), J. Nuc. Med. 31/8 1257-1268(1990)； 也可见Press，0. W.等人，用放射性标记的MB-I (抗⑶37)抗体治疗顽固性非Hodgkin，s 淋巴瘤(Treatment ofRefractory Non-Hodgkin' s Lymphoma with Radiolabeled MB-I (Anti-CD37) Antibody), J. Clin. One. 7/8 :1027-1038 (1989)(表明一个用 131I 标记 的IF-5进行治疗的患者获得了部分的反应)；Goldenberg，D. Μ.等人，用131I标记的LL2 单克隆抗体对于B-淋巴瘤进行定向、剂量测定和放射免疫治疗(Targeting，Dosimetry andRadioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 131 I-Labeled LL2Monoclonal Antibody)，J. Clin. Oncol. 9/4 =548-564(1991)(报道了八个接受多次注射的患者中有三 个形成了对于该⑶22鼠类抗体的HAMA反应)；Appelbaum，F. R.，在治疗非Hodgkin’ s淋
Φ(Radiolabeled Monoclonal Antibodies in theTreatment
of Non-Hodgkin，s Lymphoma), Hem. /Oncol. Clinics of N. A. 5/5 :1013-1025(1991)(综 述文章)；Press，0. W.等人，用自体骨髓支持物所进行的B-细胞淋巴瘤的放射性标记抗 体疗法(Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma withAutologous Bone Marrow Support), New England Journal of Medicine329/17 1219-12223 (1993) (131I fe 记的抗CD20抗体IF5和Bi)；和Kaminski，Μ. G.等人，用[131 I]抗Bl (抗CD20)抗体所进 ^fW B- ^IfiSE^W^M^^^T^ (Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomaswith [131 I] Anti-Bl (Anti-CD20) Antibody)，NEJM 329/7 459(1993) (131 I 标记的抗 CD20 抗体 Bl ；在 下文中称为“Kaminski”)；PCT发表的申请WO 92/07466 (与化疗试剂如阿霉素或丝裂霉素 缀合的抗体)。可是，这些方法没有消除与使用鼠类抗体相联系的障碍，尽管有这样的事实， 即在侵染之前接受细胞毒性化疗的许多具有淋巴瘤的患者是免疫抑制的，因此比没有进行 深切预治疗的淋巴瘤患者具有更低的HAMA比率。自身免疫病是一类与B-细胞紊乱相联系的疾病。例子包括免疫介导的血小板减 少症如急性原发性血小板减少性紫癜和慢性原发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、狼疮 肾炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎。最普通的治疗为皮质类固醇和细胞毒性药物，其可以是非常毒的。这些药物也抑制整个免疫系统，从而可导致严重的感染，和对于骨髓、肝和肾产 生不利的影响。到目前为止已用于治疗III型自身免疫病的其他治疗剂已经导向抗T-细胞 和巨噬细胞。有需要来获得更有效的治疗自身免疫病的方法，特别是III型自身免疫病。为了找出许多与B-细胞紊乱和其治疗相关的组织，本发明提供了人源化、嵌合型 和人抗CD20单克隆抗体，这些单克隆抗体具有同样的与本发明的CD20抗原结合的互补决 定区(CDR)，它们可单独使用、与治疗试剂缀合使用或者与其他治疗形式联合使用，以用于 在人和其他哺乳动物中治疗B-细胞淋巴瘤与白血病和自身免疫紊乱，而没有与使用鼠类 抗体相联系的不利反应。发明概述因此，本发明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗体，它们与被称为CD20的人 B-细胞标记结合，该B-细胞标记可用于B-细胞紊乱如B-细胞恶性肿瘤和自身免疫病的治 疗和诊断。本发明进一步提供了用一种或多种人源化、嵌合型和人CD20抗体来治疗哺乳动 物受试者如人或家养动物的方法，这些抗体单独使用，或者作为抗体融合蛋白、作为治疗缀 合物单独或作为抗体融合蛋白的一部分进行使用，或者联合其他抗体、其他治疗试剂或免 疫调节剂而以多形式疗法进行使用，或者作为与至少一种治疗试剂、治疗放射性核素或免 疫调节剂相连的免疫缀合物进行使用。这些人源化、嵌合型和人CD20抗体也可以单独、与 其他诊断成像剂联合和/或与治疗应用一起而用作诊断成像剂。本发明另外涉及抗CD20 MAb或其片段，它们含有特异性鼠类CDR或来自多于一种 鼠的鼠类⑶R组合，或者含有对于⑶20具有特异性的嵌合型抗⑶20 MAb。这些MAb可以为 人源化、嵌合型和人抗⑶20 MAb。本发明也涉及抗体融合蛋白，其含有至少两个抗CD20 MAb或其片段，或者含有具 有抗CD20 MAb或其片段的第一种MAb和第二种MAb。本发明进一步涉及抗⑶20 MAb或其片段、或者抗⑶20 MAb或其他MAb或其片段的 抗体融合蛋白与至少一种治疗试剂或至少一种诊断试剂结合所形成的治疗或诊断缀合物。 具有多个相同或不同类型的治疗试剂的抗体融合蛋白包括在本发明之内。本发明另外涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗体融合蛋白或其片段进行治 疗的方法，它们单独进行施用，互相联合进行施用，作为具有一个或多个治疗试剂的治疗免 疫缀合物的抗体成分进行施用，或者与一个或多个治疗试剂或各自与具有一个或多个治疗 试剂的治疗免疫缀合物联合施用。本发明进一步涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗体融合蛋白或其片段作为 与一种或多种诊断试剂结合的诊断剂的方法。本发明另外涉及在患有B-细胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中用本发 明的抗体融合蛋白或其片段预定向细胞的方法。附图简述
图1公开了通过RT-PCR从产生鼠类抗⑶20的杂交瘤细胞系中克隆得到的V基因 序列，和由此推断出的A20抗体可变轻链(图1A)和重链(图1B)的氨基酸序列，分别标 示为A20Vk和A20VH。下划箭头线指明了用于克隆的PCR引物的序列。由Kabat编号方案 所定义的推定CDR区域序列以粗体和下划线表示。氨基酸序列以位于相应核苷酸序列之下的单字母码来给出。Kabat编号方案用于氨基酸残基。根据Kabat，用一个字母编号的氨基 酸残基代表了插入残基，其具有与以前残基的编号一样的编号。例如，图IB中的残基82、 82A、82B和82C分别表示为82A、B和C。图2公开了 cA20这一嵌合型抗⑶20抗体的Vk (可变轻链)和VH (可变重链)的 序列。CDR区域的序列用粗体和下划线表示。氨基酸残基和核苷酸顺次进行编号，同样的编 号系统用于人源化的V序列。轻链可变区显示在图2A中，重链可变区显示在图2B中。编 号系统与用于图1的是一样的。用于构建cA20的限制位点用下划线表示。图3显示了嵌合型A20(cA20)和鼠类A20 (A20)在对于125I标记的A20的细胞表 面竞争性结合测定中结合亲和力的比较。cA20的浓度增加以与鼠类A20(用实心的菱形来 描绘)相当的方式阻断了放射性标记的A20(用实心的圆来描绘)与Raji细胞的结合。图4比较了人抗体与嵌合型和人源化抗⑶20抗体的可变重链(VH)和可变轻链 (Vk)的氨基酸序列。图4A比较了人抗体EU和NEWM (只是FR4)、嵌合型抗体(cA20VH)与 两个人源化抗体(hA20VHl和hA20VH2)的可变重链(VH)的氨基酸序列；图4B比较了人抗 体(REIVk)、嵌合型抗体(cA20Vk)与人源化抗体(hA20Vk)的可变轻链(Vk)的氨基酸序列。 点表示A20中的残基与人抗体中的相应残基是一样的。CDR标示为加框的区域。Kabat编 号方案用于将氨基酸残基进行编号。图5分别公开了 hA20轻链V基因(hA20Vk)的核苷酸序列(图5A)，和重链V基因 hA20VHl (图5B)与hA20VH2 (图5C)的核苷酸序列，以及VKpBR2 (图5A)和VHpBS2 (图5B 和5C)分阶段载体的邻近侧翼序列。非翻译核苷酸序列以小写字母显示。用于亚克隆的限 制位点加上下划线而指明。分泌信号肽序列用双下划线来指明。Vk和VH氨基酸残基的编 号与图2中的一样。图6显示了细胞表面竞争性结合测定的结果，该测定是为了比较两种人源化A20 抗体(hA20-l和hA20-2)与A20、cA20和嵌合型抗⑶20MAb (c2B8)的结合活性。图6A显示 了 hA20-l (实心的三角形)与hA20-2 (实心的圆形)和鼠类抗⑶20抗体A20(实心的正 方形)同样良好地竞争125I-A20与Raji细胞的结合。图6B显示了 hA20-l(实心的圆形)、 cA20(实心的正方形)和c2B8(实心的菱形)同样良好地竞争125I_c2B8与Raji细胞的结
I=I ο图7公开了人IgGl的恒定区(CH-铰链)(图7A)和人κ链的恒定区(Ck)(图 7Β)。图8为竞争性细胞表面结合测定。通过与鼠类2Β8和rituXimab(IDEC制药公司， San Diego，CA)所进行的细胞表面竞争性结合测定来评价人源化抗⑶20 Ab(cA20、hA20 和clF5，通过A蛋白柱上的亲和层析而纯化)的Ag结合特异性和亲和性研究。图8(A)为 cA20(正方形)、hA20-2(三角形)和hA20-l(圆形)与m2B8 (菱形)的结合活性的比较； 图8 (B)比较了 cA20 (正方形)、clF5 (三角形)和rituximab (菱形)的结合活性。图9为通过细胞表面竞争性结合检测来比较hA20与其他抗⑶20 Ab (包 括rituximab和鼠类Bi)的结合活性的研究。在存在浓度变化(0. 2_700ηΜ)的竞争 Ab、hA20(三角形)、mBl(倒三角形)或rituximab (正方形)的情况下，将恒定数量 (100，OOOcpm, ^ 10iCi/ig)的 125I 标记的 rituximab 与 Raji 细胞于 4°C温育 1-2 小时。图10描绘了交联的hA20和其他⑶20 Ab对于培养的淋巴瘤细胞的细胞毒性效应。
8通过(A)锥虫蓝染色和细胞计数或者(B)MTT测定来测量总细胞和存活细胞群体。图11为使用多种抗⑶20和其他Ab的体内治疗研究的图。将Raji细胞以静脉内 注射方式给予SCID小鼠，从而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。图12为描绘了使用hA20和hLL2的体内治疗的图。将Raji细胞以静脉内注射方 式给予SCID小鼠，从而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。发明详述1.总述正如上面所讨论的，未缀合或用治疗性放射性核素标记的抗CD20抗体不能在具 有中间或侵染性形式的B-细胞淋巴瘤的患者中提供高比率的客观和持续的反应。本发明 提供了用于治疗哺乳动物受试者(人和家养动物)的人源化、嵌合型和人抗CD20抗体及 其抗体融合蛋白，它们作为缀合物单独施用，或者与其他治疗试剂(包括其他裸露的抗体 和抗体治疗缀合物)联合施用。 本发明的抗⑶20 MAb含有特异性鼠类⑶R或者来自多于一种鼠的鼠类⑶R组合， 或者含有对于CD20抗原具有特异性的嵌合型抗CD20MAb。本发明的抗CD20 MAb是人源化、 嵌合型或人MAb,它们具有鼠类抗CD20 MAb的CDR的氨基酸，并基本上保持了鼠类抗CD20 MAb对B-细胞和B-细胞淋巴瘤以及白血病细胞的定向。抗CD20 MAb的轻链可变区的CDR 具有含有氨基酸RASSSVSYIH、RASSSLSFMH或RASSSVSYMH的CDRl，含有氨基酸ATSNLAS的 CDR2，和含有氨基酸 QQWTSNPPT、HQffSSNPLT 或 QQSFSNPPT 的 CDR3 ；抗 CD20MAb 的重链可变 区的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDRl，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有 氨基酸 STYYG⑶WYFDV、STYYG⑶WYFNV、SHYGSNYVDYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV 的 CDR3。在一个实施方案中，人源化和嵌合型MAb或其片段不具有含有STYYGGDWYFNV的重 链可变区的⑶R3。更优选地，当轻链可变区的⑶R3含有HQWSSNPLT并且重链可变区的⑶R3 含有SHYGSNYVDYFDV时，轻链可变区的CDRl不含有RASSSLSFMH。在另一个实施方案中，当 轻链可变区的CDRl含有RASSSLSFMH时并且当重链可变区的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV时， 轻链可变区的⑶R3不含有HQWSSNPLT。在另外的一个实施方案中，当轻链可变区的⑶Rl 含有RASSSLSFMH并且轻链可变区的⑶R3含有HQWSSNPLT时，重链可变区的⑶R3不含有 SHYGSNYVDYFDV。在另一个实施方案中，当轻链可变区的⑶R3含有QQSFSNPPT并且重链可 变区的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV时，轻链可变区的CDRl不含有RASSSVSYMH。此外，在另一个实施方案中，当轻链可变区的⑶Rl含有RASSSVSYMH并且重链可 变区的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV时，抗CD20单克隆抗体(MAb)或其片段不含有氨基酸为 QQSFSNPPT的轻链可变区的CDR3。另外，当轻链可变区的CDRl含有RASSSVSYMH并且轻链 可变区的CDR3含有QQSFSNPPT时，抗CD20MAb不含有氨基酸为VVYYSNSYWYFDV的重链可变 区的CDR3。在一个优选的实施方案中，人源化抗CD20(hCD20)单克隆抗体或其抗原结合片 段含有至少一种鼠类抗⑶20 MAb可变区的互补决定区(OTR)和至少一种人MAb可变区的 构架区(FR)，其中该人源化抗CD20MAb或其片段基本上保持了该鼠类抗CD20 MAb对B-细 胞和B-细胞淋巴瘤以及白血病细胞的定向。人源化抗体的可变区可以含有轻链可变区、重 链可变区或者轻链和重链可变区。人源化抗体或其片段可以进一步含有至少一种人抗体的 轻链和重链恒定区。
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本发明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有鼠类抗⑶20 MAb的⑶R和人抗体 轻链和重链可变区的构架区(FR)，同时基本上保持了亲代鼠类抗CD20 MAb对B-细胞和 B-细胞淋巴瘤以及白血病细胞的定向，其中鼠类抗CD20 MAb的轻链可变区的CDR具有含 有氨基酸RASSSVSYIH的⑶Rl，含有氨基酸ATSNLAS的⑶R2，和含有氨基酸QQWTSNPPT的 ⑶R3 ；鼠类抗⑶20 MAb的重链可变区的⑶R具有含有氨基酸SYNMH的⑶Rl，含有氨基酸 AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有氨基酸STYYG⑶WYFDV的CDR3。但是，人源化抗CD20 MAb或其片段可以在抗体轻链和重链可变区的FR中进一步含有至少一种来自鼠类MAb的相 应FR的氨基酸。人源化MAb可以进一步含有人抗体的轻链和重链恒定区。特别地，人源化 抗⑶20 MAb或其片段含有选自图4A中标示为hA20VHl或hA20VH2的鼠类重链可变区的1、 5、27、30、38、48、67、68、70、95、155和116位氨基酸残基的至少一个氨基酸残基，和含有选 自图4B中标示为hA20Vk的鼠类轻链可变区的4、21、35、38、45、46、59、99、104和106位氨 基酸残基的至少一个氨基酸残基。如果需要保持与CD20抗原的适当结合或者增强与CD20 抗原的结合，可以在轻链和重链可变链的人FR区域中保留一个或多个鼠类氨基酸序列。更 优选地，本发明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有图4B的hA20Vk和图4A的hA20VHl。最 优选地，本发明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有图4B的hA20Vk和图4A的hA20VH2。该 后者序列在VH2链的FR内比VHl含有更多的人氨基酸序列，因此是更加人源化的。本发明的优选的嵌合型抗⑶20 (c⑶20) MAb或其片段含有鼠类抗⑶20 MAb的⑶R 和鼠类抗CD20 MAb的轻链和重链可变区的FR区域(即亲代鼠类MAb的Fv)，还含有人抗体 的轻链和重链恒定区，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠类抗CD20 MAb对 B-细胞和B-细胞淋巴瘤以及白血病细胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的轻链可变区的 CDR 具有含有氨基酸 RASSSVSYIH、RASSSLSFMH 或 RASSSVSYMH 的 CDRl，含有氨基酸 ATSNLAS 的 CDR2，和含有氨基酸 QQWTSNPPT、HQWSSNPLT 或 QQSFSNPPT 的 CDR3 ；嵌合型抗 CD20 MAb 的 重链可变区的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDRl，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2， 和含有氨基酸 STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV 的 CDR3，前 提是，(a)其中当轻链可变区的⑶Rl含有氨基酸RASSSVSYIH，轻链可变区的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，轻链可变区的⑶R3含有氨基酸QQWTSNPPT，重链可变区的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重链可变区的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG时，重链可变区的CDR3 不含有 STYYGGDWYFNV ；(b)其中当轻链可变区的⑶Rl含有氨基酸RASSSLSFMH，轻链可变区的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，轻链可变区的⑶R3含有氨基酸HQWSSNPLT，重链可变区的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重链可变区的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG时，重链可变区的CDR3 不含有 SHYGSNYVDYFDV ；禾口(c)其中当轻链可变区的⑶Rl含有氨基酸RASSSVSYMH，轻链可变区的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，轻链可变区的⑶R3含有氨基酸QQSFSNPPT，重链可变区的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重链可变区的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG时，重链可变区的CDR3 不含有 VVYYSNSYWYFDV。更优选地，嵌合型抗⑶20 MAb或其片段含有鼠类抗⑶20 MAb的互补决定区(OTR) 和鼠类抗CD20 MAb的轻链和重链可变区的构架区(FR)，还含有人抗体的轻链和重链恒定区，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠类抗CD20 MAb对B-细胞和B-细胞 淋巴瘤以及白血病细胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的轻链可变区的CDR具有分别显示 在图4B和4A中并标示为cA20Vk和cA20VH的CDR。最优选地，嵌合型抗CD20 MAb或其片 段含有分别显示在图4B和4A中并标示为cA20Vk和cA20VH的鼠类抗CD20 MAb的轻链和
重链可变区。本发明也包括人抗CD20 MAb或其片段，它们含有人抗体的轻链和重链可变区与恒 定区，其中该⑶20 MAb基本上保持了鼠类抗⑶20MAb对B-细胞和B-细胞淋巴瘤以及白血 病细胞的定向和细胞结合特性，其中人抗CD20 MAb的轻链可变区的CDR具有与上面对于 嵌合型和人源化抗CD20 MAb所提及的同样的CDR，其显示在图4A和4B中。本发明也想要包括抗体融合蛋白或其片段，它们含有至少两个上述的抗CD20 MAb 或其片段。本发明的抗体融合蛋白或其片段也想要包括这样的抗体融合蛋白或其片段，即 它们含有至少一种第一种上述的抗CD20 MAb或其片段，和含有至少一种除了上述的抗⑶20 MAb或其片段之外的第二种MAb或其片段。更优选地，该第二种MAb为与⑶4、⑶5、⑶8、 CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、 CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、PlGF、 癌基因、癌基因产物或其组合反应的MAb，甚至是不同于此处描述的抗⑶20 MAb的抗⑶20 MAb。本发明的抗体融合蛋白可以由一个CD20 MAb和一个或多个用于提供对于不同抗原的 特异性的第二种MAb所组成，它们在下面将进行更详细的描述。人源化、嵌合型和人抗CD20抗体可以具有增强的与表位结合的亲和性以及抗肿 瘤和抗B-细胞活性，这是CDR突变和对于CDR与可变区中的其他序列进行操作的结果，从 而获得优良的治疗试剂以用于治疗B-细胞紊乱，包括B-细胞淋巴瘤和白血病以及自身免 疫病。对于抗体的结合特异性和亲和性或亲和力所进行的修饰是已知的，并在W098/44001 中进行了描述，这种修饰称之为亲和力成熟，该申请概括了修饰的方法，在此处以其整体进 行引用作为参考。也可希望修饰本发明的抗体以改善效应物功能，例如以致增强拮抗物的依赖抗原 的细胞介导细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。在Fc区域中可以取代一个 或多个氨基酸或者引入半胱氨酸，由此改善内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤能 力禾口 ADCC。见 Caron 等人，J. Ex. Med. 176 1191-1195 (1991) ^P Shopes, B. J. Immunol. 148 2918-2022(1992)，在此处以其整体进行引用作为参考。可以制备这样的抗体融合蛋白，即 其含有具有增强的补体裂解和ADCC能力的双重Fc区域。本发明也涉及含有编码选自下组的MAb或其片段的核酸的DNA序列(a)此处描述的抗⑶20 MAb或其片段，(b)含有至少两种抗⑶20 MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段，(c)含有至少一种含有此处描述的抗⑶20 MAb或其片段的第一种MAb或其片段和 至少一种除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二种MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段， 和(d)含有至少一种含有抗⑶20 MAb或其片段的第一种MAb或其片段和至少一种 第二种MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中第二种MAb为与⑶4、⑶5、⑶8、⑶14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基 因、癌基因产物或其组合反应的MAb。本发明也包括含有DNA序列的表达载体。在载体用于制备人源化、嵌合型和人抗 ⑶20 MAb或者其抗体融合蛋白或其片段的情况下，这些载体含有人免疫球蛋白轻链和重链 恒定区以及铰链区。在需要的时候，这些载体另外含有用于在选定的宿主细胞中表达MAb 的启动子以及免疫球蛋白增强和信号或引导序列。在本发明中特别有用的载体为pdHL2或 GS，特别是当用于表达嵌合型、人源化或人抗体如gig时，载体在此编码IgGl的重链和轻 链恒定区以及铰链区。更优选地，轻链和重链恒定区以及铰链区来自人EU骨髓瘤免疫球蛋 白，在此任选将至少一个同种异型位置上的氨基酸改变为在不同的IgGl同种异型中发现 的氨基酸，其中可以任选将基于EU编号系统的EU重链的253位氨基酸用丙氨酸进行取代。 见Edelman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 :78_85 (1969)，此处以其整体进行引用作为 参考。本发明包括含有编码本发明的抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合蛋白或其片段 的DNA序列的宿主细胞，或者含有具有这些DNA序列的载体的宿主细胞。特别有用的宿主 细胞为哺乳动物细胞，更特殊的是淋巴细胞，例如骨髓瘤细胞，这将在下面进行更详细的讨 论。本发明也包括具有下列步骤的表达抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合蛋白或其 片段的方法(a)用编码抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合蛋白或其片段的DNA序列转染 哺乳动物细胞，和(b)培养用DNA序列转染从而能够分泌抗CD20 MAb或其片段或者抗体融 合蛋白或其片段的细胞。可以使用在载体上具有选择标记的已知方法，从而能够容易地选 择出表达MAb和标记的宿主细胞。本发明特别地包括定向于B淋巴瘤细胞与白血病细胞的诊断或治疗缀合物，其具 有含有本发明的与B淋巴瘤细胞和白血病细胞结合的抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合 蛋白或其片段的抗体组分，该抗体组分与至少一种诊断或至少一种治疗试剂结合。诊断缀合物具有含有抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合蛋白或其片段的抗体组 分，其中诊断试剂含有至少一种光活诊断试剂，更优选地其中标记为具有60-4，OOOkeV的 能量的放射性标记或者非放射性标记。放射性标记优选地为发射Y射线、β射线和正电 子的同位素，其选自 125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62CU、64CU、mIn、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、 18F^m76Br及其组合。本发明的诊断缀合物也使用诊断试剂，例如造影剂如锰、铁或钆。本发明的治疗缀合物具有含有抗体融合蛋白或其片段的抗体组分，其中每个该 MAb或其片段与至少一种治疗试剂结合。治疗缀合物的治疗试剂优选地选自放射性标记、免 疫调节剂、激素、光活治疗试剂、可以为药物或毒素的细胞毒性试剂及其组合。在本发明中 使用的药物为那些具有选自下组的药物特性的药物抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢、 抗生素、生物碱、抗血管生成、细胞凋亡试剂及其组合。更特别地，这些药物选自氮芥、氮丙 啶衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类 似物、抗生素、酶、表鬼白毒素、钼配位复合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基胼衍生物、肾 上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内他丁(endostatin)、紫杉醇、喜树碱、蒽环类、紫杉烷和它们的 类似物以及其组合。本发明包括的毒素选自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)如onconase、DNA酶I、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素-A、美洲商陆 抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和假单胞菌内毒素。本发明的有用的治疗试剂为选自下组的免疫调节剂细胞因子、干细胞生长因子、 淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及 其组合。特别有用的为淋巴毒素如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子如白细胞介素(IL)、集落 刺激因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰 素如干扰素-α、-β或-γ和干细胞生长因子如称为“Si因子”的干细胞生长因子。更 特别地，免疫调节剂如 IL-I、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、 TNF-α或其组合在本发明中是可用的。特别有用的治疗缀合物含有一种或多种具有60-700keV的能量的放射性标记。这 种放射性标记选自 225AC、67Ga、9°Y、mIn、131I、125I、186Re、188Re、177LU、32P、64CU、67CU、212Bi、213Bi、 211At及其组合。其他有用的治疗缀合物为光活治疗试剂，如发色团或染料。其他有用的治疗缀合物含有寡核苷酸，特别是反义寡核苷酸，其优选地导向B-细 胞恶性肿瘤的癌基因和癌基因产物如bcl-2。本发明特别地包括在受试者中治疗B-细胞淋巴瘤或白血病细胞疾病或者自身免 疫病的方法，例如哺乳动物，包括人、家养或伴侣宠物如狗和猫，该方法包括将治疗有效量 的本发明的抗CD20 MAb或其片段施用于受试者，该抗CD20 MAb或其片段配制在可药用的 载体之中。该治疗使用没有结合治疗试剂的“裸露的抗体”。“裸露的抗CD20抗体”的施用 可以通过同时或顺次将治疗有效量的另一种“裸露的抗体”施用于受试者来补充，另一种 “裸露的抗体”可与靶细胞表面上的另一种抗原结合或反应，或者具有其他功能如MAb的Fc 部分中的效应物功能，这种功能是治疗性的，这些在此处进行了讨论。优选的附加MAb为至 少一种选自下组MAb的人源化、嵌合型、人或鼠类(在非人动物的情况下)MAb 与CD4、CD5、 CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、 CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUCl、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基 因、癌基因产物或其组合反应的MAb，并将其配制在可药用的载体之中。单独用裸露的抗CD20或者联合上面讨论的其他裸露的MAb进行治疗可以进一步 地通过同时或顺次施用治疗有效量的至少一种治疗试剂来补充，它们配制在可药用的载体 之中。正如此处所讨论的，治疗试剂可以包括细胞毒性试剂、放射性标记、免疫调节剂、激 素、酶、寡核苷酸、光活治疗试剂或其组合，它们配制在可药用的载体之中。在另一种治疗方法中，单独用裸露的抗CD20或者联合上面讨论的其他裸露的MAb 进行治疗可以进一步地通过同时或顺次施用治疗有效量的至少一种治疗缀合物来补充， 它们在此处进行了描述并配制在可药用的载体之中。治疗缀合物的抗体组分含有至少一 种选自下组MAb的人源化、嵌合型、人或鼠类(对于非人的受试者)MAb 与CD4、CD5、CD8、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、 CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、ΗΜ1· 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、 P1GF、癌基因、癌基因产物或其组合反应的MAb，并将其配制在可药用的载体之中。正如此处 所讨论的，治疗试剂可以包括细胞毒性试剂、放射性标记、免疫调节剂、激素、光活治疗试剂 或其组合，它们配制在可药用的载体之中。正如此处所描述的，本发明特别地包括在受试者中治疗B-细胞淋巴瘤或白血病
13或者自身免疫病的方法，该方法包括将治疗有效量的抗体融合蛋白或其片段施用于受试 者，该抗体融合蛋白或其片段含有至少两个本发明的抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少 一种本发明的抗⑶20 MAb或其片段和至少一种附加的MAb，附加的MAb优选地选自与⑶4、 CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、 CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱 生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因产物或其组合反应的MAb，它们配制在可药用的载体之 中。该治疗方法可以进一步通过同时或顺次将治疗有效量的至少一种配制于可药用 的载体之中的治疗试剂施用于受试者来补充，其中治疗试剂优选地为细胞毒性试剂、放射 性标记、免疫调节剂、激素、光活治疗试剂或其组合，它们配制在可药用的载体之中。此外，抗体融合蛋白可以治疗有效量的治疗缀合物的形式同时或顺次施用于受试 者，治疗缀合物含有至少一种与至少一种治疗试剂结合的MAb，其中缀合物的该MAb组分优 选地含有至少一种选自下组MAb的人源化、嵌合型、人或鼠类(对于非人的受试者)MAb 与 CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19, CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HMl. 24,HLA-DR, 腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因产物或其组合反应的MAb，它们配制在可药用的载体 之中。抗体融合蛋白本身可以与治疗试剂缀合，从而提供了一种载体来将多于一个的治疗 试剂与抗体组分相连，这些治疗试剂可以为不同的所述试剂的联合或者同样试剂的联合， 例如两个不同的治疗放射性标记。本发明也包括在受试者中诊断B-细胞淋巴瘤或白血病 的方法，该方法包括将含有本发明的与淋巴瘤或白血病细胞结合的抗CD20MAb或其片段或 者抗体融合蛋白或其片段的诊断缀合物施用于受试者的方法，例如哺乳动物，包括人以及 家养和伴侣宠物如狗、猫、兔、豚鼠，其中抗CD20 MAb或其片段或者抗体融合蛋白或其片段 与至少一种诊断试剂结合，它们配制在可药用的载体之中。此处描述了有用的诊断试剂。2.定义在下面的描述中，使用了许多术语和提供了下面的定义来使得能够容易理解本发 明。此处所述的抗体是指全长的(即天然存在的或者通过正常免疫球蛋白基因片段 重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或者免疫球蛋白分子的具有免疫活性 (即特异性结合)的部分如抗体片段。抗体片段是抗体的一部分，例如F (ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不 管结构，抗体片段与被完整抗体所识别的同样的抗原结合。例如，抗CD20单克隆抗体片段 与CD20的表位结合。术语“抗体片段”也包括任何合成的或经遗传工程改造的蛋白质，它们 像抗体一样通过与特异性抗原结合从而形成复合物来起作用。例如，抗体片段包括分离得 到的由可变区组成的片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段；重组单链多肽分子， 其中轻链和重链可变区由肽连接体相连(“scFv蛋白”)；和由模拟高变区的氨基酸残基所 组成的最小识别单位。棵露的抗体一般是未与治疗试剂缀合的完整抗体。之所以如此，是因为抗体分子 的Fc部分提供了效应物功能如补体结合和ADCC(依赖抗体的细胞毒性)，其将机制转化为 可能导致细胞裂解的作用。可是，Fc部分可能对于具有其他机制的治疗功能是不需要的，
14例如正在起作用的凋亡。裸露的抗体包括多克隆和单克隆抗体以及某些重组抗体，例如嵌 合型、人源化或人抗体。嵌合型抗体是含有包括来自一个物种的抗体互补决定区(OTR)在内的可变区的 重组蛋白质，该抗体优选为啮齿动物抗体，而抗体分子的恒定区来自人抗体的恒定区。对 于兽医应用，嵌合型抗体的恒定区可以来自其他物种，例如猫或狗。人源化抗体是重组蛋白质,其中将来自一个物种的抗体如啮齿动物抗体的⑶R从 啮齿动物抗体的重链和轻链可变区转移至人重链和轻链可变区中。抗体分子的恒定区来自 人抗体的恒定区。人抗体是从转基因小鼠中获得的抗体,这种小鼠已经“经过工稈改造”而可产生 对于抗原激发进行反应的特异性人抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因座的元件导入 来自这样的胚胎干细胞系的小鼠品系中，即该胚胎干细胞系具有内源重链和轻链基因座的 定向破裂。转基因小鼠能够合成对于人抗原特异的人抗体，这些小鼠可以用于产生分泌人 抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由下列学者进行了描述，Green等 人，Nature Genet. 7 :13 (1994) ；Lonberg 等人，Nature 368:856(1994)；和 Taylor 等人， Int. Immun. 6 =579(1994)。完整的人抗体也可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体 展示技术来构建，这些技术在本领域中是已知的。见例如，McCafferty等人，Nature 348 552-553(1990)描述了在体外从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变区基因库中生产人抗 体和其片段。在该技术中，将抗体可变区基因按阅读框架克隆进丝状噬菌体的主要或次要 的外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上作为功能性抗体片段进行展示。因为丝状颗粒含 有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择也导致对于编码显示出那 些特性的抗体的基因进行选择。以这种方式，噬菌体模拟了一些B-细胞的特性。噬菌体 展示可以多种形式来实施，对于其概况，见例如Johnson和Chiswell，Current Opinionin Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体也可以由体外活化的B-细胞来产生。见U. S.专利号5，567，610和 5，229，275，在此以其整体进行引用作为参考。治疗试剂是与抗体部分分别、同时或顺次施用或者与抗体部分缀合而讲行施用的 分子或原子，抗体部分即为抗体或抗体片段或亚片段，这些试剂在疾病的治疗中是有用的。 治疗试剂的例子包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化 合物、光活试剂或染料和放射性同位素。诊断试剂是与抗体部分缀合而讲行施用的分子或原子，抗体部分即为抗体或抗 体片段或亚片段，这些试剂在通过定位含有抗原的细胞来诊断疾病中是有用的。有用的诊 断试剂包括放射性同位素、染料(例如具有生物素-链霉抗体生物素蛋白复合物)、造影 剂、荧光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁性离子)，但并不局限 于此。U.S.专利号6，331，175描述了 MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，在此 将其以整体进行引用作为参考。优选地，诊断试剂选自放射性同位素、用于磁共振成像的 增强剂和荧光化合物。为了向抗体组分加载放射性金属或顺磁性离子，可能需要将抗体与 具有长尾的试剂进行反应，在长尾上附加了多个用于结合离子的螯合基团。这样的尾可以 是聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或者其他具有侧链的衍生或可衍生的链，在这些侧链上可以 结合螯合基团如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双硫缩氨基脲、聚肟等等已知用于该目的的基团。螯合物通过用标准的化学方法与肽抗原偶 联。螯合物通常通过能够以最小的免疫反应性损失和最小的聚合和/或内部交联与分子 形成键的基团而与抗体相连。其他更不常见的用于将螯合物与抗体缀合的方法和试剂公开 于Hawthorne的U. S.专利4，824，659中，题目为“抗体缀合物”，其于1989年4月25日出 版，此处以其整体引用了该公开内容作为参考。特别有用的金属-螯合剂组合包括与位于 60-4，OOOkev的通常能量范围内的诊断同位素一起使用的2-苄基-DTPA和其单甲基与环 己基类似物，这些同位素例如为 125I、131I、123I、124I、62CU、64CU、18F、mIn、67Ga、68Ga、99mTC、94mTC、 "(:、13Ν、15Ο、76Βγ以用于放射性成像。当与本发明的抗体一起使用时，与非放射性金属如锰、 铁和钆复合的同样的螯合物可用于MRI。大环螯合物如ΝΟΤΑ、DOTA和TETA可使用多种金 属和放射性金属，最特别地分别使用镓、钇和铜的放射性核素。这种金属-螯合剂复合物可 以通过将环大小适合目标金属的大小而非常稳定地形成。本发明也包括其他环型螯合物如 大环聚醚，其对于稳定地结合核素如223Ra与RAIT具有重要的影响。免疫缀合物是抗体组分和治疗或诊断试剂的缀合物。诊断试剂可以含有放射性或 非放射性标记、造影剂(例如用于磁共振成像、计算断层X射线照相法或者超声波)，放射性 标记可以为发射Y射线、β射线、α射线、俄歇电子或正电子的同位素。表汰载体是含有在宿主细胞中表汰的基因的DNA分子。通常地，将基因表达置于 某些调节元件的控制之下，包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。称 这样的基因“可操作地”与调节元件相连。重组宿主可以为任何含有克隆载体或表达载体的原核或真核细胞。该术语也包 括那些这样的原核或真核细胞以及转基因动物，即它们经过遗传工程改造而在宿主细胞的 染色体或基因组或者宿主细胞的细胞中含有克隆基因。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨 髓瘤细胞如SP2/0细胞和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、杂交瘤细胞系和其他 用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞。也是特别有用于表达MAb和其他融合蛋白的细胞为 WO 0063403Α2中所公开的人细胞系PER. C6，其与常规的哺乳动物细胞系如CH0、C0S、Vero、 Hela.BHK和SP2-细胞系相比可产生2-200倍更多的重组蛋白。具有经修饰的免疫系统的 特殊转基因动物对于产生完整的人抗体是特别有用的。在此处使用时，术语抗体融合蛋白是重组产牛的抗原结合分子，在其中连接具有 相同或不同特异性的两个或更多个相同或不同的单链抗体或者抗体片段。融合蛋白的价表 明融合蛋白具有多少个与单个抗原或表位结合的臂或位点；即单价的、二价的、三价的或多 价的。抗体融合蛋白的多价表示其能够利用多重相互作用与抗原结合，因此增强与抗原结 合的亲和力。特异性表明抗体融合蛋白能够结合多少种抗原或表位；即单特异性的、双特异 性的、三特异性的、多特异性的。使用这些定义，天然抗体如IgG是二价的，因为其具有两个 结合臂，但是其是单特异性的，因为其结合一种表位。单特异性、多价融合蛋白对于一个表 位具有多于一个的结合位点，但是只结合一种表位，例如双抗体具有两个与同样抗原反应 的结合位点。融合蛋白可以含有单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合或者 同样抗体组分的多重拷贝。融合蛋白可以附加地含有抗体或抗体片段和治疗试剂。适合于 这种融合蛋白的治疗试剂的例子包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素 (“抗体-毒素融合蛋白”)。优选的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，优选为重组RNA酶。多特异件抗体是这样的抗体，即其能够同时结合至少两个具有不同结构的目标,例如两个不同的抗原、同一抗原上的两个不同的表位或者半抗原和/或抗原或表位。一 种特异性可以是对于B-细胞、T-细胞、骨髓细胞、浆细胞和肥大细胞抗原或表位。另一种 特异性可以是对于同一细胞类型上的不同抗原，例如B-细胞上的⑶20、⑶19、⑶21、⑶23、 ⑶46、⑶80、HLA-DR、⑶74、MUCl和⑶22。多特异性、多价抗体为具有多于一个结合位点的 结构物，这些结合位点具有不同的特异性。例如双抗体，在其中一个结合位点与一个抗原反 应，另一个结合位点与其他抗原反应。Mfimi^是能够同时结合两个具有不同结构的目标的抗体。双特异性抗体 (bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异地与例如B-细胞、T-细胞、骨髓细 胞、浆细胞和肥大细胞抗原或表位结合的臂，和至少一个特异地与具有治疗或诊断试剂的 可定向缀合物结合的其他臂。多种双特异性融合蛋白可以通过分子工程来产生。在一种形 式中，双特异性融合蛋白是单价的，其由例如具有对于一个抗原的单个结合位点的scFv与 具有对于第二种抗原的单个结合位点的Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋 白是二价的，其由例如具有对于一个抗原的结合位点的IgG与具有对于第二种抗原的两个 结合位点的两个scFv组成。狗源化或猫源化抗体为这样的重组蛋白，即在其中将单克降抗体的啮齿动物(或 其他物种)互补决定区从啮齿动物(或其他物种)免疫球蛋白的重链和轻链可变区中分别 转移至狗或猫的免疫球蛋白可变区中。家养动物包括大型动物如马、牛、绵羊、山羊、骆驼、羊驼和猪以及伴侣动物。在优 选的实施方案中，家养动物是马。伴侣动物包括作为宠物饲养的动物。这些动物主要是狗和猫，虽然正如类人的灵 长类动物如猴包括在内一样，小型动物如豚鼠、仓鼠、大鼠和雪貂也包括在内，。在优选的实 施方案中，伴侣动物为狗或猫。3.包括嵌合型、人源化和人抗体的单克隆抗体的制备单克隆抗体(MAb)对于特殊抗原的同型类群的抗体，这种抗体只含有一种类型的 抗原结合位点和只结合抗原决定簇上的一个表位。对于特异的抗原的啮齿动物单克隆抗 体可以通过本领域熟练技术人员已知的方法来获得。见例如，Kohler和Milstein，Nature 256 :495 (1975)，和 Coligan 等人(编者)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, 2. 5. 1-2. 6. 7 页(John ffiley&Sons 1991)[在下文中称为 “Coligan” ]。简要地，单克隆抗 体可以通过下列步骤来获得，即给小鼠注射含有抗原的组合物，通过取得血清样品来证实 抗体产生的存在，摘除脾以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交 瘤，克隆杂交瘤，选择出产生抗抗原的抗体的阳性克隆，培养产生抗抗原的抗体的克隆，和 从杂交瘤培养物中分离得到抗体。MAb可以用多种完全确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化出来。这种分离 技术包括使用A蛋白琼脂糖凝胶的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。见例如， Coligan在2. 7. 1-2. 7. 12页和2. 9. 1-2. 9. 3页所述。也可见Baines等人，免疫球蛋白G的纯 化(Purification of Immunoglobulin G(IgG)),METHODS IN M0LECULARBI0L0GY,VOL. 10， 79-104 页(Humana 出版社，1992)。在起始形成对于免疫原的抗体之后，抗体可以进行测序并随后用重组技术来制 备。鼠类抗体和抗体片段的人源化和嵌合化对于本领域中的熟练技术人员来说是熟知的。 例如，人源化单克隆抗体通过下列步骤来产生，即将小鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区中转移至人可变区中，然后在鼠类对应物的构架区中用人残基取代。来 自人源化单克隆抗体的组分的使用避免了与鼠类恒定区的免疫原性相联系的潜在问题。已描述了用于克隆鼠免疫球蛋白样可变区的一般技术，例如Orlandi等人，Proc. Nat，1 Acad. Sci.USA 86:3833(1989)的发表，此处以其整体进行引用作为参考。用于构 建嵌合型抗体的技术对于本领域中的熟练技术人员是熟知的。作为一个例子，Leimg等人， Hybridoma 13 =469(1994)描述了它们是如何通过下列方法产生LL2嵌合体的，即将编码 LL2单克隆抗体(抗CD22抗体)的Vk和Vh区域的DNA序列分别与人κ和IgG1恒定区区 域结合在一起。该文献也提供了分别标示为Vk和Vh的LL2轻链和重链可变区的核苷酸序 列。已描述了产生人源化MAb的技术，例如Jone等人，Nature 321:522(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332:323(1988) ；Verhoeyen 等人，Science239 1534 (1988) ；Carter 等 人，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 89 4285(1992) ；Sandhu 等人，Crit. Rev. Biotech. 12 437(1992)；和Singer等人，J. Immun. 150 :2844 (1993)，在此处引用了其中的每一个文献 作为参考。嵌合型抗体是这样的重组蛋白，即其含有包括来自一种动物如啮齿动物抗体的 CDR的可变区，而抗体分子的其余部分即恒定区来自人抗体。因此，嵌合型单克隆抗体也可 以通过用一个或多个不同的人FR取代嵌合型MAb的可变区中的鼠类FR序列来进行人源 化。特别地，将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区中转移至人抗体的相应可 变区。因为简单地将小鼠⑶R转移至人FR中常常导致抗体亲和性的降低或者甚至是丧失， 所以可能需要附加的修饰以恢复鼠类抗体的原始亲和性。这能够伴随着在FR区域中将一 个或多个人残基用它们的鼠类对应物进行取代，以便获得对于其表位具有良好的结合亲和 性的抗体。见例如，Tempest 等人，Biotechnology 9 266(1991)和 Verhoeyen 等人，Science 239 =1534(1988) 0此外，人源化、嵌合型和人MAb对于特异表位的亲和性可以通过⑶R的诱 变而得到增加，因此较低剂量的这种抗体可以与较高剂量的诱变之前的较低亲和性MAb — 样有效。见例如W00029584A1。用于产生本发明的抗体的另一种方法为在转基因家畜的乳汁中生产。见例如， Colman,A.，Biochem. Soc. Symp. ,63 :141_147，1998 ；U. S.专利 5，827，690，这两个文献以其 整体进行引用作为参考。制备两个DNA构建体，其分别含有编码成对的免疫球蛋白重链和 轻链的DNA片段。将DNA片段克隆进表达载体中，该表达载体含有优先地在乳腺上皮细胞 中表达的启动子序列。例子包括来自下列基因的启动子，即兔、奶牛和绵羊酪蛋白基因、奶 牛α-乳球蛋白基因、绵羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸性蛋白基因，但并不局限于此。 优选地，插入片段在其3' —侧与来自乳腺特异性基因的同源基因组序列相接。这提供了聚 腺苷酸化位点和稳定转录的序列。将表达盒共注射进受精的哺乳动物卵细胞的原核中，然 后将卵细胞移植入受体雌性的子宫中并进行孕育。在出生之后，通过Southern分析来确定 两个转基因的存在以对于后代进行筛选。为了产生抗体，重链和轻链基因必须在同一个细 胞中同时表达。用本领域中已知的标准免疫学方法对于来自转基因雌性动物的乳汁进行分 析，以确定抗体或抗体片段的存在和功能性。抗体可以用本领域中已知的标准方法从乳汁 中纯化出来。本发明的完整的人抗体，即人抗CD20 MAb，或者其他与人源化、嵌合型或人抗 ⑶20抗体进行联合治疗的人抗体，例如抗⑶22、抗⑶19、抗⑶23或抗⑶21 MAb，它们可以从转基因的非人动物中获得。见例如，Mendez等人，Nature Genetics，15 146-156 (1997)； U.S.专利号5，633，425，它们以其整体进行引用作为参考。例如，人抗体可以从具有人免疫 球蛋白基因座的转基因小鼠中重新获得。通过让内源免疫球蛋白基因失活和导入人免疫球 蛋白基因座而将小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座是极其复杂的，其具有大 量的不连续片段，这些片段在一起占据了人基因组的大约2%。为了确保转基因小鼠能够产 生足够的抗体的所有组成部分，大部分的人重链和轻链基因座必须导入小鼠基因组中。这 在逐步的过程中来完成，该过程的开始是形成酵母人工染色体(YAC)，其在种系构型中含有 人重链或轻链免疫球蛋白基因座。因为每个插入物的大小为大约1Mb，所以YAC的构建需要 覆盖免疫球蛋白基因座的片段的同源重组。将两个YAC即一个含有重链基因座的YAC和一 个含有轻链基因座的YAC分别导入小鼠中，这是通过将含有YAC的酵母球芽和小鼠胚胎干 细胞融合来进行的。然后将胚胎干细胞克隆微注射进小鼠胚泡中。将结果所得的嵌合型雄 性根据它们通过其种系传递YAC的能力进行筛选，并将它们与在鼠类抗体产生上有缺陷的 小鼠进行交配。将两个转基因品系进行交配，即一个含有人重链基因座的品系和另一个含 有人轻链基因座的品系，从而形成可产生对于免疫作出反应的人抗体的后代。更新近的用于产生双特异性MAb的方法包括经工程改造的重组MAb，其含有附 加的半胱氨酸残基从而它们可比更普通的同型免疫球蛋白交联得更加牢固。见例如， FitzGerald 等人，Protein Eng. 10(10) 1221-1225，1997。另一个方法为对于重组融合蛋 白进行工程改造，该重组融合蛋白连接了两个或更多个不同的具有所需的双特异性的单链 抗体或抗体片段。见例如，Coloma等人，Nature Biotech. 15 159-163，1997。多种双特异 性融合蛋白可以通过分子工程来产生。在一种形式中，双特异性融合蛋白是单价的，其例 如由具有单个对于一个抗原的结合位点的scFv和具有单个对于第二种抗原的结合位点的 Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是二价的，其例如由具有两个对于一个 抗原的结合位点的IgG和具有两个对于第二种抗原的结合位点的两个scFv组成。连接两个或更多个不同的单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白以简单的方 式产生。可以使用重组方法来产生多种融合蛋白。例如可以产生含有源自人源化单克隆抗 ⑶20抗体的Fab片段和源自鼠类抗diDTPA的scFv的融合蛋白。易弯曲的连接体如GGGS 将scFv与抗⑶20抗体的重链恒定区相连接。作为另一种选择，scFv可以与另一个人源化 抗体的轻链恒定区相连接。将合适的对于重链Fd与scFv的框内连接所必需的连接体序列 通过PCR反应导入VL和VK区域中。然后将编码scFv的DNA片段连接入含有编码CHl区 域的DNA序列的分阶段载体中。切除结果所得的scFv-CHl构建体，并将其连接入另一个载 体中，该载体含有编码抗CD20抗体的VH区域的DNA序列。4.抗体片段的产生识别特异表位的抗体片段可以用已知的技术来产生。抗体片段为抗体的抗原结 合部分，例如F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。其他抗体片段包括可以通过用胃蛋白 酶消化抗体分子而产生的F(ab)' 2片段，和可以通过还原F(ab)' 2片段的二硫桥而产生 的Fab'片段，但并不局限于此。作为另一种选择，可以构建Fab'表达文库(Huse等人， 1989，Science, 246 1274-1281)以使得能够快速和容易地鉴定具有所希望的特异性的单 克隆Fab'片段。本发明包括抗体和抗体片段。单链Fv分子(scFv)具有VL区域和VH区域。VL和VH区域联合在一起而形成靶结合位点。这两个区域进一步地用肽连接体(L)共价连接在一起。scFv分子在如果VL区 域为scFv分子的N末端部分时标示为VL-L-VH，或者在如果VH区域为scFv分子的N末 端部分时标示为VH-L-VL。用于制造scFv分子和设计合适的肽连接体的方法在下列文献 中进行了描述，即US专利号4，704, 692 ；US专利号4，946，778 ；R. Raag和M. Whitlow，单链 Fv (Single Chain Fvs), FASEB Vol 9:73-80(1995)；和 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker，单链抗体 可变区(Single ChainAntibody Variable Regions)，TIBTECH Vol 9:132-137(1991)。在 此处引用这些文献作为参考。抗体片段可以通过完整长度的抗体的蛋白酶水解或者通过在大肠杆菌(E. coli) 或其他宿主中表达编码该片段的DNA来制备。抗体片段可以常规方法通过完整长度的抗体 的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。例如，抗体片段可以此方式来产生，即用胃蛋白酶 酶切抗体从而提供标示为F(ab'片段。该片段可以进一步进行切割，此时使用 硫醇还原试剂，和任选使用用于由于切割二硫键所产生的巯基的实心基团，从而产生3. 5S Fab'单价片段。作为另一种选择，使用木瓜蛋白酶的酶切直接产生两个单价Fab片段和 Fc片段。已经描述了这些方法，例如Goldenberg，U.S.专利号4，036，945和4，331，647 和其中所包含的文献，在此处以其整体引用这些专利作为参考。此外，见Nisonoff等人， Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960) ；Porter, Biochem. J. 73 119 (1959) ；Edelman 等人， METHODS IN ENZYMOLOGYVol. 1,422 页(Academic 出版社 1967)；禾口 Coligan, 2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 页。抗体片段的另一种形式为编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR是抗体可变区 的片段，其在结构上与抗体所结合的表位是互补的，并比可变区的其他部分更加具有可变 性。因此，⑶R有时称为高变区。一个可变区具有三个⑶R。可以通过构建编码目标抗体 的CDR的基因来获得CDR肽。这种基因可用下列方法来制备，例如使用聚合酶链反应从 产生抗体的细胞的RNA来合成可变区。见例如，Larrick等人，Methods :A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991) ；Courtenay-Luck，单克隆抗体的遗传操作(Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies), MONOCLONAL ANTIBODIES :PR0DUCTI0N, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编者)，166-179页(剑桥大学出版 社，1995)；和 Ward 等人，抗体的遗传操作和表达(Genetic Manipulation and Expression of Antibodies) ,MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编 者)，137-185 页(Wiley-Liss 出版社，1995)。其他切割抗体的方法例如重链从单价轻-重链片段中的分离、片段的进一步的切 割或者其他酶、化学或遗传技术也可以使用，只要片段可与完整抗体所识别的抗原结合。5.多特异性和多价抗体也可以将此处描述的抗CD20抗体以及用于联合治疗的其他具有不同特异性的抗 体制成多特异性抗体(具有至少一个对CD20表位或者抗原的结合位点，和至少一个对CD20 上的另一个表位或者另一个抗原的结合位点)和多价抗体(具有多个对于同一个表位或抗 原的结合位点)。多价靶结合蛋白在US系列号09/911，610 (Leung等人)中进行了描述， 在此处以其整体进行引用作为参考。本发明提供了双特异性抗体或抗体片段，其具有至少一个特异地与被定向的细胞 标记相结合的结合区域，和至少一个特异地与可定向缀合物相结合的其他结合区域。可定向缀合物含有载体部分，该载体部分具有或带有至少一个被至少一个双特异性抗体或抗体 片段的结合区域所识别的表位。可以使用多种重组方法来产生上述的双特异性抗体和抗体片段。抗CD20多价抗体也在本发明的考虑之内。该多价靶结合蛋白通过缔合第一种和 第二种多肽来构建。第一种多肽含有第一种单链Fv分子，其共价地与优选为免疫球蛋白轻 链可变区的第一种免疫球蛋白样区域相连接。第二种多肽含有第二种单链Fv分子，其共价 地与优选为免疫球蛋白重链可变区的第二种免疫球蛋白样区域相连接。第一种和第二种单 链Fv分子中的每一个形成一个靶结合位点，第一种和第二种免疫球蛋白样区域缔合形成 第三个靶结合位点。具有VL-L-VH构型(其中L是连接体)的单链Fv分子可以缔合具有VH_L_VL构 型的另一个单链Fv分子来形成二价二聚体。在这种情况下，第一种scFv分子的VL区域和 第二种scFv分子的VH区域缔合形成一个靶结合位点，而第一种scFv的VH区域和第二种 scFv的VL区域缔合形成另一个靶结合位点。本发明的另一个实施方案为CD20双特异性、三价定向蛋白，其含有两条非共价连 接的异源多肽链从而形成三个结合位点，其中的两个结合位点对于一个目标具有亲和性， 第三个结合位点对于半抗原具有亲和性，该半抗原可制造出来并附着于用于诊断和/治疗 试剂的载体上。优选地，结合蛋白具有两个CD20结合位点和一个CD22结合位点。双特异 性、三价靶试剂具有两个不同的scFv，一个scFv含有两个Vh区域，该Vh区域来自一个通过 短连接体与另一个抗体的\区域相连的抗体，第二种scFv含有两个\区域，该\区域来 自通过短连接体与其他抗体的Vh区域相连的第一种抗体。用于产生来自V1^n \区域的多 价、多特异性试剂的方法提供了，在宿主生物体中从DNA质粒合成的单独的链完全由 域组成(Vh-链)或者完全由\区域组成链)，以这种方式因此任何具有多价和多特异 性的试剂可以通过一个\-链和一个Vf链的非共价连接来产生。例如，为了形成三价、三 特异性试剂，Vh-链将由三个Vh区域的氨基酸序列组成，每个Vh区域来自具有不同特异性的 抗体，并且它们用可变长度的肽连接体连接在一起；和链将由互补的\区域组成，它们 用与用于Vh-链的那些类似的肽连接体连接在一起。因为抗体的Vh和\区域以反平行的 方式缔合，因此本发明中的优选方法为链中的\区域以与Vh-链中的Vh区域相反的顺 序排列。6.双抗体、三抗体和四抗体本发明的抗⑶20抗体也可以用于制备功能性双特异性单链抗体(bscAb)，也称为 双抗体，其可以在哺乳动物细胞中用重组方法来产生。见例如，Mack等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :7021-7025，1995，此处引用了此文献。例如，bscAb可通过此方法产生，即用重组 方法通过甘氨酸_丝氨酸连接体来连接两个单链Fv片段。用标准的PCR方法来分离两个 目标抗体的V轻链(\)和V重链(Vh)区域。然后连接从每个杂交瘤中获得的\和Vh cDNA 以在两步融合PCR中形成单链片段。第一个PCR步骤导入(Gly4-Ser1)3连接体，第二个步 骤连接\和Vh扩增子。然后将每个单链分子克隆进细菌表达载体中。在扩增之后，将一个 单链分子切除并亚克隆进含有第二种目标单链分子的另一个载体中。将结果所得的bscAb 片段亚克隆进真核生物表达载体中。功能蛋白的表达可以通过将载体转染进中国仓鼠卵巢 细胞中来获得。双特异性融合蛋白以类似的方式制备。双特异性单链抗体和双特异性融合
21蛋白包括在本发明的范围之内。例如，人源化、嵌合型或人抗CD20单克隆抗体可以用于产生抗原特异性双抗体、 三抗体和四抗体。单特异性双抗体、三抗体和四抗体选择性地结合靶抗原，由于分子上的 结合位点的数量增加了，因此对于靶细胞的亲和力增加了，并且在所期望的位置上观察到 更长的保留时间。对于双抗体来说，使用这样的两条链，即其含有通过五个氨基酸残基连接 体与人源化CD20 MAb的Vk多肽相连接的人源化CD20 MAb的Vh多肽。每条链形成人源化 CD20双抗体的一半。在三抗体的情况下，使用这样的三条链，即其含有不通过连接体与人源 化⑶20 MAb的Vk多肽相连接的人源化⑶20 MAb的Vh多肽。每条链形成h⑶20三抗体的 三分之一。此处描述的双特异性双抗体的最基本用途是预定向CD20阳性肿瘤，以便随后特 异地递送诊断或治疗试剂。这些双抗体选择性地结合靶抗原，这使得能够增加亲和力和在 所希望位置上出现更长的保留时间。此外，将未结合抗原的双抗体快速地从身体中清除，从 而将正常组织的暴露减少至最小。用于增加清除率的双特异性抗体的点突变可以在Qu等 人的US临时申请号60/361，037中找到，在此处以其整体进行引用作为参考。用于亲和力 增强的双特异性双抗体公开于US申请号10/270, 071 (Rossi等人)、10/270，073 (Rossi等 人)和10/328，190 (Rossi等人)中，在此处以其整体进行引用作为参考。诊断和治疗试剂 可以包括同位素、药物、毒素、细胞因子、激素、生长因子、缀合物、放射性核素和金属。例如， 用于磁共振成像(MRI)的钆金属。放射性核素的例子为225AC、18F、68Ga、67Ga、9°Y、86Y、mIn、 131I、125I、123I、99mTC、94mTC、186Re、188Re、177LU、62CU J4Ciu67Ciu212BL213Bd11C^ 13N、150、76Br 和 211At。其他放射性核素也可用作诊断和治疗试剂，特别是那些在60-4，OOOkeV的能量范围 内的放射性核素。更近来的一段时间，也报道了具有双特异性的四价串联双抗体(称为tandab) (Cochlovius 等人，Cancer Research (2000) 60 :4336_4341)。双特异性 tandab 是两个同样 的多肽的二聚体，每个多肽含有两个不同抗体的四个可变区(VH1、VL1, VH2、Vj，它们以这样 的方向进行连接，即使得在自缔合时容易形成两个对于两个不同特异性中的每个特异性的 潜在结合位点。7.缀合的多价和多特异性抗⑶20抗体在本发明的另一个实施方案中，为缀合的多价抗C920抗体。附加的氨基酸残基可 以添加至第一种或第二种多肽的N-或C-末端。附加的氨基酸残基可以含有肽标记、信号 肽、细胞因子、酶(例如激活前体药物的酶)、激素、肽毒素如假单胞菌外毒素、肽药物、细胞 毒性蛋白或其他功能蛋白。在此处使用时，功能蛋白是具有生物功能的蛋白质。在一个实施方案中，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒性蛋白、螯合物、 细胞因子和其他功能试剂可以与多价靶结合蛋白缀合，优选地通过与多价靶结合蛋白的氨 基酸残基侧链的共价结合来进行，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基基团。多种常规的连接体 可以用于此目的，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳化二亚胺、 马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等等。试剂与多价蛋白质的缀合优选地不会明显 地影响蛋白质与其目标的结合特异性或亲和性。在此处使用时，功能试剂是具有生物功能 的试剂。优选的功能试剂为细胞毒性试剂。在另外其他的实施方案中，由双特异性抗体引导的治疗剂或前体药物聚合物向体
22内目标的递送可以与放射性核素的双特异性抗体递送相联合，因此获得联合的化疗和放射 免疫治疗。每个治疗剂可以与可定向的缀合物相缀合和同时施用，或者核素可以作为第一 种可定向缀合物的一部分而给予，并且药物可以作为第二种可定向缀合物的一部分而在后 面的步骤中给予。在另一个实施方案中，细胞毒性试剂可以与聚合物载体缀合，该聚合物载体可以 随后与多价靶结合蛋白缀合。对于此目的，见Ryser等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,75 3867-3870，1978 ；US专利号4，699，784 ；和US专利号4，046，722，此处引用这些文献作为参 考。缀合优选地不会明显地影响多价结合蛋白的结合特异性和亲和性。8.对于治疗和诊断的人源化、嵌合型和人抗体的使用人源化、嵌合型和人单克隆抗体即此处描述的抗CD20 MAb和其他MAb，根据本发 明它们适合用于治疗方法和诊断方法。因此，本发明考虑了作为裸露的抗体单独施用本发 明的人源化、嵌合型和人抗体，或者作为多模式治疗进行施用，这是在时间上依照给药方案 来完成的，而不是与治疗试剂相缀合。裸露的抗CD20 MAb的效能可以通过下列方法来增 强，也就是说通过补充一种或多种其他裸露的抗体，即对于特异抗原如⑶4、⑶5、⑶8、⑶14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD 37、CD 38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、 CD74、CD80、CD126、B7、MUCK la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因产 物或其组合的MAb ；用一种或多种抗CD20或对于这些所述抗原的抗体的免疫缀合物，它们 缀合了治疗试剂，包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗放射性核素等等；用一种或多种 治疗试剂，包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗放射性核素等等，其根据规定的给药方 案与MAb同时或顺次施用。优选的B-细胞抗原包括那些等同于人⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、 ⑶23、⑶46、⑶52、CD74、⑶80和⑶5抗原的抗原。优选的T-细胞抗原包括那些等同于人 ⑶4、⑶8和⑶25 (IL-2受体)抗原的抗原。等同于HLA-DR抗原的等同物可以用于治疗 B-细胞和T-细胞紊乱。特别优选的B-细胞抗原为那些等同于人⑶19、⑶22、⑶21、⑶23、 ⑶74、⑶80和HLA-DR抗原的抗原。特别优选的T-细胞抗原为那些等同于人⑶4、⑶8和 CD25抗原的抗原。CD46是癌细胞表面上的抗原，其阻断依赖补体的裂解(CDC)。此外，本发明考虑了在B-细胞淋巴瘤和其他疾病或紊乱中施用免疫缀合物以用 于诊断和治疗。在此处使用时，免疫缀合物为含有抗体组分和治疗或诊断试剂的分子，包括 可以承载诊断或治疗试剂的肽。免疫缀合物保持了抗体组分的免疫反应性，即抗体部分在 缀合之后具有与缀合之前大致同样的或轻微减弱的结合同类抗原的能力。许多种诊断和治疗试剂可以有利地与本发明的抗体缀合。此处所述的治疗试剂是 那些也可用于与上述裸露的抗体分开施用的试剂。治疗试剂例如包括化疗药物如长春花 生物碱、蒽环类、表鬼白毒素、紫杉烷、抗代谢试剂、烷基化试剂、抗激酶试剂、抗生素、Cox-2 抑制剂、抗有丝分裂试剂、抗血管生成试剂和细胞凋亡试剂，特别是阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉 醇、CPT-11、喜树碱，和其他来自这些和其他类型的抗肿瘤试剂的试剂等等。其他可用于制 备免疫缀合物和抗体融合蛋白的癌症化疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、 叶酸类似物、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、钼配位复合物、激素等等。合适的化 疗试剂描述于下列文献中，即REMINGTON，SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack出版 公司，1995)，和 GOODMAN AND GILMAN' S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 第7版(Ma cMillan出版公司，1985)，以及这些出版物的修改版本。其他合适的化疗试剂例如实验药物对于本领域的熟练技术人员来说是已知的。另外，螯合剂例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或者合适的肽，在其上可以缀合可检 测的标记如荧光分子或者细胞毒性试剂如中金属或放射性核素。例如，治疗上有用的免 疫缀合物可以通过将光活试剂或染料与抗体合成物缀合而获得。荧光组合物，例如荧光 染料和其他发色团或染料如对于可见光敏感的卟啉，它们已经用于通过将合适的光导向 病灶来检测和治疗损伤。在治疗上，这称为光辐射、光治疗或光动态治疗(Jori等人(编 者)，PH0T0DYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHERDISEASES(Libreria Progetto 1985)； van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。此外，单克隆抗体已经与光活化染料进 行偶联以获得光治疗。Mew 等人，J. Immunol. 130 =1473(1983)；同作者，CancerRes. 45 4380 (1985) ；Oseroff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 8744 (1986)；同作者，Photochem. Photobiol. 46 83 (1987) ；Hasan 等人，Prog. Clin. Biol. Res. 288 471 (1989) ；Tatsuta 等 人，Lasers Surg. Med. 9 422(1989) ；Pelegrin 等人，Cancer 67 :2529 (1991)。可是，这些早 期的研究没有包括内窥镜治疗应用的使用，尤其是在使用抗体片段或亚片段的情况下。因 此，本发明考虑了含有光活试剂或染料的免疫缀合物的治疗使用。本发明也考虑了使用放射性和非放射性试剂作为诊断试剂。合适的非放射性诊 断试剂为适合于磁共振成像、计算断层X射线照相法或者超声波的造影剂。磁成像试剂 例如包括非放射性金属如锰、铁和钆，当它们单独与本发明的抗体一起使用时，它们以含有 2-苄基-DTPA和其单甲基与环己基类似物的金属_螯合剂组合形式进行复合。见在2001 年10月10日提交的U. S.系列号09/921，290，在此处以其整体进行引用作为参考。此外，放射性标记的抗体或免疫缀合物可以含有用于诊断成像的发射Y射线的 放射性同位素或者正电子放射体。合适的放射性同位素特别是在60-4，OOOkeV的能量范 围内的放射性同位素包括 131I、123I、124I、^,^,^^"in.^Ga.^Ga.^Tc.^Tc,18F^11C, 13N^15Oj5Br等等。见例如，标题为“用镓-68标记定向试剂(Labeling TargetingAgents with Gallium-68)，，的U. S.专利申请(U. S.临时申请号60/342，104)，其发明者为 G. L. Griffiths和W. J. McBride,此文献公开了用于成像目的的正电子放射体如18F、68Ga、 94mTc等等，在此处以其整体进行引用作为参考。特别有用的治疗放射性核素包括32P、33P、 47Sc^64Ciu67Ciu67GdlllAgjllIrK125LmLi42PiN153SnK161TlK 166Dy、166Ho、177Liu 186Re、188Re、 189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac,但并不局限于此。特别有用的诊断/检测放射性核 素包括 18F、52Fe、62CU、64CU、67CU、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTC、94TC、99mTC、mIn、123I、124I、125I、131I、 154_158Gd、32P、9°Y、188Re 和 175Lu,但并不局限于此。毒素例如假单胞菌外毒素也可以与本发明抗CD20抗体的抗体融合蛋白的治疗 试剂部分进行复合或形成治疗试剂部分。在制备这种缀合物或其他融合蛋白中适合使 用的其他毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒 素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。见 例如，Pastan 等人，Cell 47:641(1986)；和 Goldenberg 等人，CA-A Cancer Journal for Clinicians 44 :43 (1994)。另外适合于在本发明中使用的毒素对于本领域熟练技术人员来 说是已知的，并公开于U. S.专利6，077，499之中，在此处以其整体进行引用作为参考。免疫调节剂如细胞因子也可以与抗体融合蛋白的治疗试剂部分进行缀合或形成 治疗试剂部分，或者与本发明的人源化抗CD20抗体一起施用。用于本发明的合适的细胞因子包括下述的干扰素和白细胞介素，但并不局限于此。寡核苷酸，例如在U. S. 5，734，033 (Reed)中所述的抑制bcl_2表达的反义分子，在 此处以其整体引用该文献作为参考，这些寡核苷酸也可以与抗体融合蛋白的治疗试剂部分 进行缀合或形成治疗试剂部分，或者与本发明的人源化抗CD20抗体一起施用。9.免疫缀合物的制备任何本发明的抗体或抗体融合蛋白可以与一个或多个治疗或诊断试剂缀合。一般 地，一种治疗或诊断试剂附着于每个抗体或抗体片段上，但多于一种的治疗试剂或诊断试 剂可以附着于同一个抗体或抗体片段上。本发明的抗体融合蛋白含有两个或更多个抗体或 其片段，每个构成该融合蛋白的抗体可以含有治疗试剂或诊断试剂。另外，一个或多个抗体 融合蛋白的抗体可以附着多于一种的治疗或诊断试剂。此外，治疗试剂不需要是同样的，而 可以是不同的治疗试剂。例如，可以在同一个融合蛋白上附着药物和放射性同位素。特别 地，IgG可以用131I进行放射性标记并附着在药物上。可以将131I引入IgG的酪氨酸中，和 将药物连接到IgG赖氨酸的ε氨基上。治疗和诊断试剂也可以连接至还原的SH基团和糖 侧链上。适合用于处理疾病组织的放射性核素基本上通过放射β-粒子来衰变，其包括 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, 99Mo, 105Rh,109Pd^111Ag,125!,1311,142Pr,143Pr, 149Pm、153Sm、161Tb、166H0、169Er、177LU、186Re、188Re、189Re、194Ir、198AU、199AU、211Pb、212Pb 和 213Bi, 但并不局限于此。有用的放射粒子的核素的最大衰变能量优选为20-5，OOOkeV，更 优选为100-4，OOOkeV,最优选为500-2，500keV。基本上通过放射俄歇粒子进行衰变的 核素也是优选的。例如，58Co、67Ga、80mBr,99mTc, 103mRh, 109Pt,111 In,119Sb,1251,161Ho, 189mOs 和 192Ir。有用的放射俄歇粒子的核素的衰变能量优选为< 1，OOOkeV，更优选为< lOOkeV， 最优选为<70keV。基本上通过产生α-粒子来进行衰变的核素也是优选的。这种核素 包括 152Dy、211At、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、225Ac、221Fr、217At、213Bi 和 255Fm,但并不局限于 此。有用的放射α-粒子的放射性核素的衰变能量优选为2，000-10，OOOkeV，更优选为 3，000-8，OOOkeV，最优选为 4，000-7，OOOkeV0利用Y-射线检测而用作诊断试剂的放射性核素包括51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、 67Ga、75Se、97RU、99mTC、mIn、114mIn、123I、125I、131I、169yb、197Hg 和 2(I1T1，但并不局限于此。有用的 发射Y -射线的放射性核素的衰变能量优选为20-2，OOOkeV,更优选为60-600keV，最优选 为 100-300keV。用于正电子放射型断层X射线照相法的放射性核素包括18F、51Mn、52mMru52Fe、55Co、 62CU、64CU、68Ga、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、89Zr,94mTc,110In,120I 和 1241，但并不局限于此。 有用的发射正电子的放射性核素的总衰变能量优选为< 2，OOOkeV，更优选为< 1，OOOkeV， 最优选为< 700keV。本发明的双特异性抗体可用于预定向方法中，其提供了一种优选的方式来将两 个治疗试剂或两个诊断试剂递送给受试者。U. S.系列号09/382，186和09/337，756公开 了用双特异性抗体进行预定向的方法，其中双特异性抗体用125I进行标记并递送给受试 者，随后递送用99mTc标记的二价肽，在此处以其整体进行引用作为参考。预定向方法也描 述于下列文献中，即US系列号09/823，746 (Hansen等人)和10/150，654 (Goldenberg等 人)，以及2003年1月31日提交的US临时申请，其标题为“用于治疗和诊断试剂的施用白勺方法禾口组合物(Methods andCompositions for Administration of Therapeutic and DiagnosticAgents) ”，代理记录号018733/1103 (McBride等人)，这些文献也都在此处以其 整体进行引用作为参考。递送导致对于125I和99mTc的良好的肿瘤/正常组织比例，因此显 示出两个诊断放射性同位素的效用。已知的治疗试剂或诊断试剂的任何联合可以用于标记 抗体和抗体融合蛋白。MAb缀合物的抗体组分的结合特异性、治疗试剂或诊断试剂的效能 和抗体Fc部分的效应物活性可以通过缀合物的标准测试来测定。本发明涉及用于在患有B-细胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中预定向 细胞的方法，其包括(i)施用具有多特异性的抗体融合蛋白或其片段，其具有至少一个特异地结合 细胞的臂和至少另一个特异地结合可定向缀合物的臂；(ii)任选，向患者施用清除组合 物，从而使得能够让该组合物从循环系统中清除未结合抗原的抗体融合蛋白或其片段；和 (iii)向患者施用含有载体部分的可定向缀合物，载体部分具有或带有至少一个可被抗体 融合蛋白或其片段的至少另一个臂所识别的表位，并将载体部分与至少一种第一治疗或诊 断试剂缀合。本发明的抗体融合蛋白应当是多特异性的抗体。在优选的实施方案中，抗体 为双特异性抗体，并可以为双抗体。第一治疗试剂选自放射性标记、免疫调节剂、激素、光活 治疗试剂、细胞毒性试剂、寡核苷酸及其组合，和其中的第一诊断试剂为放射性标记、光活 诊断试剂或非放射性标记中的至少一种。抗体融合蛋白或其片段也可以与第二治疗试剂缀 合，例如至少一种放射性标记、免疫调节剂、激素、光活治疗试剂、细胞毒性试剂、寡核苷酸 及其组合，或者可以与第二诊断试剂缀合，例如放射性标记、光活诊断试剂或非放射性标记 中的至少一种。在一个实施方案中，第一和第二治疗试剂或诊断试剂是相同的。治疗或诊断试剂可以通过二硫键的形成而附着于还原的抗体组分的铰链区。作 为另一种选择，这样的肽可以通过使用异双功能交联剂而附着于抗体组分上，例如N-琥 珀酰基 3-(2_ 吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。Yu 等人，Int. J. Cancer 56:244(1994)。用 于这种缀合的一般性技术在本领域中是熟知的。见例如，Wong，CHEMISTRY 0FPR0TEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC 出版社，1991) ；Upeslacis 等人，用化学方法修饰 抗体(Modification of Antibodiesby Chemical Methods)，MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS，Birch 等人(编者)，187-230 页(Wiley-Liss 公司，1995)； Price，合成月太来源的抗体的产生禾口表征(Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies)， MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter等人(编者)，60-84页(剑桥大学出版社，1995)。作为另 一种选择，治疗或诊断试剂可以通过抗体Fc区域中的糖部分进行缀合。糖基团可以用于增 加与硫羟基结合的同样肽的加载，或者糖部分可以用于结合不同的肽。通过抗体糖部分将肽与抗体组分缀合的方法对于本领域熟练技术人员来说是熟 知的。见例如，Shih 等人，Int. J. Cancer 41:832(1988) ；Shih 等人，Int. J. Cancer 46: 1101(1990)；和Shih等人，U.S.专利号5，057，313，所有这些文献在此处以其整体进行引 用作为参考。一般的方法包括将具有氧化的糖部分的抗体组分与载体聚合物反应，该载体 聚合物具有至少一个游离胺功能基团并加载大量的肽。该反应导致起始的席夫碱(亚胺) 键，其可以通过还原成二级胺而稳定下来，从而形成最终的缀合物。如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段，那么Fc区域是不存在的。可
26是，向完整长度的抗体或抗体片段的轻链可变区中引入糖部分是可能的。见例如，Leimg等 人，J. Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等人，U. S.专利号 5，443，953 (1995) ；Leung 等人， U.S.专利号6，254，868，所有这些文献在此处以其整体进行引用作为参考。经工程改造的 糖部分用于附着治疗或诊断试剂。10.可药用的赋形剂将要递送给受试者的人源化、嵌合型和人抗CD20 MAb可以由单独的MAb、免疫缀 合物、融合蛋白组成，或者可以含有一种或多种药物上合适的赋形剂、一种或多种附加成分 或者这些的一些联合。本发明的免疫缀合物或裸露的抗体可以根据已知用于制备药物上有用的组合物 的方法来进行配制，其中将免疫缀合物或裸露的抗体结合入具有药物上合适的赋形剂的混 合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水是药物上合适的赋形剂的一个例子。其他合适的赋形剂对于 本领域技术人员来说是熟知的。见例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea&Febiger 1990)；和 Gennaro (编者)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack出版公司，1990)；以及它们的修改版本。本发明的免疫缀合物或裸露的抗体可以配制成用于通过例如快速注射或持续输 注的静脉内施用。优选地，本发明的抗体在小于大约4小时的期间内进行输注，更优选地在 小于大约3小时的期间内进行输注。例如，第一次25-50mg可以在30分钟内进行输注，优 选地甚至在15分钟内，剩余的在接下来的2-3小时内进行输注。用于注射的配剂可以存在 于单位剂量形式中，例如存在于安瓿或多次剂量容器中，其中具有添加的防腐剂。组合物可 以采取这样的形式，即在油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳浊液，并且可以含有配制试 剂如悬浮剂、稳定剂和/分散剂。作为另一种选择，活性成分可以存在于粉末形式中，并在 使用之前与合适的载体如经灭菌的无热原的水进行组合。可以使用另外的药学方法来控制治疗或诊断试剂或者裸露的抗体的作用持续时 间。可控释放制剂可以通过使用聚合物来复合或吸收免疫缀合物或者裸露的抗体而进行制 备。例如生物相容的聚合物包括聚(亚乙基-共_乙酸乙烯酯)的基质，和硬脂酸二聚体与 癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10:1446(1992)。免疫缀 合物或抗体从这种基质上的释放速率取决于免疫缀合物或抗体的分子量、基质中免疫缀合 物或抗体的数量和分散颗粒的大小。Saltzman等人，Biophys. J. 55 =163(1989) ；Sherwood 等人，如上。其他固体的剂量形式描述于下列文献中，即Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea&Febiger 1990)；和 Gennaro (编 者)，REMINGTON，SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack 出版公司，1990)；以及它们的 修改版本。免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸露的抗体也可以经过皮下或者甚至经过其他肠胃 外途径施用于哺乳动物。此外，施用可以是持续的输注或单次或多次快速注射。优选地， 本发明的抗体在小于大约4小时的期间内进行输注，更优选地在小于大约3小时的期间内 进行输注。这优选地通过在开始时缓慢地进行输注来实施。例如，在15-30分钟内输注 25-50mg的剂量，和在2-3小时以内的期间内输注剩余的剂量。一般地，施用于人的免疫缀 合物、融合蛋白或裸露的抗体的剂量会依赖于这些因素而变化，即患者的年龄、体重、身高、 性别、通常的医学状况和以前的医疗史。通常地，希望提供接受一定剂量的免疫缀合物、融合蛋白或裸露的抗体的受体，该剂量在单次静脉内输注时位于大约lmg/kg-20mg/kg的范 围内，虽然当情况要求时更低或更高的剂量也是可以进行施用的。因此，对于70kg的患 者施用l_20mg/kg的剂量，例如对于1. 7m的患者施用70_1，400mg或41_824mg/m2的剂量。 当需要时该剂量可以重复，例如，在4-10周内每周一次，优选地在8周内每周一次，更优选 地在4周内每周一次。也可以更少的频率进行施用，例如在几个周内每隔一周一次。更特 别地，本发明的抗体如裸露的抗⑶20可以每2或3周一剂进行施用，并总共重复至少3齐IJ。 本发明的抗体可以在4-8周内每周施用一次，这也是优选的。换句话说也就是，如果剂量减 少至大约200-300mg/m2 (即对于1. 7m的患者每剂有340mg，或者对于70kg的患者以4. 9mg/ kg进行施用)，可以在4-8周内每周施用一次。作为另一种选择，剂量计划表可以减少，即 在2-3个月内每2或3周施用一次；例如，如果剂量为300-500mg/m2(即对于1. 7m的患者 施用510-850mg，或者对于70kg的患者以7. 3_12mg/kg进行施用)。给药计划表可以任选 以其他的间隔进行重复，剂量可以通过多种肠胃外途径而给予，这是在伴随着剂量和计划 表的适当调整的情况下进行的。对于治疗目的，将免疫缀合物、融合蛋白或裸露的抗体以治疗有效量施用于哺乳 动物。对于本发明合适的受试者通常是人，虽然非人的动物受试者也在考虑之内。如果所施 用的数量在生理上是显著的，那么将抗体制剂称为以“以治疗有效量”进行施用。如果一种 试剂的存在导致受体哺乳动物生理上的可检测的变化，那么该试剂在生理上是显著的。特 别地，如果本发明的抗体制剂的存在引起抗肿瘤反应或者减轻自身免疫病状态的病征和症 状，那么其在生理上是显著的。生理上显著的效应也可以是在受体哺乳动物中激发体液和 /或细胞免疫反应。11.治疗方法本发明考虑了将本发明的裸露的抗CD20抗体用作用于治疗B-细胞紊乱和其他疾 病的的主要组合物。特别地，此处描述的组合物对于治疗下列疾病是特别有用的，即多种自 身免疫病，以及无痛感形式的B-细胞淋巴瘤、侵染形式的B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白 血病、急性淋巴细胞白血病和Wa 1 dens t Γδιη，s巨球蛋白血症。例如，人源化抗⑶20抗体 组分和免疫缀合物可以用于治疗无痛感和侵染形式的非Hodgkin’ S淋巴瘤。用于治疗的组合物单独含有至少一种人源化、嵌合型或人单克隆抗CD20抗体，或 者还联合含有其他抗体如其他人源化、嵌合型或人抗体、治疗试剂或者免疫调节剂。特别 地，用完整的人抗体进行联合治疗也在考虑之内，其是通过上述的方法来进行的。对于相同或不同的表位或抗原的裸露或缀合的抗体也可以与一个或多个本发明 的抗体联合。例如，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗体可以与另一个裸露的人源化、裸 露的嵌合型或裸露的人抗CD20抗体联合，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗体可以与抗 CD20免疫缀合物联合，裸露的抗CD20抗体可以与抗CD22放射性缀合物联合，或者裸露的抗 CD22抗体可以与人源化、嵌合型或人抗CD20抗体联合，该人源化、嵌合型或人抗CD20抗体 缀合了同位素或者一个或多个化疗试剂、细胞因子、毒素或其组合。在本发明中也可以使用 人源化、嵌合型或人CD20抗体和毒素或免疫调节剂的融合蛋白，或者至少两个不同的B-细 胞抗体(例如CD20和CD22 MAb)的融合蛋白。上面已经列出了许多不同的抗体组合，它们 指向至少两个不同的B-细胞紊乱相关抗原，可以将它们以下列形式进行构建，即裸露的抗 体或者部分裸露和部分与治疗试剂或免疫调节剂缀合，或者只与另一个治疗试剂联合，例
28如细胞毒性药物或具有放射性的试剂。在此处使用时，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素如肿 瘤坏死因子(TNF)和造血因子如白细胞介素(例如白细胞介素-I(IL-l)、IL-2、IL-3、IL-6、 IL-10、IL-12、IL-21和IL-18)、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、-β和-Y)、称为“Si因 子”的干细胞生长因子、红细胞生成素和血小板生成素。合适的免疫调节剂部分的例子包括 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α 等等。作为另一种选择，受试 者可以接受裸露的抗CD20抗体和分开施用的细胞因子，这些细胞因子可以在施用裸露的 抗CD20抗体之前、同时或之后进行施用。正如上面所讨论的，抗CD20抗体也可以与免疫调 节剂缀合。免疫调节剂也可以与杂交抗体缀合，杂交抗体由一个或多个与不同的抗原结合 的抗体组成。本发明的多模式治疗进一步包括使用裸露的抗CD20抗体的免疫治疗，并通过以 裸露的抗体、融合蛋白的形式或作为免疫缀合物来施用抗CD22、抗CD19、抗CD21、抗CD74、 抗⑶80、抗⑶23、抗⑶46或HLA-DR(包括不变链)抗体而加以补充。裸露的抗⑶20抗体 或其片段也可以用裸露的抗MUCl抗原的抗体来补充，MUCl抗原在某些B-细胞上表达。这 些抗体包括多克隆、单克隆、嵌合型、人或人源化抗体，它们识别至少一个在这些抗原决定 簇上的表位。抗CD19和抗CD20抗体对于本领域熟练技术人员来说是已知的。见例如， Ghetie 等人，Cancer Res. 48 2610 (1988) ；Hekman 等人，Cancer Immunol. Immunother. 32 364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 353 (1996) ^P U.S.专利号 5，798，554 和 6，187，287，在此处以其整体进行引用作为参考。在另一种形式的多模式治疗中，受试者联合标准的癌症化疗而接受裸露的抗CD20 抗体和/或免疫缀合物。例如，“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2表鬼臼毒素和 150-200mg/m2亚硝基脲氮芥)为用于治疗非Hodgkin，s淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur. J. Haematol. 51 18 (1993)。其他合适的联合型化疗方案对于本领域熟练技术人员来说是熟 知的。见例如，Freedman 等人，非 Hodgkin，s 淋巴瘤(Non-Hodgkin' s Lymphomas),CANCER MEDICINE, VOL. 2,第三版，Holland 等人(编者)，2028-2068 页(Lea&Febiger 1993)。作 为举例说明，第一代用于治疗中级非Hodgkin’ s淋巴瘤(NHL)的化疗方案包括C-MOPP(环 磷酰胺、长春新碱、甲基苄胼和强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)。 有用的第二代化疗方案为m-BAC0D(氨甲蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、 地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案为MACOP-B (氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰 胺、长春新碱、强的松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。另外的有用的药物包括丁酸苯酯和 brostatin-l0在优选的多模式治疗中，化疗药物和细胞因子与根据本发明的抗体、免疫缀 合物或融合蛋白进行共施用。细胞因子、化疗药物和抗体或免疫缀合物可以任何顺序或一 起进行施用。在优选的实施方案中，用下列方法治疗NHL或自身免疫病，即以每周200_400mg/ m2的剂量每周4次输注人源化抗CD20抗体，并持续4个连续的周(静脉注射2_6小时)， 如果需要在接下来的月/年中进行重复。优选地，人源化抗⑶20抗体以200-300mg/m2的 剂量和以每隔一周一次的方式进行施用，持续4-8次注射。同样也是优选的为，通过如上 述每周4次注射或者频率更少的注射来治疗NHL，但是在同样的这些天中以360mg/m2的剂
29量联合施用^ratuzuMAb (抗⑶22人源化抗体)，印ratuzuMAb是在抗⑶20单克隆抗体输 注之前、期间或之后通过静脉输注1小时来给予的。或者，在联合治疗中所使用的抗体也 可以交替的顺序进行输注，因此在不同的周中交替进行输注，这导致对于4-8或更多个剂 量单位中的每一个的总注射顺序来说每个剂量单位每隔一周给予一次。然后将这些给药计 划表以不同的间隔进行重复，例如3-6周，这取决于患者的临床状态和对于每个治疗方案 的反应。更优选的是，通过如上述每周4次输注抗CD20抗体或者频率更少的输注来治疗 NHL，其联合了一次或多次注射用治疗性同位素如钇_90(总剂量为5-35mCi/m2的Y-90，在 几个周或几个月的时间内进行一次或多次注射)进行放射性标记的CD22 MAb。US系列号 09/590，284 (Goldenberg等人)公开了使用抗CD22抗体的自身免疫紊乱的免疫疗法，在此 处以其整体进行引用作为参考。另外，本发明的治疗组合物可以含有裸露的单克隆抗CD20抗体的混合物或杂交 分子，这些抗⑶20抗体导向不同的、非实心的⑶20表位。因此，本发明考虑了这样的治疗 组合物，其含有与至少两个CD20表位结合的单克隆抗CD20抗体的混合物。另外，此处所描 述的治疗组合物可以含有具有变化的CDR序列的抗CD20抗体的混合物。虽然裸露的抗⑶20抗体是用于治疗B-细胞淋巴瘤和自身免疫病的主要治疗 组合物，但是这种抗体治疗的效能可以通过使用补充的试剂来对于裸露的抗体进行补充 而得到增强，例如免疫调节剂，如干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，白细胞介素包括 IL-I、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21，和细胞因子包括 G-CSF 和 GM-CSF。因此， CD20抗体不仅可以与抗体和细胞因子联合，这是以与抗CD20抗体的混合物(分开给予或 者以某一预定的给药方案来给予)或者缀合物或融合蛋白的形式来进行的，而且可以与 药物的联合形式来给予。例如，抗CD20抗体可以与CHOP联合而作为4种药物化疗方案。 另外，裸露的抗CD20抗体可以与裸露的抗CD22抗体和CHOP或氟达拉滨联合而作为用于 NHL治疗的药物联合。使用抗CD22抗体的B-细胞恶性肿瘤的免疫疗法描述于US专利号 6，183，744 (Goldenberg 等人)和 US 系列号 09/307，816 (Goldenberg 等人)，在此处以其 整体进行引用作为参考。补充的治疗组合物可以在施用抗CD20抗体之前、同时或之后进行 施用。正如上面所讨论的，本发明的抗体可以用于治疗B-细胞淋巴瘤和白血病以及其 他的B-细胞疾病或紊乱。例如，抗CD20抗体可以用于治疗B-细胞相关的自身免疫病，包 括III型自身免疫病，例如免疫介导的血小板减少症如急性特发性血小板减少性紫癜和慢 性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、干燥综合征、多发性硬化症、Sydenham's舞蹈病、重症 肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、类风湿性关节炎、多腺综合征、大疱性类天疱 疮、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu’ s动脉炎、 Addison' s病、类风湿性关节炎、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动 脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture' s综合征、血栓闭塞性脉管炎、原发性胆汁性肝硬化、桥 本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型 天疱疮、Wegener’ s肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、 恶性贫血、快速进展性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎。抗⑶20抗体也可以在表达⑶20抗原的细胞中引起凋亡。在文献中提供了这一诱 导的证据。例如，证明了用这样的淋巴样细胞可以引起凋亡，即该淋巴样细胞具有与交联CD20 MAb 的 IgGl-Fc 反应的 Fc 受体。见 Shan 等人，Cancer Immunol. Immunother. 48(12) 673-683(2000)。此外，还报道了嵌合型⑶20MAb的凝集体即同聚合体可引起凋亡。见 Ghetie 等人，Blood 97(5) 1392-1398 (2000)；和 Ghetie 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(14) 7509-7514(1997)。可以将对于B-细胞的CD20表面抗原具有特异性的抗体注射入哺乳动物受试者 中，然后这些抗体与正常的和恶性的B-细胞的⑶20细胞表面抗原结合。哺乳动物受试者包 括人和家养动物，包括宠物如狗和猫。当存在对于CD20抗原的物种交叉反应时，本发明的 即人源化、嵌合型、人、狗源化和猫源化的抗CD20 MAb和甚至是鼠类抗CD20 MAb可以用于 治疗非人哺乳动物受试者。见下面的施例10和11。在人中具有免疫原性的鼠类MAb在非 人哺乳动物受试者中通常具有较弱的免疫原性。与CD20表面抗原结合的抗CD20抗体导致 成瘤性B-细胞的破坏和清除。因为正常的和恶性的B-细胞都表达CD20抗原，因此抗CD20 抗体将会导致B-细胞死亡。可是，只有正常的B-细胞会再增殖，而恶性的B-细胞会被根 除或者明显地减少。另外，可以将具有破坏肿瘤的潜在能力的化学试剂或放射性标记与抗 CD20抗体缀合，从而这些试剂特异地定向于成瘤性B-细胞。12.表达载体将编码人源化、嵌合型或人抗⑶20 MAb的DNA序列通过重组工程而置于多种已知 的提供核酸复制的宿主载体中。可以用已知的方法来设计这些载体从而含有对于在其递 送进的细胞中指导核酸的转录、翻译或两者所必需的元件。可以使用已知的方法学来产生 表达构建体，其具有可操作地与合适的转录/翻译控制信号相连接的编码蛋白质的序列。 这些方法包括体外重组DNA技术和合成技术。例如，见Sambrook等人，1989，MOLE⑶LAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，冷泉港实验室(New York) ；Ausubel 等人，1997，CURRENT PROTOCOLS IW0LECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons (New York)。在本发明中也提供了不 与载体相联系的载体的递送。适合在本发明中使用的载体可以是病毒的或非病毒的。病毒载体的特殊例子包括 腺病毒、AAV、单纯疱疹病毒、慢病毒、和逆转录病毒。非病毒载体的例子为质粒。在优选的 实施方案中，载体为质粒。在此处使用时，表达载体为含有在宿主细胞中表达的基因的多核苷酸。通常地，将 基因表达置于某些调节元件的控制之下，包括组成型或可诱导的启动子、组织特异性调节 元件和增强子。这样的基因被称为“可操作地”与调节元件相连。优选地，本发明的表达载体含有编码人源化、嵌合型或人抗⑶20MAb的DNA序列， 该抗CD20 MAb包含有重链和轻链可变区和恒定区。可是，可以使用两个表达载体，一个具 有重链可变区和恒定区，另一个具有轻链可变区和恒定区。更优选地，表达载体进一步含有 启动子。因为可以使用任何强的启动子，因此可以含有编码分泌信号肽的DNA序列、编码人 IgGl重链恒定区的基因组序列、Ig增强子元件和至少一个编码选择标记的DNA序列。在此处也考虑了表达人源化抗⑶20 MAb的方法，其包括(i)使至少一种含有编码 人源化、嵌合型或人抗CD20 MAb的DNA序列线性化，(ii)用至少一种该线性化载体转染哺 乳动物细胞，(iii)挑选出表达标记基因的经转染的细胞，和(iv)鉴定从转染细胞中分泌 人源化抗⑶20 MAb的细胞。13.制备抗⑶20抗体的方法
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一般地，抗⑶20 MAb的Vk (可变轻链)和Vh (可变重链)序列可以通过多种分子 克隆程序如RT-PCR、5，-RACE和cDNA文库筛选来获得。特别地，抗CD20 MAb的V基因可 以通过PCR扩增而从表达鼠类或嵌合型抗CD20 MAb的细胞中获得，并进行测序。为了确 定它们的真实性，可以如 Orlandi 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833(1989))所述 将经克隆的\和Vh基因在细胞培养物中表达为嵌合型Ab，此处引用该文献作为参考。基 于V基因序列，然后可以如Leung等人所述(Mol. Immunol. 32 =1413(1995))设计和构建人 源化抗⑶20 MAb，此处引用该文献作为参考。可以通过通常的分子克隆技术(Sambrook等 人，MOLECULAR CLONING =A LABORATORY MANUAL，第二版(1989))从任何已知的产生鼠类或 嵌合型抗CD20 MAb的杂交瘤系或转染细胞系中制备出cDNA。MAb的Vk序列可以用引物 VK1BACK 禾口 VK1F0R(Orlandi 等人，1989)或 Leung 等人(Biotechniques, 15 286(1993))所 描述的延生引物组来扩增，此处引用这些文献作为参考，而Vh序列可以用引物对VH1BACK/ VH1F0R(Orlandi 等人，1989，上述)或 Leung 等人(Hybridoma，13 :469 (1994))所描述的 与鼠类IgG恒定区退火的引物来扩增，此处引用这些文献作为参考。PCR反应混合物含有 10μ 1 第一条链 cDNA 产物、10μ 1 IOXPCR 缓冲液[500mM KClUOOmMTris-HCl (pH 8.3)、 15mM MgCl2 和 0. 01% (w/v)明胶](Perkin ElmerCetus, Norwalk, CT)、250 μ M 每种 dNTP、 200nM引物和5个单位TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)，将该PCR反应混合物进行30 个循环的PCR。每个PCR循环优选地由下列步骤组成，即于94°C变性1分钟、于50°C退火 1. 5分钟和于72°C聚合化1. 5分钟。扩增出的Vk和Vh片段可以在2%的琼脂糖(BioRad， Richmond, CA)上进行纯化。类似地，如 Leung 等人(Mol. Immunol. 32 1413 (1995))所述， 人源化V基因可以通过将长寡核苷酸模板合成和PCR扩增联合而进行构建。在实施例3中 可见在自动RNA/DNA合成仪(Applied Biosystems, foster City, CA)上合成寡聚体A和聚 体B以用于构建人源化V基因的方法。对于Vk的PCR产物可以亚克隆进分阶段载体中，例如基于pBR327的分阶段载体 VKpBR，其含有Ig启动子、信号肽序列和方便的用于使得VkPCR产物的框内连接变得容易的 限制位点。对于￥11的？0 产物可以亚克隆进类似的分阶段载体中，如基于？8111^(^1 {的 VHpBS。含有各自PCR产物的单个克隆可以用例如Sanger等人的方法来进行测序(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 :5463 (1977))，此处引用此文献作为参考。此处描述的DNA序列将会被认为是包括了其所有的等位基因、突变体和变异体， 而不论它们是天然发生的还是诱导产生的。含有Vk和Vh以及启动子与信号肽序列的表达盒可以分别从VKpBR和VHpBS中切 除，这是通过双限制酶切消化为HindIII-BamHI片段而进行的。然后可以将Vk 表达盒 分别连接入合适的表达载体中，例如PKh和pGlg (Leung等人，Hybridoma，13 :469(1994))。 表达载体可以共转染进合适的细胞中，例如骨髓瘤Sp2/0-Agl4(ATCC，VA)，这是由潮霉素 抗性所选择出的集落，并对上清液进行监测以确定嵌合型或人源化抗CD20MAb的产生，例 如通过ELISA测定，这在下面进行了描述。作为另一种选择，可以将Vk 表达盒分别装 配入经修饰的分阶段载体VKpBR2和VHpBS2中，然后分别作为Xbal/BamHI和XhoI/BamHI 片段而切除，并亚克隆进单个表达载体如pdHL2中，这些Gilles等人(J. Immunol. Methods 125 191(1989))进行了描述，以及还在 Losman 等人，Cancer,80 2660(1997)中显示了 Sp2/0-Agl4细胞中的表达。在本发明中有用的另一种载体为Barnes等人，Cytotechnology
3232 109-123 (2000)所描述的GS载体，其优选地在NSO细胞系和CHO细胞中表达。其他合 适的哺乳动物表达系统描述于Werner等人，Arzneim. -Forsch. /Drug Res. 48 (II)，Nr. 8， 870-880(1998)之中。共转染和用ELISA测定分泌抗体的克隆可以如下所述来进行。根据Co等人， J. Immunol.，148 1149 (1992)所述，大约 10 μ g 的 VKpKh(轻链表达载体)和 20 μ g 的 VHpGlg (重链表达载体)可以用于通过电穿孔(BioRad，Richmond，CA)转染5 X IO6的SP2/0 骨髓瘤细胞，此处引用该文献作为参考。在转染之后可以让细胞于37°C和5% CO2的条件 下在96孔微量滴定板中并于完全HSFM培养基(Life Technologies公司，Grand Island, NY)中进行生长。选择程序可以在添加潮霉素终浓度为500单位/ml的潮霉素选择性培养 基(Calbiochem，San Diego, CA)之后两天开始进行。集落通常在电穿孔之后2-3个周出 现。然后可以让培养物进行扩展以用于进一步分析。对于嵌合型或人源化重链的分泌呈阳性的转染瘤克隆可以通过ELISA测定来鉴 定。简短地说就是，将来自转染瘤培养物的上清液样品(约100μ 1)分三次加入到用山羊抗 人(GAH)_IgG、F(ab' ) 2 片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove，PA)预包 裹的ELISA微量滴定板中。将平板于室温温育1小时。通过用洗涤缓冲液(含有0.05%聚 山梨酸酯20的PBS)洗涤三次来去除未结合的蛋白质。向孔中加入与GAH-IgG、Fc片段特 异性抗体(Jackson ImmunoResearch)缀合的辣根过氧化物酶(HRP)，(将100 μ 1的抗体原 料稀释IO4倍，并用未缀合的抗体补充至1. 0μ g/ml的终浓度)。在温育1小时之后，洗涤平 板，一般是三次。向孔中加入反应溶液[100 μ 1，其在PBS中含有167 μ g的邻苯二胺(OPD) (Sigma, St. Louis,MO)、0· 025%过氧化氢]。在暗处进行成色30分钟。在自动ELISA阅读 器(Bio-Tek仪器，Winooski，VT)中测量490nm的吸收之前，通过向每个孔中添加50 μ 1的 4Ν HCl溶液来终止反应。然后，相对于不相关的嵌合型抗体标准(可从Scotgen有限公司， Edinburg, Scotland获得)来测定结合的嵌合型抗体。抗体可以如下述从细胞培养物中分离出来。使转染瘤培养物适合于无血清培养 基。为了产生嵌合型抗体，让细胞在滚瓶中用HSFM以500ml培养物进行生长。将培养物离 心，并将上清液通过0.2μ的膜进行过滤。将经过滤的培养基以Iml/分钟的流速通过A蛋 白柱(IX3cm)。然后用大约10个柱体积的PBS洗涤树脂，随后用含有IOmM EDTA的0. IM 甘氨酸缓冲液(pH 3.5)从柱上洗脱下A蛋白结合的抗体。在含有10μ1的3M Tris (ρΗ 8.6)的管中收集1.0ml的组分，并由在280/260nm的吸收来测定蛋白质浓度。汇集峰组分 并逆PBS进行透析，然后例如用Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA)来浓缩抗体。如前述 用ELISA来测定抗体浓度，并用PBS将其浓度调整至大约lmg/ml。向样品中适宜地加入 0.01% (w/v)叠氮化钠作为防腐剂。序列表是用于制备抗CD20抗体的引物的核苷酸序列。通过下面的实施例而对本发明作进一步的描述，提供这些实施例只是用于举例说 明。本发明并不局限于这些实施例，而是应当包括明显来自此处提供的教导的所有变化形 式。
实施例实施例1.人源化抗⑶20抗体的构建分别使用Orlandi 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 3833(1989))所描述的引物对 VH1BACK/VH1F0R 和 VK1BACK/VK1F0R 而通过 RT-PCR 来获得抗 CD20 抗体 A20 的 Vh 和 Vk基因。对多个独立的克隆进行测序以排除由于PCR反应所产生的可能错误。将作为最 终PCR产物的克隆鼠类V1^P Vk序列分别标示为A20Vk(图1A)和A20VH(图1B)。构建出 嵌合型A20(cA20)抗体，并在Sp2/0细胞中进行表达。cA20的Vk和VH序列显示在图2中。 让cA20抗体与Raji细胞结合，并与从杂交瘤细胞培养物上清液中纯化出的放射性标记的 A20进行竞争(图3)。该结果进一步证实了所克隆的V基因的真实性。设计和构建编码人源化抗hCD20 (hA20)抗体的单个轻链和两个重链可变区序列。 人REI框架序列用于Vk (图1A)，EU与NEWM框架序列的联合用于Vh (图1B)。当与起始人抗 体框架相比较时，在CDR区域之外的每条链中有许多氨基酸改变。与人EU框架相比，hA20、 hA20VHl的重链有9个改变，而hA20VH2有3个改变(图4A)。hA20VH2是优选的，因为其比 hA20VHl含有更多的来自人抗体构架区的氨基酸。与人REI框架相比，hA20、hA20VK的轻链 有7个氨基酸改变(图4B)。实施例2. hA20抗体的构建方法每条可变链以两部分进行构建，即5’ -和3’ -半个部分，分别标示为“A”和“B”。 每半个部分通过使用Taq聚合酶对于合成的单链寡核苷酸模板与两个短侧翼引物进行PCR 扩增而产生出来。首先将扩增出的片段克隆进来自Invitrogen (Carlsbad，CA)的pCR4 TA 克隆载体中，并进行DNA测序。模板和引物对列于下面模板 引物 VkA-反向/VkA-正向 VkB-反向/VkB-正向 VHA-反向/VHlA-正向 VHlB-反向/VHB-正向 VHA-反向/VH2A-正向 VH2B-反向/VHB-正向
VKA VKB VHlA VHlB VH2A VH2B 轻链
为了构建人源化Vk序列的全长DNA，在自动RNA/DNA合成仪(Applied Biosystems)上合成寡聚体 hA20VKA (120 聚体)和 hA20VKB (130 聚体)。hA20VKA 和 B 分另Ij 代表了 hA20 Vk的核苷酸26-145和166-195 (见图5A)。将寡聚体hA20VKA和B从支持物 上切除，并通过用浓缩的氢氧化铵处理而去保护。在将样品进行真空干燥并重悬于100 μ 1 水中之后，通过经过ChormaSpin-IOO柱(Clontech，Palo Alto, CA)进行离心而去除不完 整的寡聚体(小于100聚体)。所有侧翼引物类似地进行制备，只是使用ChormaSpin-30 柱来去除合成的副产物。将1 μ 1用ChormaSpin柱纯化的hA20VKA以100 μ 1反应体积进 行 PCR 扩增，该反应体系含有 10XPCR 缓冲液[500mM KClUOOmM Tris-HCl (pH8. 3)、15mM MgCl2*0.01% (ff/v)明胶](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、250 μ M 每种 dNTP、200nM VkA-反向与VkA-正向和5个单位TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。将该反应混合 物进行30个循环的由下列步骤组成的PCR反应，即于94°C变性1分钟、于50°C退火1. 5分 钟和于72°C聚合化1. 5分钟。hA20VKB在类似的条件下用引物对VkB-反向和VkB-正向进 行PCR扩增。扩增出的VKA和VKB片段在2%琼脂糖(BioRad，Richmond，CA)上进行纯化。 在每个片段的末端设计唯一的限制位点以便能够容易地通过DNA连接而连接在一起。扩增出的VKA片段在其5’-末端含有PvuII限制位点即CAGCTG，和在3’-末端含有BstBI限制 位点即TTCGAA。扩增出的VKB片段在其5’ -末端含有BstBI限制位点，和在3’ -末端含 有BglII限制位点即AGATCT。全长Vk链的装配通过下列步骤来完成，即用合适的5’ -和 3’ -酶对于每个片段进行限制性内切酶酶切消化，然后连接入预先用PvuII和BclI (BclI 消化的末端与BglII消化的末端相匹配)消化的VKpBR2载体中。结果所得的连接产物含 有与PvuII位点相连接的A片段、与BclI位点相连接的B片段和在BstBI位点连接在一起 的A与B片段(图5A)。VKpBR2是VKpBR的经修饰的分阶段载体(Leung等人，Hybridoma 13 :469(1994))，在其中于翻译起始密码子上游14个碱基处导入了 XbaI限制位点。通过 DNA测序来确认正确的可读框，将完整的链作为XbaI-BamHI片段从VKpBR2中切除，并连接 入pdHL2表达载体中。将只含有Vk序列的载体标示为hA20VKpdHL2。pdHL2含有表达盒， 该表达盒包括在IgH增强子和MT1启动子控制之下的人IgGl C1、C2、C3和铰链区(图7A) 以及人κ链Ck(图7B)，还包括由弱SV40启动子控制的小鼠dhfr基因，其作为用于转染 子的选择和转基因的共扩增的标记(Gillies等人，J. Immunol. Methods 125:191(1989)； Losman等人，Cancer，80 :2660 (1997))。通过置换pdHL2的Vk和Vh片段可以表达出不同 的嵌合型或人源化Ab。重链为了构建hA20VHl，如上所述合成寡聚体VHlA (121聚体)和VHlB (151聚体)，它们 分别代表了核苷酸23-143和179-329 (见图5B)。类似地，对于hA20VH2，制备寡聚体VH2A 和VH2B。这些寡聚体用实施例2中所列出的它们各自的引物对来进行PCR扩增。对于Vh 的两种类型施行与对于1所施行的同样的构建方法，但具有下列修饰A片段的5’ -末端 限制位点为PstI (CTGCAG)和B片段的3，-末端限制位点为BstEII (GGTCACC)。将这些片 段连接在一起并于共同的NciI位点(CCCGG)连接入VHpBS2载体中，从而导致形成全长Vh 序列(图5B和5C)，并通过DNA测序进行确认。VHpBS2是VHpBS的经修饰的分阶段载体 (Leung等人，Hybridoma 13 :469 (1994))，在其中于翻译起始密码子上游16个碱基处导入 了 XhoI限制位点。将装配出的Vh基因作为XhoI-BamHI限制片段亚克隆进含有Vk序列的 表达载体M20V κ pdHL2中。因为pdHL2的重链区域缺乏BamHI限制位点，因此该连接需要 使用HNB连接体来在可变链的BamHI位点和存在于pdHL2载体中的HindIII位点之间提供 一个桥。将结果产生的表达载体标示为hA20-lpdHL2和hA20_2pdHL2。HNB 连接体 5，-AGCTTGCGGCCGC-3，3， -ACGCCGGCGCTAG-5，实施例3. hA20抗体的转染和表达将大约3(^8用于1^20的表达载体通过用SalI消化而线性化，并通过电穿孔 (450V和25 μ F)而转染进Sp2/0-Agl4细胞中。将经转染的细胞置于96孔平板中2天，然 后通过以0. 025 μ M的终浓度向培养基中添加MTX而用药物抗性进行选择。MTX抗性集落于 2-3周之后在孔中出现。来自在选择中存活的集落的上清液通过ELISA测定而对于人Ab分 泌进行筛选。简短地说就是，将ΙΟΟμΙ上清液加入到用GAH-IgG、F(ab' )2片段特异性Ab 预包裹的微量滴定板的孔中，并于室温温育1小时。通过用洗涤缓冲液(含有0.05%多山 梨酸酯20的PBS)洗涤三次来去除未结合的蛋白质。向孔中加入缀合HRP的GAH-IgG、Fc 片段特异性Ab。在温育1小时之后，洗涤平板。在添加含有4mM OPD和0. 04% H2O2的底物
35溶液之后，通过读取A490nm而揭示出结合的缀合HRP的Ab。让阳性细胞克隆进行扩展，并 从细胞培养物上清液中通过在A蛋白柱上进行亲和层析而纯化出hA20-l和hA20-2。实施例4.抗⑶20抗体的结合活性施行竞争性细胞结合测定以评测hA20相对于亲代cA20和抗⑶20Ab c2B8的免疫 反应性。在存在浓度变化(0. 2-700nM)的hA20_l、_2、鼠类A20、cA20、或c2B8的情况下，将 恒定数量的125I标记的鼠类A20或c2B8 (100，OOOcpm,约10 μ Ci/μ g)与Raji细胞于4°C 温育1-2小时。通过在PBS中洗涤细胞而去除未结合的Ab。在洗涤之后测定与细胞相关 的放射活性。如图6中所示，当和125I-A20或125I-c2B8与Raji细胞的结合进行竞争时，人 源化A20MAb、hA20-l和hA20_2显示出可与A20、鼠类抗CD20MAb、cA20和c2B8 (嵌合型抗 ⑶20MAb)相比较的结合活性。通过放射性标记的MAb与Raji细胞的直接结合和Scatchard制图分析，与对于 C2B8的3. 9nM的解离常数相比，测量到对于cA20和hA20的解离常数分别为2. 9和4. 2nM。 用山羊抗人IgG、Fc片段特异性抗体与这些抗体进行复合的体外交联实验显示出在cA20和 hA20以及C2B8之间的类似的Raji NHL细胞杀伤力。实施例5.患有复发性中级非Hodgkin’ s淋巴瘤的患者的治疗患有中级非Hodgkin’ s淋巴瘤的患者已经对于前面的侵袭性化疗没有反应了，该 化疗由下面的部分组成，即CH0PX6，其导致完全地缓解4个月；另一个CH0PX6过程，其导 致进一步的改善；D-M0PPX2，其导致稳定疾病3个月；和与外周干细胞移植一起的CVB，其 导致部分缓解5个月。患者在颈部淋巴结中呈现出复发性淋巴瘤，其可以通过计算机化断 层X射线照相法和触诊来测量。患者在第0、14、28和42天用450mg人源化CD20单克隆抗体A20于3小时之内进 行输注，而没有在输注期间或紧接着之后注意到严重的反作用。8个周之后，颈部淋巴结增 大的触诊显示出可测量到的大约50%的减少。在治疗之后20周所进行的继续测量没有在 颈部和其他任何地方之中显示出疾病的迹象，这一点也由身体的计算断层X射线照相法研 究进行了确认。因为在其他地方没有检测到新疾病，所以认为患者的病情得到了完全的缓 解。每10-12周进行继续的研究以确认在治疗之后至少10个月的完全缓解。实施例6.患有慢性原发性血小板减少性紫癜的患者的治疗一位患有慢性原发性血小板减少性紫癜的45岁女性已经用强的松、Y球蛋白和 高剂量的地塞米松进行了治疗，但是疾病仍在发展。她经过了脾切除术，但还是不能稳定 疾病。她的血小板跌至小于30，000/μ1，并且出血事件的频率增加了。然后患者用人源 化⑶20A20MAb进行治疗，在第一周于静脉内施用500mg，随后每隔一周一次给予250mg， 并总共进行4次注射。在最后一次给予A20之后10周，观察到血小板数量的显著增加至 150，000/μ 1，并且出血事件消失了。在最后一次抗体输注之后5个月，疾病得到了缓解。实施例7.患有进展性类风湿性关节炎的患者的治疗患有严重的指关节、腕和肘进展性类风湿性关节炎的一位70岁女性对于用氨甲 蝶呤的治疗已经没有反应了，当进行Enbrel治疗时只获得较小的缓解。然后该患者用Α20 人源化CD20 MAb进行治疗，其每个周于静脉内施用300mg，并持续4周。在3个月之后，在 疾病活动度的测量中观察到40%的改善并保持了 5个月。患者再次用A20以同样的剂量和 频率进行治疗。患者继续得到改善，并在第二次A20 MAb治疗之后6个周观察到60%的改善。在A20治疗期间或之后的任何时候没有观察到人抗A20抗体。虽然从血液中去除了正 常的B-细胞，但是没有观察到感染并发症或者其他药物相关的严重毒性。实施例8.患有重症肌无力的患者的治疗一位65岁的男性已经对于用于重症肌无力的常规疗法没有了反应，并被送进了 神经学重症治疗病室中。通过血浆交换和静脉内给予免疫球蛋白来减少抗乙酰胆碱受体抗 体的滴度而稳定了患者的病情。患者继续卧床不起，然后用A20人源化CD20 MAb进行治疗， 其每隔一周一次于静脉内施用400mg，并持续10周。在最后一次给予A20之后1周，没有能 够检测到血液B-细胞，并观察到抗乙酰胆碱抗体的滴度的显著降低。在最后一次施用A20 MAb之后4个月，患者可以活动了并出了院。实施例9.在淋巴结和骨髓中患有侵袭性非Hodgkin's B-细胞淋巴瘤的狗的治疗一只65磅重、7岁大的雄性金毛猎犬被诊断为患有扩散性大细胞侵袭性淋巴瘤。 将该狗进行使用长春新碱、环磷酰胺、强的松和阿霉素的联合化疗，其具有良好的反应。可 是，狗随后表现出这样的特征，即具有进展性淋巴结病，并在此之后7个月被发现具有骨髓 的扩展性淋巴瘤渗透，和颈部、胸部、腹部、骨盆的淋巴结病，以及肝脾大。给予该狗使用1F5嵌合型单克隆抗体的治疗。狗用120mg 1F5抗体进行静脉内输 注，并在该起始治疗之后于4周内每周重复这一治疗。在最后一次给予1F5之后4个月，患 畜的计算机化断层X射线照相法扫描没有显示出淋巴瘤的迹象，并且疾病的所有病征和症 状不明显了。实施例10.患有复发性中级非Hodgkin’ s淋巴瘤的狗的治疗一只78磅重、9岁大的患有中级非Hodgkin’ s淋巴瘤的德国牧羊犬接受化疗，其 起初导致完全缓解5个月，随后进行另一个化疗过程，其导致稳定疾病6个月。然后狗在胸 部和颈部淋巴结中表现出复发性淋巴瘤，它们可以分别通过计算机化断层X射线照相法和 触诊而进行测量。患畜在2周内每周用9°Y标记的L243 (HLA-DR)单克隆抗体的免疫缀合物进行输 注，其放射剂量为50mg抗体蛋白中有8mCi，并联合地以每次IOOmg的剂量每周输注A20人 源化CD20抗体。3周之后，颈部淋巴结增大的触诊显示出可测量的减少，而重复的胸部计算 机化断层X射线照相法扫描显示出肿瘤的明显减少。于治疗之后10周进行的继续测量显 示出在颈部或胸部中疾病减少了大约60%的证据。因为在其他地方没有检测到新疾病，所 以认为患畜的病情得到了部分的缓解。每10-12周进行继续的研究以确认在治疗之后至少 7个月的部分缓解。实施例11.患有复发性淋巴瘤的猫的治疗一只10磅重、12岁大的家养短毛猫表现出单个下颂下淋巴结的增大。在切除之 后，在6个月时病灶重新出现了。再次切除病灶，但是随后在6个月之后其又出现了。然后 在4周内每周用131I标记的抗CD20B1单克隆抗体的免疫缀合物治疗猫，其放射剂量为45mg 抗体蛋白中有15mCi。在3个月之后重复进行治疗。当在最后一次治疗之后3个月进行检 查时，可以触摸到明显的减小。在1年的时间内没有观察到疾病的复发。实施例12.在培养的或者异种移植入SCID小鼠的人NHL细胞中评测嵌合型和人 源化抗CD20 MAb。嵌合型(cA20)和人源化(hA20)CD20抗体的特性在NHL细胞系中进行评测。结果证实cA20和hA20与rituximab类似地起作用，其沾染了多于99%的Raji、Ramos、RL、 Daudi和Su-DHL-6细胞，和与大约5%的淋巴细胞(所希望的B-细胞百分数)进行反应。 在所有的B-细胞系中，用MAb看到了特异的生长抑制，但是抑制水平在细胞系之间变化， Su-DHL是最敏感的。在不存在交联的情况下，鼠类抗CD20、cA20、hA20和rituximab都产 生77-90%的抑制。在有交联的情况下，增殖的抑制在94-98%的范围内变化。在存在有交 联了第二种单克隆抗体的情况下，rituXimab、CA20和hA20在它们于Raji细胞中诱导凋亡 的能力上也是类似的。此外，在第0天，SCID小鼠用2. 5X IO6的Raji细胞进行静脉内注射。在第1天， 开始注射鼠类、嵌合型和人源化抗CD20抗体以及cA20F(ab' )2片段，其数量为每次注射 100#g完整抗体或者每次注射67#gF (ab' ) 2片段，并在2周内每周注射5次，然后在3周 内每周注射2次。在一项研究中，对照小鼠以肿瘤接种之后15天这一中间存活时间死于播 散性疾病，但是中间存活时间对于用cA20处理的小鼠延长至38天、对于用hA20处理的小 鼠延长至22. 5天和对于用鼠类抗⑶20处理的小鼠延长至21天(所有这些数据通过对数 分级分析是统计学显著的(P < 0. 005))。在另一项研究中，对照小鼠以肿瘤接种之后16. 5 天这一中间存活时间死于表现为CNS麻痹的播散性疾病，但是中间存活时间对于用cA20 处理的小鼠延长至105天、对于用hA20处理的小鼠延长至70天和对于用rituximab处理 的小鼠延长至98天(所有这些数据通过对数分级分析是统计学显著的(ρ < 0. 0001)，图 11)。实施例13.竞争性细胞表面结合测定人源化抗CD20 Ab(cA20、hA20和clF5，通过A蛋白柱上的亲和层析而纯化)的Ag 结合特异性和亲和性研究通过与鼠类2B8和rituximab (IDEC制药公司，San Diego, CA)的 细胞表面竞争性结合测定来进行评测。简短地说就是，在存在浓度变化(0.2-700nM)的竞 争Ab (cA20、hA20、m2B8、clF5或rituximab)的情况下，将恒定数量(100，000c pm，约 IOiCi/ ig)的125I标记的(A)m2B8或(B)rituximab与Raji细胞于4°C温育1-2小时。通过用PBS 洗涤细胞而去除未结合的Ab。在洗涤之后测定与细胞相关的放射活性。图8(A)为cA20(正 方形)、hA20-2(三角形)和hA20-l(圆形)与m2B8(菱形)的结合活性的比较；图8 (B)比 较了 cA20 (正方形)、clF5 (三角形)和rituximab (菱形)的结合活性。在另一项研究中，通过细胞表面竞争性结合测定比较了 hA20与其他的抗⑶20Ab、 rituximab和鼠类Bl的结合活性。简短地说就是，在存在浓度变化(0. 2_700ηΜ)的竞 争Ab即hA20(三角形)、mBl (倒三角形)或rituximab (正方形)的情况下，将恒定数量 (100，OOOcpm, ^ 10iCi/ig)的 125I 标记的 rituximab 与 Raji 细胞于 4°C温育 1-2 小时。通 过用PBS洗涤细胞而去除未结合的Ab。在洗涤之后测定与细胞相关的放射活性。计算出对 于这三个抗体的IC5tl值分别为6. 8、34和5。实施例14.交联的hA20和其他⑶20 Ab对于 培养的淋巴瘤细胞的细胞毒性效应在存在交联剂(抗人IgG、Fc片段特异性抗体)的情况下，用多种⑶20 Ab处理 Raji细胞以复合CD20抗体(图10)。在使用20i g/ml交联剂(红色)、不使用交联剂(橙色) 或者使用抗小鼠IgG、Fc片段特异性抗体(蓝色)的情况下，将终浓度为5ig/ml的hA20、 cA20、rituximab或阳性对照Ab hLLl与Raji细胞温育48小时。通过(A)锥虫蓝染色和 细胞计数或者(B)MTT测定来测量总细胞和存活细胞群体。数据显示出hA20和rituximab
38对于Raji NHL细胞的存活具有相似的效应，并且该细胞毒性取决于抗体的特异性交联。实施例15.使用hA20和hLL2的体内疗法将Raji细胞通过静脉注射而施用于SCID小鼠，其数量为2. 5 X IO6细胞/100 μ 1/ 小鼠(图12)。在第1-11天通过腹腔注射而施用MAb，随后每周注射两次MAb并持续大约 3周。每周测量动物的体重，直至研究结束。每天检查动物后腿的麻痹。当麻痹出现时，处 死动物并进行尸体剖检以便肉眼检查播散性肿瘤结节(特别是在肺、肾和卵巢中)。用对照 人源化IgGl Ab即hMN-14 (抗CEA抗体)处理的对照小鼠死于表现为CNS麻痹的播散性疾 病。中间存活时间为肿瘤静脉注射接种之后13天。在用hA20处理的组中的中间存活时间 延长至大约25天。该值表示了大约2倍于hA20的中间存活时间的增加。虽然单独用hLL2 处理的组显示出与对照小鼠相比同样的中间存活时间，但是联合hA20和hLL2进行治疗可 将小鼠的中间存活时间增加至大约30天。
hA20VKA
5' -CATCTCTGAG CGCATCTGTT GGAGATAGGG TCACTATGAC TTGTAGGGCC AGCTCAAGTG TAAGTTACAT CCACTGGTTC CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC ACCTAAACCC TGGATTTATG-3‘ hA20VKB
5， -GGTGTCCCTG TCCGATTCTC TGGCAGCGGA TCTGGGACAGATTACACTTT CACCATCAGC TCTCTTCAAC CAGAAGACAT
TGCAACATATTATTGTCAGC AGTGGACTAG TAACCCACCC
ACGTTCGGTG-3，
hA20VKA-反向
5' -CAGCTGACCC AGTCTCCATC ATCTCTGAGC GCATCTGTTG-3， hA20VKA-正向
5' -AGGTTCGAAG TGGCATAAAT CCAGGGTTTA GGTGCT-3' hA20VKB-反向
5' -CACTTCGAAC CTGGCTTCTG GTGTCCCTGT CCGATTCTC-3’ hA20VKB-正向
5' -ACGTTAGATC TCCAGCTTGG TCCCTCCACC GAACGTGGGT GGGTTA-3， hA20VHA
5' -CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCGGTGA AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGCTACACCT TTACTAGTTA CAATATGCAC TGGGTCAAGC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATTG G-3' hA20VHB
5' -ATCAGAAGTT CAAGGGTAAA GCCACACTGA CTGCCGACGA ATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGG TCTGAGGACA CGGCATTTTA TTACTGTGCA AGATCGACTT ACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCT G-3' hA20VHA-反向
5' -CAGCTGCAGC AATCAGGGGC TGAAGTCAAG AAACCTGGG-3'
39hA20VHA-正向
5’ -TTCCGGGATA AATAGCTCCA ATCCATTCCA GACCCTG-3’ hA20VHB-反向
5’ -ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAA GGGTAAAGCC A-3’ hA20VHB-正向
5’ -GGAGACGGTG ACCGTGGTGC CTTGGCCCCA GACATCGAAG TACCAG-3，
hA20VH2A
5， -CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCAGTGA AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGCTACACCT TTAGTAGTTA CAATATGCAC TGGGTCAGAC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATGG G-3' hA20VH2B
5’ -ATCAGAAGTT CAAGGGTAGA GCCACAATAA CTGCCGACGA ATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGG TCTGAGGACA CGGCATTTTA TTTTTGTGCA AGATCGACTT ACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCT G-3' hA20VH2A-正向
5’ -TTCCGGGATA AATAGCTCCC ATCCATTCCA GACCCTG-3' hA20VH2B-反向
5’ -ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAA GGGTAGAGCC A-3'
40
权利要求
一种与CD20结合的嵌合、人源化或人单克隆抗体或者它们的抗原结合片段，所述抗体包含由选自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的序列组成的轻链可变区CDR1；由ATSNLAS序列组成的轻链可变区CDR2；和由选自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的序列组成的轻链可变区CDR3；以及所述抗体包含由SYNMH序列组成的重链可变区CDR1；由序列AIYPGNGDTSYNQKFKG组成的重链可变区CDR2，以及由选自STYYGGDWYFDV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的序列组成的重链可变区CDR3。
2.权利要求1的抗体或其片段，其与治疗试剂缀合。
3.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂是放射性同位素。
4.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂是细胞毒性试剂。
5.权利要求4的抗体或其片段，其中所述细胞毒性试剂为药物。
6.权利要求4的抗体或其片段，其中所述细胞毒性试剂为毒素。
7.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为免疫调节剂。
8.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为细胞因子。
9.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为干扰素。
10.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为干细胞生长因子。
11.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为红细胞生成素。
12.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为淋巴毒素。
13.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为干细胞生长因子。
14.权利要求2的抗体或其片段，其中所述治疗试剂为集落刺激因子。
15.权利要求2-14任一项的抗体或其片段，其中所述重链可变区⑶R3由 STYYG⑶WYFDV序列组成。
16.权利要求2-14任一项的抗体或其片段，其中所述重链可变区⑶R3由 VVYYSNSYWYFDV 序列组成。
17.权利要求2-14任一项的抗体或其片段，其包含含hA20Vk和hA20VHl的与⑶20结 合的人源化抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求2-14任一项的抗体或其片段，其包含含hA20Vk和hA20VH2的与⑶20结 合的人源化抗体或其抗原结合片段。
19.一种包含至少两种单克隆抗体或者抗体片段的抗体融合蛋白，其中至少一种所述 抗体或片段为权利要求1的抗体或片段。
20.权利要求19的抗体融合蛋白，其包含至少一种靶向CD20以外的抗原的单克隆抗体 或片段。
21.权利要求19的抗体融合蛋白，其包含至少一种靶向CD22的单克隆抗体或片段。
22.权利要求1-21任一项要求保护的抗体或片段或融合蛋白在制备用于治疗患者B细 胞淋巴瘤或白血病的药物中的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述药物通过肠胃外途径给予。
24.权利要求22的用途，其中所述药物通过静脉内途径给予。
25.权利要求22的用途，其中所述药物通过皮下途径给予。
26.权利要求22-25任一项的用途，其中所述药物的给药剂量是约l-20mg/kg。
27.权利要求22-25任一项的用途，其中所述药物的给药剂量是约lmg/kg。
28.权利要求22-27任一项的用途，其中所述药物每周给予一次。
29.权利要求22-27任一项的用途，其中给予所述药物4-8齐U。
30.权利要求22-27任一项的用途，其中所述药物隔周给予一次。
31.权利要求22-27任一项的用途，其中所述药物间隔1-2周给予一次，并且总共重复 至少3个剂量。
32.权利要求22-27任一项的用途，其中间隔1-2周给予一剂所述剂量，并且持续2_3 个月。
33.权利要求22-27任一项的用途，其中剂量之间的间隔至少两个星期。
34.权利要求22-27任一项的用途，其中给予所述剂量的时间最长是3个月。
35.权利要求22-34任一项的用途，其中所述抗体或片段或融合蛋白包含hA20Vk和 hA20VHl。
36.权利要求22-34任一项的用途，其中所述抗体或片段或融合蛋白包含hA20Vk和 hA20VH2o
37.权利要求1-21任一项要求保护的抗体或片段或融合蛋白在制备用于治疗患者 B-细胞介导的自身免疫疾病的药物中的用途。
38.权利要求37的用途，其中所述药物通过肠胃外途径给予。
39.权利要求37的用途，其中所述药物通过静脉内途径给予。
40.权利要求37的用途，其中所述药物通过皮下途径给予。
41.权利要求37-40任一项的用途，包括所述药物的给药剂量约l-20mg/kg。
42.权利要求37-40任一项的用途，其中所述药物的给予剂量约lmg/kg。
43.权利要求37-42任一项的用途，其中所述药物每周给予一次。
44.权利要求37-42任一项的用途，其中给予所述药物4-8剂。
45.权利要求37-42任一项的用途，其中所述药物隔周给予一次。
46.权利要求37-42任一项的用途，其中所述药物间隔1-2周给予一剂，并且总共重复 至少3剂。
47.权利要求37-42任一项的用途，其中间隔1-2周给予一剂并且持续疗程2_3个月。
48.权利要求37-42任一项的用途，其中剂量之间的间隔至少两个星期。
49.权利要求37-42任一项的用途，其中给予所述剂量的时间最长为3个月。
全文摘要
本发明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗体以及CD20抗体融合蛋白，它们与被称为CD20的B-细胞标记结合，该B-细胞标记可用于B-细胞紊乱如B-细胞恶性肿瘤和自身免疫病的治疗和诊断，并且提供了治疗和诊断的方法。
文档编号C12N15/13GK101914158SQ20091015055
公开日2010年12月15日 申请日期2003年2月14日 优先权日2002年2月14日
发明者D·M·戈登伯格, H·汉森, Z·屈 申请人:免疫医疗公司