专利名称：一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法
技术领域：
本发明涉及一种菌种的遗传改造方法，特别是涉及一种应用于医药、食品及饲料 领域的谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法。
背景技术：
目前，谷胱甘肽(GSH)的生产方法主要有萃取法、化学合成法、固定化细胞法和发 酵法，其中，固定化细胞法又称为酶法。采用萃取法生产GSH，是使用植物种子胚芽或酵母作为原料，水、有机溶液或稀醇 作为溶剂萃取得到GSH，采用萃取法生的GSH纯度和收率都不高，若在药品或试剂中应用萃 取法制得的GSH，还需要在萃取法中组合离子交换等色层分离步骤进一步纯化，生产工艺落 后、生产规模小、产量低且质量不高。采用化学合成法生产GSH的生产工艺已经较为成熟，但是成本高、反应步骤多、反 应时间长、操作复杂、需要光学拆分，并且，化学合成法还存在环境污染等问题。采用固定化细胞法，或称酶法生产GSH，具有生产过程简化、生产效率高等优点，由 于从前体氨基酸生物合成GSH的二步反应都需要消耗ATP，因此，需要在反应过程中实现 ATP循环再生，而要在反应过程中实现ATP循环再生，方法较为复杂。采用发酵法生产GSH，是选育或构建GSH合成能力强且胞内谷胱肝肽含量高的微 生物，利用筛选和优化的培养基配方，建立和优化发酵控制策略，改进和提高下游过程技术 等方法，最终提高GSH的产率和质量的方法，发酵法是目前GSH的主要生产方法，所选用的 微生物一般是酵母，多为酿酒酵母和假丝酵母中的某些种，经诱变筛选得到乙硫氨酸、Zn2+ 等物质的抗性株。目前，还有采用基因工程的方法获得高产还原型GSH菌株的方法，该方法是以甘 油和氨水，以及前体半胱氨酸为主要原料，在7. 5L发酵罐规模，70小时内发酵产量可达 5. Og/L发酵液，半胱氨酸转化为GSH的摩尔转化率达45%以上。但是，由于GSH的市场空缺较大，应用上述方法生产的GSH远不能满足市场需求。
发明内容
本发明旨在提供一种以毕赤酵母Pichia pastoris为改造对象的GSH高产菌种的 遗传改造方法。本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的技术方案如下本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的步骤如下第一步从酿酒酵母S. cerevisiae INVScl基因组模板中，扩增目的基因GSH1、 GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA_GSHl和pGAPZA_GSH2 ；第二步以所述的重组质粒pGAPZA-GSHl和pGAPZA_GSH2为模板，采用DNA改 组技术“体外快速进化” Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，得到质粒 pGAPZA-GSHIM 和质粒 pGAPZA_GSH2M ；
第三步以所述的质粒pGAPZA-GSHIM和质粒pGAPZA_GSH2M构建质粒 PGAPZA-GSH1M-GSH2M和重组甲醇酵母；第四步应用重组酵母发酵实验测定GSH的摩尔转化率。本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的有益效果在于(1)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法选用的毕赤酵母Pichia pastoris本身具有很好的安全性，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；发酵方法简便， 发酵原料易得，节省能源，产量大，成本低。(2)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法选用的启动子GAP不需甲醇诱导，发酵工艺简单，其产量很高。(3)本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法在菌种基因改造过程中，减少 了前体物的使用，从而降低生产成本。
具体实施例方式本发明一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法的具体步骤如下第一步从酿酒酵母S. cerevisiae INVScl基因组模板中，扩增目的基因GSH1、 GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA_GSHl和pGAPZA_GSH2 1.扩增目的基因GSH1IfIS. :S. cerevisiae INVScl引物GSHl 上游引物 gshl-1 :GAAGCTCGAGACCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCC (加了 Kozak 序列)(XhoI)GSHl 下游引物 gshl-2 :TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG(ApaI)PCR 扩增反应:DNA 模板 1μ 1，10XPCR 缓冲液 2μ 1，引物 2μ 1，dNTP 5 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，总反应体积为 20 μ 1，941变性51^11，941 45s, 58°C 90s, 72°C 120s, 35 个循环。扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。片段大小2405bp。2.扩增目的基因GSH2IfIS. :S. cerevisiae INVScl引物GSH2 上游引物 gsh2-l CCTACTCGAGACCATGGCACACTATCCACCTTCCAAGG(加了 Kozak 序列)(XhoI)GSH2 下游引物 gsh2-2 :GTACATGGGCCCTTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAAC(ApaI)PCR 扩增反应:DNA 模板 1μ 1，10XPCR 缓冲液 2μ 1，引物 2μ 1，dNTP 5 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，总反应体积为 20 μ 1，941变性51^11，941 45s, 58°C 90s, 72°C 120s, 35 个循环。扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。片段大小1476bp。3.将 GSHl 和 GSH2 装入 pGAPZA 载体分别用XhoI和ApaI I双酶切上述PCR扩增产物和pGAPZA载体，然后在T4连接酶 下 16°C连接过夜。pGAPZA，得到重组质粒 pGAPZA-GSHl 和 pGAPZA_GSH2，转化 Ε. coliJM109, 提取重组质粒进行酶切验证。第二步以所述的重组质粒pGAPZA-GSHl和pGAPZA_GSH2为模板，采用DNA改组技术“体外快速进化” Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，得到质粒 pGAPZA-GSHIM 和质粒 pGAPZA_GSH2M 采用错误倾向PCR (Error-prone PCR)。模板质粒pGAPZA-GSHl 禾Π pGAPZA_GSH2。按照 Gene Morph II Random MytagenesisKit(Stratagene Co.)试剂盒说明。采用多种反应条件及不同条件的组合 (1)增加MgCl2。分别试用了几种MgCl2浓度2. 5,5. 0,7. 5mmol/L ； (3)分别试用了两组增高 的dNTP浓度(至lmmol/L) :dTTP和dCTP为一组，dATP和dGTP为另一组；(3)在常规PCR 的基础上，加入dITP，同时将dATP或dGTP降至常规量的1/10，即0. 02mmol/L。PCR产物采 用噬菌体表面展示技术筛选。酶活测定取5mL培养液于12000r/min离心15min，弃上清。用0. 05mol/L pH 7. 0 的磷酸缓冲液洗涤菌体.将菌体再用上述缓冲液5mL悬浮后超声波90kHz破碎lOmin，加 入GSH前体反应物质(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为40mmoL/L，MgCl2, ATP 50mmol/ L，37°C反应30min。获得的高产进化酶基因测序。命名为质粒pGAPZA-GSHIM和质粒 PGAPZA-GSH2M。用ALLOXAN试剂衍生化法测定酶活及GSH含量。第三步以所述的质粒pGAPZA-GSHIM和质粒pGAPZA_GSH2M构建质粒 PGAPZA-GSH1M-GSH2M和重组甲醇酵母 将质粒pGAPZA-GSH2M用BglII和BamHl酶切回收带有GSH2基因片段GAPG2。 将pGAPZA-GSHIM用BglII酶切用碱性磷酸脂酶处理最终得到DNA片段GAPG1。反复用 BamHABgI II制造多拷贝，使GSHl GSH2 = 1 3。用T4连接酶连接GAPGl和GAPG2得 到质粒PGAPZA-GSH1M-GSH2M。经AvrII线性化后pGAPZA-GSHlM_GSH2M电击转化酵母细胞 到GSl 15菌株中，在YPDS+Zeocin平板上挑选阳性转化子，并对阳性转化重组菌进行摇瓶培 养，筛选用阳性转化子。提取酵母基因组DNA为模板，扩增包括部分启动子pGAP、GSHlM、GSH2M基因以及部 分终止子AOXl序列验证阳性克隆。第四步应用重组酵母发酵实验测定GSH的摩尔转化率以YEPD为基础培养基进行初步发酵试验，测定重组酵母GSH含量。生物量的测定取一定体积发酵液3500r/min离心5min，水洗两次，收集菌体，85°C烘干至恒重，称量。胞内GSH含量分析GSH为胞内产物，采用冻溶一高温水煮的方法 进行细胞破碎，离心得上清液。利用ALLOXAN试剂衍生化法测定胞内GSH的含量。结果在10L发酵罐规模，70小时内发酵产量可达5. 5g/L发酵液，半胱氨酸转化 为GSH的摩尔转化率达50%以上。
权利要求
一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于步骤如下第一步从酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1基因组模板中，扩增目的基因GSH1、GSH2，然后分别装入pGAPZA中，得到重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2；第二步以所述的重组质粒pGAPZA-GSH1和pGAPZA-GSH2为模板，采用DNA改组技术“体外快速进化”γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，得到质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M；第三步以所述的质粒pGAPZA-GSH1M和质粒pGAPZA-GSH2M构建质粒pGAPZA-GSH1M-GSH2M和重组甲醇酵母；第四步应用重组酵母发酵实验测定GSH的摩尔转化率。
2.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于第一 步是按照如下方法实现的(1)扩增目的基因=GSHl 模板:S. cerevisiae INVScl 引物GSHl 上游引物 gshl-1 :GAAGCTCGAGACCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCC GSHl 下游引物 gshl-2 :TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG PCR 扩增反应DNA 模板 1 μ 1，，10 XPCR 缓冲液 2 μ 1，引物 2 μ 1，dNTP 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，总反应体积为 20μ 1，94°C变性 5min，94°C 45s, 58°C 90s, 72°C 120s，35 个 循环。扩增产物通过1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小2405bp ；(2)扩增目的基因:GSH2 模板:S. cerevisiae INVScl 引物GSH2 上游引物 gsh2-l :CCTACTCGAGACCATGGCACACTATCCACCTTCCAAGG GSH2 下游引物 gsh2-2 :GTACATGGGCCCTTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAAC PCR 扩增反应=DNA 模板 1 μ 1,10XPCR 缓冲液 2 μ 1，引物 2 μ 1，dNTP 5 μ 1，Taq DNA 聚 合酶 0. 5 μ 1，总反应体积为 20μ 1，94°C变性 5min，94°C 45s, 58°C 90s, 72°C 120s，35 个循 环，扩增产物通过1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小1476bp ；(3)将GSHl和GSH2装入pGAPZA载体分别用XhoI和ApaII双酶切上述PCR扩增产物和pGAPZA载体，然后在T4连接酶下 16°C连接过夜，pGAPZA，得到重组质粒 pGAPZA-GSHl 和 pGAPZA_GSH2，转化 E. coliJM109，提 取重组质粒进行酶切验证。
3.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于第二 步是按照如下方法实现的采用错误倾向PCR ；模板质粒 pGAPZA-GSHl 和 pGAPZA_GSH2，按照 Stratagene Co.的 Gene Morph IIRandom Mutagenesis Kit试剂盒说明，采用多种反应条件及不同条件的组合(1)增加 MgCl2，分别试用了几种MgCl2浓度2. 5,5. 0,7. 5mmol/L ； (3)分别试用了两组增高的dNTP 浓度(至Immo 1/L) :dTTP和dCTP为一组，dATP和dGTP为另一组；(3)在常规PCR的基础 上，加入dITP，同时将dATP或dGTP降至常规量的1/10，即0. 02mmol/L, PCR产物采用噬菌体表面展示技术筛选；酶活测定取5mL培养液于12000r/min离心15min，弃上清，用0. 05mol/L pH 7. 0的磷 酸缓冲液洗涤菌体.将菌体再用上述缓冲液5mL悬浮后超声波90kHz破碎lOmin，加入GSH 前体反应物质，谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为40mmoL/L，MgCl2、ATP 50mmol/L，37°C反 应30min，获得的高产进化酶基因测序，命名为质粒pGAPZA-GSHIM和质粒pGAPZA_GSH2M， 用ALLOXAN试剂衍生化法测定酶活及GSH含量。
4.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于第三 步是按照如下方法实现的将质粒PGAPZA-GSH2M用BglII和BamHl酶切回收带有GSH2基因片段GAPG2，将 pGAPZA-GSHIM用BglII酶切用碱性磷酸脂酶处理最终得到DNA片段GAPG1，反复用BamHI\ BgI II制造多拷贝，使GSHl GSH2 = 1 3，用T4连接酶连接GAPGl和GAPG2得到质粒 PGAPZA-GSH1M-GSH2M,经 AvrII 线性化后 pGAPZA-GSHlM_GSH2M 电击转化酵母细胞到 GSl 15 菌株中，在YPDS+Zeocin平板上挑选阳性转化子，并对阳性转化重组菌进行摇瓶培养，筛选 用阳性转化子；提取酵母基因组DNA为模板，扩增包括部分启动子pGAP、GSHlM、GSH2M基因以及部分终 止子AOXl序列验证阳性克隆。
5.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法，其特征在于第四 步是按照如下方法实现的以YEPD为基础培养基进行初步发酵试验，测定重组酵母GSH含量；生物量的测定取一定体积发酵液3500r/min离心5min，水洗两次，收集菌体，85°C烘 干至恒重，称量，胞内GSH含量分析GSH为胞内产物，采用冻溶一高温水煮的方法进行细胞 破碎，离心得上清液，利用ALLOXAN试剂衍生化法测定胞内GSH的含量。
全文摘要
本发明公开了一种以毕赤酵母Pichia pastoris为改造对象的谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法。所述的谷胱甘肽高产菌种的遗传改造方法包括四个步骤，所述的毕赤酵母Pichia pastoris本身具有很好的安全性，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；发酵方法简便，发酵原料易得，节省能源，产量大，成本低；所述的方法选用的启动子GAP不需甲醇诱导，发酵工艺简单，其产量很高；所述的方法在菌种基因改造过程中，减少了前体物的使用，从而降低生产成本。
文档编号C12R1/84GK101824432SQ20091017677
公开日2010年9月8日 申请日期2009年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者潘宏涛 申请人:杭州康源饲料科技有限公司