专利名称：一种利用内酯酶制备光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及内酯水解酶用于生产光学纯2-羟基-4-苯基丁酸 的方法。
背景技术：
小分子羟基酸，例如乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和葡萄糖酸等，在其分子结构中 含有羟基以及羧基这两种功能基团，是化学合成中非常有用的中间体，是一类非常重要的 有机酸，在生物体内具有特殊生理功能，而在食品/饲料工业上又是一类非常有用的功能 添加齐U。一些非天然的羟基酸，特别是具有光学活性的手性羟基酸，还可以作为"结构砌块" 用于许多天然产物和药物的化学合成。 2-羟基-4-苯基丁酸作为a -羟基酸家族的重要一员，是合成众多"普利"类血管 紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)的关键手性中间体。这些酶抑制剂切断肾素-血管紧张素-醛 固酮系统，阻断血管紧张素II的产生而扩张血管、降低血压，是一类安全有效的降压药。作 为合成切块之一，手性羟基-4-苯基丁酸及其乙酯可与不同的氨基部分形成共价键，合成 如依拉普利、赖诺普利等药物。由于手性2-羟基-4-苯基丁酸及其乙酯在该类药物合成中 的重要价值以及原有的专利保护即将过期，吸引了许多研究人员的研究兴趣，并有多种制 备方法被报道。 目前，光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的合成主要有3条路线(1)"经典拆分"，即与 手性胺形成盐，利用化学拆分法将相应的某一对映体酸优先成盐并从溶液中结晶出来而达 到分离的目的(J. Chem. Soc. ， Perkin Trans. 1， 1986， 1011) 。 (2)不对称合成。如分别以 D-苹果酸衍生物或L-丝氨酸为起始原料进行不对称合成。a -乙酰-D-苹果酸酸酐与苯 发生Friedel-Crafts反应，得到(R) _ a -乙酰氧基_4_氧代_4_苯基丁酸，经Pd/C还原即 得2-羟基-4-苯基丁酸，ee值100% (Tetrahedron :Asymmetry， 2001， 12， 1583)。但是该方 法需用昂贵的D-苹果酸作为原料，且需要使用到较毒的苯，因而没有实用价值。利用L-丝 氨酸在溴化钾存在下，经亚硝酸钠重氮化得相应的构型保持的溴代酸，然后在氢氧化钠的 作用下脱去溴化氢即得一个R构型的环氧丙酸，再进一步与有机金属试剂在低温下开环而 得2-羟基-4-苯基丁酸。但是，该方法要求在无水和低温下进行，反应条件较苛刻。(3)不 对称催化包括不对称水解和不对称还原。利用不对称催化氢化，可以由2-羰基-4-苯基 丁酸乙酯经立体选择性的均相或非均相催化氢化制得。其中非均相催化氢化以铂作为催化 剂，三氧化二铝作为载体，用10， 11- 二氢辛可尼定和甲基醚化的10， 11- 二氢辛可尼定等作 为修饰剂。利用微生物整细胞或者微生物产生的还原酶不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸 (及其乙酯)或者利用水解酶催化水解2-羟基-4-苯基丁酸消旋酯的对映选择性水解拆分 也是一种已知的方法(Adv. Syn. Catal. 2008， 350， 426)，但是一般需要使用大量的微生物细 胞或酶，而且它们的效率都不高。如微生物还原反应，底物/催化剂之比一般在较低的水平 (1/25 1/100g/g湿细胞)。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是建立一种利用内酯水解酶同时生产光学纯2-羟
基-4-苯基丁酸两种对映异构体的新方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。 本发明所用的重组内酯水解酶来源于Fusarium proliferatum ECU2002(保藏号
为CGMCC 1494)，是发明人从微生物体内克隆出该酶基因，连接到表达载体pET-28a(+)上
并将其表达到大肠杆菌JM109 (DE3)和BL21 (DE3)中。该酶的基因序列已登陆在GenBank
上(EU596535)，并在已经公开的专利申请(PCT/CN2007/070598)中有详细的说明。 本发明的重组内酯水解酶可以用于生产光学纯的2-羟基-4-苯基-丁酸及其衍
生物，重组内酯水解酶的生产方法包括如下的步骤 (1)重组大肠杆菌的培养 将表达Fusarium proliferatum内酯水解酶基因的重组大肠杆菌采用本领域常规 的方法，在LB培养基中进行扩增培养24 36h，温度20 50°C ; 再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1 10% (v/v)，接种 至50ml的发酵培养基中，在20 50。C下100 160rpm摇床上培养24 48h，离心得到静 息细胞； 再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1 10% (v/v)，接种
至5L的发酵罐中，在20 50。C下100 160rpm转速下培养12 48h ;在10 40。C下加入诱导剂IPTG，在100 160rpm转速下表达12 48h，离心收
集细胞并用生理盐水洗3次； 所说的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下3g/L， tryptone 10g/L，NaCl 5g/L，K2HP04 5g/L， pH 7.0。 [OOM] (2)底物的生物转化 将收获的静息细胞，悬浮于pH为6. 0 8. 0的磷酸缓冲溶液中，静息细胞的含量 为10 100g(湿重)/L;加入4-苯基-2-羟基-4-丁内酯，最终浓度为10 200mM，在 25 4(TC和100 160rpm的恒温摇床上振荡反应30min 24h，然后从反应液中收集产物 (2S)-4-苯基-2-羟基-4- 丁内酯和(2R)-4-苯基-2 ，4- 二羟基丁酸。
将上述所得产物分别用冰醋酸溶解后，在常温常压Pd/C催化下氢化得到目标化 合物。所述的光学纯的(2S)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯、光学纯的(2R)-4-苯基-2-羟 基-4-丁内酯或光学纯的(2R)-4-苯基-2，4-二羟基丁酸与Pd/C的重量比为1 : 0.01 0.05。获得的化合物可以在有机溶剂中重结晶获得精制品，如1，2-二氯乙烷有机溶剂。
由上述公开的技术方案可见，采用本发明所述的生产光学纯2-羟基-4-苯基_ 丁 酸及其乙醇酯的方法，不仅具有较好的催化效果，能够同时合成光学纯(对映体过量值ee > 98% )的2-羟基-4-苯基-丁酸的两种对映异构体，而且生物催化剂的用量非常少，底 物/催化剂的比率高达8. 8/1 (g/g干细胞)，反应条件温和、底物适应性广，具有很好的工业 应用开发前景。
具体实施例方式
下面将就部分实施例给出详细的反应条件、纯化方法、物理常数和结构确认所需 的分析数据，需要指出的是本发明并不仅仅局限在下述实施例的范围内。
实施例1生物催化剂的制备 配制LB培养基，成分如下yeast extract 5g/l，tryptone 10g/l， NaCl 10g/l。 另配制MLB培养基，组成如下葡萄糖3g/L， tryptone 10g/L， NaCl 5g/L， K2HP04 5g/L， pH 7.0。接种重组大肠杆菌JM109(DE3)或BL21(DE3)到3ml LB培养基中，以卡那霉素作为 抗生素，在37°C， 160rpm/min条件下进行富集培养12h ;富集培养之后再作为种子液接种到 50ml LB培养基中，加入卡那霉素作为抗生素在37。C，160rpm/min条件下进行富集培养4h ; 富集培养之后再作为种子液接种到3L MLB培养基中，在37°C， 160rpm/min下进行发酵生长 8 12h，维持pH 7. 0不变。降低发酵液的温度到15°C ，加入IPTG进行诱导表达12 24h。 最后离心收集菌体并用生理盐水洗3遍。该湿细胞可作为催化剂直接用于水解反应。
细胞酶的活力单位定义为在30°C 、pH7. 0的条件下，每分钟催化水解1. 0 ii mol消 旋泛解酸内酯(标准底物)所需要的细胞量。 实施例2利用静息细胞催化制备(2S) -4-苯基-2-羟基_4_ 丁内酯 将离心得到的重组大肠杆菌静息细胞lg悬浮于100ml自来水中，加入乙腈(20%，
v/v)和底物4-苯基-2-羟基-4- 丁内酯，使底物终浓度为lOOmM，用自动电位滴定仪控制
反应液pH 6.4，在3(TC搅拌反应lh后，将反应液以12，000Xg离心lOmin，除去细胞。在
上清液中加入NaCl至饱和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重复三次。离心得到的细胞用20ml
乙酸乙酯浸泡，重复两次，将这两部分乙酸乙酯合并，然后用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次
50ml。得到的乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到产物粗
品，为两种非对映异构体的混合物的形式，但其光学纯度都在99%以上。 实施例3利用静息细胞制备(2R)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯 将离心得到的重组大肠杆菌静息细胞lg悬浮于100ml自来水中，加入乙腈(20%，
v/v)和底物4-苯基-2-羟基-4-丁内酯，使其终浓度为100mM，用自动电位滴定仪控制溶液
p朋.4，在3(TC和160rpm的恒温摇床上振荡反应到转化率达30%，将反应液以12， OOOXg
离心10min，除去细胞。在上清液中加入NaCl至饱和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重复八次以
彻底除去不需要的2S构型的内酯。得到的水相用盐酸调pH到1. 0 2. O，在6(TC条件下
加热lh，再用乙酸乙酯萃取，重复三次，得到的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除
去乙酸乙酯，得到产物粗品，为两种非对映异构体的混合物的形式，但其光学纯度都达93%以上。 实施例4利用静息细胞制备(2R) -4-苯基_2， 4_ 二羟基-丁酸
将离心得到的重组大肠杆菌静息细胞lg悬浮于100ml自来水中，加入乙腈(20%， v/v)和底物4-苯基-2-羟基-4-丁内酯，使其终浓度为100mM，用自动电位滴定仪控制溶液 p朋.4，在3(TC和160rpm的恒温摇床上振荡反应到转化率达30%，将反应液以12， OOOXg 离心10min，除去细胞。在上清液中加入NaCl至饱和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重复八次以 彻底除去不需要的2S构型的内酯。得到的水相用盐酸调pH到1. 0 2. O，直接用乙酸乙酯 萃取，重复八次，得到的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到产物
粗品o 实施例5利用静息细胞制备(2S)-羟基-4-苯基丁酸 将实施例2中得到的产物粗品用冰醋酸溶解后，加入5%的Pd/C，在常温常压下氢 化12h。旋转蒸发除去醋酸得到对映富集的(2S)-羟基-4-苯基丁酸的粗品。用l，2-二氯乙烷重结晶一次，目标产物的化学纯度和光学纯度都在99%以上。
实施例6利用静息细胞制备(2R)-羟基-4-苯基丁酸 将实施例3 4中得到的产物粗品用冰醋酸溶解后，加入5%的Pd/C，在常温常压 下氢化12h。旋转蒸发除去醋酸，得到对映富集的(2R)-羟基-4-苯基丁酸的粗品。用l， 2-二氯乙烷重结晶一次，目标产物的化学纯度在99%以上，光学纯度达98%。
权利要求
一种利用内酯酶制备光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的方法，其特征是包括如下步骤1)采用Fusarium proliferatum内酯水解酶水解4-苯基-2-羟基-4-丁内酯(1)将保藏号为CGMCC 1494表达Fusarium proliferatum内酯水解酶基因的重组大肠杆菌JM109(DE3)或BL21(DE3)，在发酵培养基中进行扩增培养，离心洗涤得到静息细胞；(2)将(1)收获的静息细胞悬浮于pH为6.0～7.0的磷酸钾缓冲液中，加入4-苯基-2-羟基-4-丁内酯，在25～40℃反应0.5～8h，然后采用常规的分离方法从反应混合物中收集光学纯的(2S)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯、(2R)-4-苯基-2，4-二羟基丁酸和(2R)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯；2)将步骤1)所获得的光学纯的(2S)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯、光学纯的(2R)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯或光学纯的(2R)-4-苯基-2，4-二羟基丁酸用冰醋酸溶解，在常温常压和Pd/C催化的条件下氢化12h，得到(S)-2-羟基-4-苯基丁酸、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸或(R)-2-羟基-4-苯基丁酸；所述的光学纯的(2S)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯、光学纯的(2R)-4-苯基-2-羟基-4-丁内酯或光学纯的(2R)-4-苯基-2，4-二羟基丁酸与Pd/C的重量比为10.01～0.05。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤2)所获得的化合物在有机溶剂中重 结晶获得精制品。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征是步骤l)中所述的内酯水解酶催化水解的底物 4-苯基-2-羟基-4- 丁内酯为四种非对映异构体混合物，其浓度为10 200mmol/L。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征是步骤l)中所述的发酵培养基组成如下葡萄糖 1 50g，蛋白胨1 20g， KH2P04 1 10g， K2HP04 1 10g， NaCl 0. 1 2g， MgS04 0. 1 2g，自来水1000ml， pH 3 8。
全文摘要
本发明公开了一种化学-酶法制备光学纯2-羟基-4-苯基丁酸的新方法。该方法利用表达Fusarium proliferatum内酯酶基因的重组大肠杆菌细胞在优化条件下发酵产酶，然后以一锅煮的方式选择性催化水解4-苯基-2-羟基-4-丁内酯的非对映异构体，再将所需的构型在常温常压Pd/C催化氢化作用下，生成目标化合物。其中(R)- 2-羟基-4-苯基丁酸的对映体过量值达98％，摩尔转化率达36％，(S)-2-羟基-4-苯基丁酸的对映体过量值达99％以上，摩尔转化率达46％。本发明所述的生物催化剂及其化学-酶法工艺不仅具有较好的催化效果，而且操作简便、安全，成本低廉，产物容易纯化，对环境友好，具有工业开发应用前景。
文档编号C12P7/42GK101701227SQ20091019876
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者许建和, 陈兵 申请人:华东理工大学