专利名称：细胞外基质蛋白的氨基酸序列rgd的特异性人源化抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫特异性地识别细胞外基质蛋白的氨基酸序列 RGD (Arg-Gly-Asp)的人源化抗体(humanized antibody)，和该人源化抗体用于治疗和
诊断包括癌症、炎症性疾病、自身免疫病、传染病和骨病等在内的多种疾病或病症的应用。在本临时申请中引用了多个出版物(包括专利和专利申请)。这些出版物的公开 内容通过引用整体并入本临时申请，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
2.
背景技术：
细胞粘附在多细胞生物体的生命维持中发挥重要作用。多细胞生物体的细胞粘 附分类为细胞_细胞外基质(下文简称为“ECM” )粘附和细胞-细胞粘附。已经阐明 细胞-ECM粘附由整合素(integrin)介导，细胞-细胞粘附由钙粘蛋白(cadherin)、封闭 蛋白(claudin)和柄蛋白(nectin)介导。跨膜粘附蛋白(例如整合素)形成细胞-ECM粘附。整合素形成α链和β链 的异源二聚体。目前已经鉴别并确认了至少18种类型的α链，8种类型的β链和24种 类型的α β异源二聚体。各种类型的整合素识别特异的配体。除了细胞粘附外，包括 整合素在内的跨膜粘附蛋白还与从ECM至细胞的细胞内信号传导、增殖调控、移动以及 分化有关(F.G Giancotti，et.al.，Science, 285，1028-1032，1999)。已知许多蛋白都是ECM蛋白，所述ECM蛋白分类为胶原蛋白(例如I-XIX 型)、非胶原糖蛋白(例如骨桥蛋白(osteopontin，OPN))、玻连蛋白(vitronectin)、纤连 蛋白(fibronectin)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor)、层粘连蛋白(Iaminin)、腱 生蛋白(tenascin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、血小板反应蛋白(thrombospondin))、弹性 蛋白(elastin)和蛋白聚糖。这些ECM蛋白与相应的整合素结合并激活细胞内信号传导通 路，从而调控细胞骨架形成、移动、增殖和分化等。与ECM蛋白结合的整合素根据ECM 蛋白的类型传递特异信号，由此调控这些信号激活通路。在许多ECM蛋白的细胞粘附区 常观察到RGD序列，该序列通过与整合素结合而具有多种功能。ECM蛋白的RGD序列 已经被认为是可能的药物靶标，并且已经产生了多种小分子化合物和人工肽。已知一些类型的整合素，例如α3β1整合素、α5β1整合素、α8β1整合素、 ανβ 整合素、α νβ 3整合素、α νβ 5整合素、α νβ 6整合素、α νβ 8整合素与RGD 序列结合。α 5β1整合素与其特异性配体纤连蛋白之间的相互作用激发了对整合素介 导的信号传导机制的研究。所述研究表明，α 5β1整合素不仅调控细胞粘附和细胞移 动，还调控细胞分化和细胞死亡。(S.M.Frischetal.，Curr.Opin.Cell Biol., 9，701-706， 1997)。还表明，α 5β1整合素在肿瘤细胞中高表达，并与癌症的恶性改变有关。各整 合素介导的信号根据所结合的ECM蛋白而不同，例如，生长因子的刺激激活与纤连蛋白 结合的内层细胞的生长，而抑制与层粘连蛋白-1结合的内层细胞的生长。另外，由层粘连蛋白-10/11向α 3β1整合素传递的信号不同于由纤连蛋白向α5β1整合素传递的信 号，前者显著增强了癌细胞的移动(J.Guetal.，J.Biol.Chem.，276，27090-27097，2001) 并通过血液饥饿有效避免凋亡(J.Guetal.，J.Biol.Chem., 277，19922-19928，2002)。观 察到与α ν整合素结合的RGD序列在破骨细胞和新生血管中高表达，因此认为抑制RGD 序列和α ν整合素是治疗骨质疏松症和癌症的药物的靶标。已经表明，α5β1整合素在 肿瘤细胞上高表达，并与癌症的恶性改变有关。根据这些发现，已经开发了抗_α5β1 整合素抗体(Volocimab)、抗-α 4整合素抗体(Natalizumab)禾Π抗-α ν β 3整合素抗体 (Vitaxin)作为抑制整合素和ECM蛋白之间相互作用的抗-整合素抗体拮抗药。同时，已知一些ECM蛋白，例如胶原蛋白、骨桥蛋白(OPN)、玻连蛋白、纤 连蛋白、血管性血友病因子、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白包 含RGD序列。另外，还已知一些病毒和一些细菌具有RGD序列，从而粘附至细胞上。 OPN是具有与骨中富含的钙相结合的性质的酸性糖蛋白。据报道，OPN在细胞粘附、细 胞迁移、肿瘤形成、免疫应答和补体介导的细胞裂解中发挥重要作用。OPN敲除小鼠和 抗-OPN中和抗体的结果表明，OPN与肝炎、自身免疫病(例如类风湿性关节炎)和癌 的转移有关。已经指出，抑制ECM蛋白与细胞结合的抑制剂可用于治疗骨质疏松症或癌 症。因此，除了上述靶向整合素的拮抗药外，还开发了靶向作为整合素结合伴侣的ECM 蛋白的拮抗药。3.发明概述虽然已经报道了诸如抑制RGD序列介导的与整合素的相互作用的小分子、抗 OPN抗体和抗整合素抗体的药物，但还没有关于特异识别RGD序列的抗体的报道。由 于RGD序列是ECM蛋白的保守序列之一，特异识别RGD序列的抗体可在人和治疗性模 型动物中均发挥作用，并因此可以被认为是用于治疗剂开发的非常有用的活性成分。因 此，需要特异识别RGD序列的此类抗体。本发明人之前分离了免疫特异性地识别RGD序列的小鼠单克隆抗体，并通过杂 交瘤克隆33Ε10和35Β6 (保藏编号分别为FERM ΒΡ-10440和FERMBP-10441)产生该抗 体。在本发明中，杂交瘤克隆名称可与由所述克隆产生的单克隆抗体名称互换使用。所 有这些小鼠抗-RGD抗体都为IgGl同型。观察到这些单克隆抗体通过与诸如骨桥蛋白的 ECM蛋白的RGD序列结合而干扰RGD序列介导的ECM和细胞之间的结合。因此，这 些抗-RGD抗体对与RGD序列相关的疾病可具有治疗或诊断作用，所述与RGD序列相 关的疾病为，例如癌症，如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，如类风湿性关节炎、 骨关节炎、传染病、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉 芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克隆氏病)、自身免疫病、骨质疏松症等。然而，由于这些单克隆抗体都为小鼠源的，由于其免疫原性而可能在人中产生 的不利作用阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗应用。为了降低免疫原性，本发明人制 备了人源化抗体，该人源化抗体具有与人源化抗体所来源的原始小鼠抗-RGD抗体所表 现的生物活性相应的生物活性。 因此，本发明提供了免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片 段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含部分来源于非人来源和部分来源于人来源的 抗原结合区。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含来源于非人来源(供体，例如33E10和35B6单克隆抗体)的互补决定区(下文简称为“CDR” ) 和来源于人来源(接受体(acceptor))的框架区(下文简称为“FR”)。所述人源化抗体 或其抗原结合片段可抑制RGD序列和其配体之间的结合。在具体实施方式
中，免疫特异性地识别RGD序列的所述人源化抗体或其抗原结 合片段包含ω重链(下文简称为“H-链”)，其包含源自人Η-链的可变区(下文简 称为“V-区”)的至少一个H-链FR(下文简称为“FRH”)，和源自免疫特异性地识 别RGD序列的非人抗体的H-链CDR(下文简称为“CDRH” )中的至少一个的至少一个 CDRH ；或者(ii)轻链(下文简称为“L-链”)，其包含源自人L-链的V-区的至少一个 L-链FR(下文简称为“FRL”)，和源自免疫特异性地识别RGD序列的非人抗体的L-链 CDR(下文简称为“CDRL” )中的至少一个的至少一个CDRL ；或者上述(i)和(ii)两 者。在一个实施方式中，所述本发明的人源化抗体的CDRH中的至少一个和/或CDRL 中的至少一个可以源自由选自保藏编号为FERM BP-10440和FERMBP-10441的杂交瘤 产生的单克隆抗体。在优选实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含
(i)源自人FRH的至少一个FRH，和包含选自氨基酸序列SEQIDN0: 1、2和3的氨基 酸序列的至少一个CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一个FRL，和包含选自氨基酸序 列SEQ ID NO 4、5和6的氨基酸序列的至少一个CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)两 者。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRHl 的 SEQ ID NO 1、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 2 和在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3。在一 些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRLl的SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。优选地，本发明 的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 1、在CDRH2的SEQ ID NO 2、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。在一些具体实施方式
中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自 由GenBank登录号X65891 (SEQ ID NO 13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由 GenBank登录号X72441 (SEQ ID NO 18)编码的人κ -L-链的V-区的FRL。在一些 实施方式中，本发明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 和17(分别为Χ65891的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序 列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分别为Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 24的H-链的V_区(下文简称为“ VH” )；或者
(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 26的L-链的V_区(下文简称为“ VL” ) ； (iii)上述 (i)和(ii)两者。 在其它实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含ω源自人 FRH的至少一个FRH，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO 7、8和9的氨基酸序列的至 少一个CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一个FRL，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO 10、11和12的氨基酸序列的至少一个CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)两者。在 一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRHl的SEQID NO 7、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 8 和在 SEQ ID NO 9 的 CDRH3。在一些实施方 式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRLl的SEQ ID NO: 10、在 CDRL2的SEQ IDNO 11和在CDRL3的SEQ IDNO 12。优选地，本发明的所述人源 化抗体或其抗原结合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 7、在CDRH2的SEQ ID NO 8、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 9、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 10、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 11 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 12。在一些具体实施方式
中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自 由GenBank登录号X65891 (SEQ ID NO 13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由 GenBank登录号X72441 (SEQ ID NO 18)编码的人κ -L-链的V-区的FRL。在一些 实施方式中，本发明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 禾口 17 (分别为Χ65891的氨基酸序列FRHl、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序 列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分别为Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的VH ；或者(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 30的VL ；或者(iii)上述(i)和(ii)两者。本发明还提供了包含编码免疫特异性地识别RGD序列的本发明人源化抗体或其 抗原结合片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。具体而言，本发明提供了分离的核酸分 子，其包含编码包含选自SEQ ID NO : 1、2、3、7、8和9的至少一个氨基酸序列的人源 化H-链的核苷酸序列，或者包含编码包含选自SEQ ID NO 4、5、6、10、11和12的至 少一个氨基酸序列的人源化L-链的核苷酸序列，或者包含所述人源化H-链的核苷酸序 列和所述人源化L-链的核苷酸序列两者。在优选的具体实施方式
中，此分离的核酸分子 包含编码VH的核苷酸序列SEQ ID NO 23，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 24 的核苷酸序列。在一些优选的具体实施方式
中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷 酸序列SEQ ID NO 25，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 26的核苷酸序列。优 选地，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 25两 者。在优选的具体实施方式
中，本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体来源的信 号肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 32和34)或者异源来源的信号肽的核苷酸序列。在其它优选的具体实施方式
中，此分离的核酸分子包含编码VH的核苷酸序列SEQ ID NO 27，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 28的核苷酸序列。在一些优选 的具体实施方式
中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷酸序列SEQ ID NO: 29，或者 包含编码氨基酸序列SEQ ID NO: 30的核苷酸序列。优选地，本发明的分离的核酸分子 包含核苷酸序列SEQ ID NO : 27和SEQ ID NO: 29两者。在优选的具体实施方式
中，本 发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体来源的信号肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 36和38)或者异源来源的信号肽的核苷酸序列。本发明进一步提供了载体，例如表达载体，其包含编码免疫特异性地识别RGD 序列的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的H-链或L-链或两者的核苷酸序列。在此 载体中，本发明的核苷酸序列可操作地连接一个或多个调控元件。本发明的核苷酸序列 可以包括编码作为CDR来自的非人供体抗体的天然信号肽的核苷酸序列，或者编码异源来源的信号肽的核苷酸序列。此外，本发明还提供了包含本发明的核酸分子的宿主细胞，其含有包含本发明 核酸分子的载体。在一个实施方式中，本发明提供了分离的宿主细胞，其包含编码本发 明的人源化H-链的第一核酸分子和编码本发明的人源化L-链的第二核酸分子，所述第 一核酸分子和第二核酸分子均以表达具有生物学功能的本发明人源化抗体或其抗原结合 片段的方式可操作地连接调控元件。因此，本发明还提供了本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的制备方法，所 述方法包括在使所述人源化抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本发明的宿主细 胞，和收集所产生的人源化抗体。本发明还提供了包含本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段的组合 物。此外，本发明提供了用于预防或治疗与RGD-蛋白相关的病症或疾病的药物组合 物，其包含本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。所 述两种组合物中的任一种均可以进一步包含可以加和或协同地改善所述病症或疾病的另 一种活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化疗化合物等。所述活 性化合物还包括小分子化合物和抗体或其抗原结合片段，例如人α4结合素特异性抗体 或人α 9结合素特异性抗体。 另一方面，本发明提供了用于预防或治疗与RGD-蛋白相关或涉及RGD-蛋白的 病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施予预防有效量或治疗有效量的 本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段。对于此类应用，本发明的人源化抗体 或其抗原结合片段可以与增强所述人源化抗体或其抗原结合片段的生物学作用的治疗分 子(moiety)结合。此类治疗分子的实例包括另一种抗体、抑制细胞生长或杀死细胞的细 胞毒素、放射性元素和/或包括抗炎剂和抗生素等在内的其它治疗剂。在本发明的再一个实施方式中，本发明提供了用于诊断受试者的与RGD-蛋白 相关或涉及RGD-蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检查受试者施予诊断有 效量的本发明的人源化抗体或其抗原结合片段。对于此类应用，本发明的人源化抗体可 以用可检测的标记物(例如放射性元素)进行标记。3.1.定义本发明使用的术语“抗体”是指能够免疫特异性地结合目标抗原或目标序列 (例如RGD序列)的抗体分子，并涵盖完整的抗体分子或其片段，包括其抗原结合片段。本发明使用的术语“抗原结合片段”是指保留了免疫特异性地结合目标多肽、 蛋白或序列(尤其为RGD序列)的能力的任何抗体片段，其包括单链抗体、Fab片段、 F(ab' )2片段、二硫键连接的Fvs和包含VL和/或VH中任一种的片段或包含特异结合 目标多肽、蛋白或序列的CDR的片段。因此，人源化抗体的此抗原结合片段可以包括或 可以不包括部分或全长的人恒定区。本领域熟知获得上述抗体片段的各种方法。本发明使用的术语“免疫特异性地识别”是指抗体或其抗原结合片段特异性地 结合目标多肽、蛋白或序列(尤其为人RGD序列)的能力。该抗体不非特异性地与其它 多肽或蛋白结合。然而，免疫特异性地结合目标多肽或蛋白(例如RGD-蛋白)的抗体 或其抗原结合片段可以与其它抗原交叉反应。例如，免疫特异性地识别人RGD-蛋白的 本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以与鼠(murine)RGD-蛋白交叉反应。优选地，免疫特异性地识别人RGD-蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原交叉反应。本发明使用的术语“源自人来源”或“源自非人来源”分别是指其氨基酸序列源自人抗体或非人抗体的相应部分的抗体部分。本发明使用的术语“接受体序列”是指来自人抗体VH或VL的FR的核苷酸序 列或氨基酸序列，其作为来自通常为非人抗体的供体抗体的CDR的接受体。
4.
图1显示利用鼠OPN的部分肽对单克隆抗体4P11、11M6、25H15和35B6表位
分析的结果。图2显示利用鼠OPN和人OPN的部分肽对单克隆抗体29R5、30C7、33E10禾口 3818表位分析的结果。图3显示利用包含RGD序列的鼠OPN的部分肽对单克隆抗体33E10和35B6表 位分析的结果。图4显示利用鼠OPN的部分肽对单克隆抗体33E10和35B6表位分析的结果。图5显示利用鼠OPN的部分肽(CGDSLAYGLR ； SEQ ID NO 79)对单克隆抗 体33E10和35B6表位分析的结果。图6显示抗RGD单克隆抗体的CDRH分析结果。在该图中，33E10的第99位 的氨基酸(F)与35B6的第98位的氨基酸(F)可以为K或R。图7显示抗RGD单克隆抗体的CDRL分析结果。图8显示抗RGD抗体与包含RGD序列的多种ECM蛋白的结合亲和性结果。图9显示抗RGD抗体对mOPN N-末端片段(mOPN N-half)与癌细胞(NIH3T3
细胞)结合的抑制结果。图10A-10C显示抗RGD抗体对多种ECM蛋白与癌细胞(NIH3T3细胞)结合的
抑制结果。图11显示抗RGD抗体对肝炎的抑制作用的结果。图12A-12B显示抗RGD抗体对试验性转移模型中的肺转移的抑制作用的结果。 图12A显示转移细胞的数量，图12B显示重量变化。图13A-13C显示抗RGD抗体对自发转移模型中的肺转移的抑制作用的结果。图 13A显示癌体积，图13B显示转移细胞的数量，图13C显示重量变化。图14显示抗RGD抗体在类风湿性关节炎模型中的治疗作用的研究结果。图15显示小鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨 基酸残基以单字母密码显示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基 (E)以双下戈Ij线表不。根据 Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定义的CDR序列以下划线表示。图16显示小鼠33E10VLcDNA的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨 基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残 基(D)以双下划线表示。根据Kabatetal. (1991)定义的CDR序列以下划线表示。图17显示所设计的侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的33E10VH基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽 序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(E)以双下划线表示。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图18显示所设计的侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的33E10VL基 因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽 序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图 19 显示 pCh33E10 和 pHu33E10 (统称表达载体(collectively Expression Vector)) 的结构示意图。从上部的SalI位点顺时针开始，所述质粒包含从人巨细胞病毒(CMV) 主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始以起始抗体重链基因的转录的重链转 录单元。CMV启动子之后为VH外显子、包含含有人Y -1重链恒定区(所述人Y -1重 链恒定区包含具有插有内含子的CH1、铰链、CH2和CH3外显子)的基因组序列以及 CH3外显子之后的聚腺苷酸位点。轻链转录单元在重链基因序列之后，该轻链转录单元 以CMV启动子起始，之后为VL外显子和包含人κ链恒定区外显子(CL)和在CL之前 的部分内含子的基因组序列，以及CL外显子之后的聚腺苷酸位点。所述轻链基因之后为 SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和含 有SV40聚腺苷酸位点(SV40聚腺苷酸位点)的片段。最后，所述质粒包含质粒pUC19 的含有细菌复制起点(pUCori)和β-内酰胺酶基因(β-内酰胺酶)的一部分。图 20 显示 33E10VH、人源化 33Ε10 (Hu33E10) VH 和人接受体 U03400 (GenBank 登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根 据 Kabat et al. (1991)的位置。Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91—3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下划线表示的残基与CDR接触，并且在 人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该图中省略了 U03400中的CDR残基。
图 21 显示 33E10VL、人源化 33E10 (Hu33E10)VL 和人接受体 X72452 (GenBank 登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根 据Kabatetal. (1991)的位置。Kabat et al. (1991)定义的CDR序列以下划线表示。在该 图中省略了 X72452中的CDR残基。图22显示用于构成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。图23显示用于构成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。图24显示用于构成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。图25显示用于构成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。图26显示侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的Hu33E10VH基因的
核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序 列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(E)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图27显示侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的Hu33E10VL基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜 体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabatetal. (1991) 定 义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图28显示小鼠35B6VH cDNA的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨 基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基 (Q)以双下戈1J线表不。根据 Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services，
1991)定义的CDR序列以下划线表示。图29显示小鼠35B6VL cDNA的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨 基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残 基(D)以双下划线表示。根据Kabatetal. (1991)定义的CDR序列以下划线表示。图30显示所设计的侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的35B6VH基 因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽 序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(Q)以双下划线表示。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图31显示所设计的侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的35B6VL基因 的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序 列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图32显示pCh35B6和pHu35B6 (统称表达载体)的结构示意图。从上部的SalI 位点顺时针开始，所述质粒包含从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子 (CMV启动子)开始以起始抗体重链基因的转录的重链转录单元。CMV启动子之后为VH 外显子、包含含有人Y-I重链恒定区(所述人Y-I重链恒定区包含具有插入内含子的 CHU铰链、CH2和CH3外显子)的基因组序列以及CH3外显子之后的聚腺苷酸位点。 轻链转录单元在重链基因序列之后，该轻链转录单元以CMV启动子起始，之后为VL外 显子和包含人κ链恒定区外显子(CL)和在CL之前的部分内含子的基因组序列，以及CL 外显子之后的聚腺苷酸位点。然后，所述轻链基因之后为SV40早期启动子(SV40启动 子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位点(SV40 聚腺苷酸位点)的片段。最后，所述质粒包含质粒pUC19的含有细菌复制起点(pUCori) 和β -内酰胺酶基因(β -内酰胺酶)的一部分。图 33 显示 35B6VH、人源化 335Β6 (Hu35B6) VH 和人接受体 Z47230 (GenBank 登
录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据 Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下 划线表示的残基与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该 图中省略了 Z47230中的CDR残基。图 34 显示 35B6VL、人源化 335B6 (Hu35B6) VL 和人接受体 X72479 (GenBank 登
录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据 Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下 划线表示的残基与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该图中省略了 X72479中的CDR残基。图35显示用于构成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。图36显示用于构成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。图37显示用于构成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。图38显示用于构成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置和 方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。图39显示侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的Hu35B6VH基因的核苷
酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜 体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(Q)以双下划线表示。根据Kabatetal. (1991) 定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图40显示侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的Hu35B6VL基因的核苷 酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜 体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabatetal. (1991) 定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。图41A-41B显示通过ELISA对嵌合35B6抗体和人源化35B6抗体与hOPN-BSA 的结合进行分析的结果。以起始浓度2.5μ g/ml(图41A)或Ι.Ομ g/ml(图41B)和一系 列两倍稀释对各个抗体进行测试。实验一式三份。各抗体浓度的平均吸收值和标准偏差 显示在图41A-41B中。5.发明详述5.1.针对RGD序列的抗体的制备可以通过本领域任何适合的方法产生免疫特异性地识别RGD序列的抗体。在本发明中，包含细胞粘附“RGD”序列的RGD-蛋白或肽(下文简称为 “RGD-肽”)可以为(1)源自表达RGD蛋白的人ECM或者源自具有ECM的所有组
织，(2)通过向细菌、酵母、诸如动物细胞的细胞系等中转染编码RGD-蛋白或RGD-肽 的DNA(优选为cDNA)而表达获得的重组蛋白或肽，或者(3)合成的蛋白或肽。在本发明中，用作抗原的RGD-肽能够通过免疫产生针对RGD序列的抗体。所 述RGD-肽包括氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR (SEQ IDNO 71)(其为鼠ECM蛋 白的细胞粘附序列)的RGD-肽。所述RGD-蛋白或RGD-肽包括，例如OPN、玻连蛋 白、纤连蛋白、血管性血友病因子、胶原蛋白、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原、 血小板反应蛋白和包括其片段的RGD。可以将人工或天然变化，例如氨基酸的取代、缺 失、修饰和添加应用于所述蛋白或所述肽，只要所述蛋白或所述肽包含RGD-序列。所 述变体蛋白或肽可以包含其中的多个氨基酸，优选1-10个氨基酸，更优选1-几个(例如 1-5个)氨基酸被取代、缺失、修饰、添加或插入的氨基酸序列。在本发明中，所述RGD-肽包含至少约5个氨基酸，优选约5-50个氨基酸，更 优选约10-20个氨基酸。可以利用本领域熟知的方法，例如化学合成法、细胞培养法、 基因重组法及其正确修饰产生在本发明中作为抗原的RGD-蛋白或RGD-肽。例如，可 以利用蛋白酶对ECM蛋白进行适当切割，从而获得RGD-肽。所述RGD-蛋白或所述 RDG-肽可源自哺乳动物，例如鼠(murine)、大鼠、兔、猪、牛、猴和人。可以使用本领域熟知的任何方法制备可用于制备抗-RGD抗体的RGD-蛋白或RGD-肽。用于产生所述变体多肽的方法的实例包括合成寡核苷酸定点突变法(缺口 双链体法)、涉及利用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理随机引入点突变的点突变法、涉及利 用Bal31酶或其它酶制备缺失突变的方法、盒式突变 、连接子扫描法、错掺入法(miss incorporation method)、错配弓丨物法和DNA片段合成法等。所述RGD-肽可以与其它生物大分子，例如甲状腺球蛋白(thyrogloblin)、钥孔 血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，优选甲状腺球 蛋白结合。通过使用偶联剂，例如具有活性酯基团和马来酰亚胺基团的结合试剂(所 述活性酯基团与蛋白或肽的氨基基团结合，并且所述马来酰亚胺基团与蛋白或肽的巯基 基团结合；S.Yoshirake et al.，Eur.J.Biochem.，101，395-399，1979)，通过使用混合酐 法(B.F.Erlanger et al.，J.Biol.Chem.，234，1090-1094，1954)，或者通过使用活性酯法 (A.E.Karuetal.，J.Agric.FoodChem.，42，301-309，1994)，可以获得 RGD-肽和生物大 分子结合的方法。优选通过使用偶联剂获得RGD-肽和生物大分子结合的方法。还可以使用自身过表达RGD-蛋白或RGD-肽的细胞作为抗原。自身过表达 RGD-蛋白或RGD-肽的细胞可以通过本领域熟知的重组DNA技术制备。可以利用按照上述制备的适当抗原，通过本领域熟知的多种方法制备特异于 RGD序列的抗体。可以通过本领域熟知的多种方法产生针对RGD序列的抗体。例如， 可以将目标抗原施予包括但不限于兔、小鼠、大鼠等在内的多种宿主动物，从而诱导产 生包含特异于所述抗原的多克隆抗体的抗血清。可以根据宿主种类使用多种佐剂提高免 疫应答，所述佐剂包括，但不限于弗氏(完全或不完全)佐剂，矿物胶，例如氢氧化铝， 表面活性物质，例如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluranicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳 齐U、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚，和用于人的潜在有用的佐剂，例如BCG(卡介菌，Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领域熟知 的。可以使用本领域已知的包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术或其组 合在内的多种技术制备单克隆抗体。例如，可以通过使用包括本领域已知的以及例如 Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ； Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T—Cell Hybridomas， pp.563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(两者均通过引用整体并入本文)中教导的杂交瘤技 术，产生单克隆抗体。本发明使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的 抗体。术语“单克隆抗体”指源自单个克隆的抗体，并包括真核、原核或噬菌体克隆， 但不限于产生该单克隆抗体的方法。利用杂交瘤技术产生并筛选特异抗体的方法是常规方法，且为本领域所熟知。 在非限制性实例中，可以利用目标抗原或表达此抗原的细胞免疫小鼠。检测到免疫应 答(例如在小鼠血清中检测到特异于所述抗原的抗体)后，收集小鼠脾脏并分离脾细 胞。然后，通过熟知的技术将所述脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如，P3U1、 P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-Ul、P3NSl_Ag4、SP2/0_Agl4、P3X63_Ag8_653 等)融合。 通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后，通过本领域已知的方法检测所述杂交瘤克隆， 获得分泌能够与所述抗原结合的抗体的细胞。可以通过对小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆来产生腹水液，该腹水液通常包含高水平的抗体。可以通过已知技术 产生识别特异表位的抗体片段。例如，可以通过免疫球蛋 白分子的蛋白水解切割，利用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生 F(ab，)2片段)的酶产生Fab和F(ab，)2片段。F(ab，)2片段包含完整的L-链和H-链 的V区、CHl区和铰链区。可以通过本领域已知的任何用于合成抗体的方法，尤其是通过化学合成或者优 选通过重组表达技术，产生本发明的抗体或其抗原结合片段。可以根据本领域技术人员可利用的任何信息(例如来自Genbank的信息、文献或 者通过常规克隆和序列分析)，获得编码抗体的核苷酸序列。如果不能获得包含编码特定 抗体或其表位结合片段的核酸的克隆，而抗体分子或其表位结合片段的序列已知，则可 以化学合成编码所述免疫球蛋白的核酸，或者从合适的来源(例如抗体cDNA文库，或者 由表达所述抗体的任何组织或细胞，例如所筛选的表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸， 优选polyA+RNA，或由其产生的cDNA文库)利用与序列的3’和5’末端杂交的合成 引物通过PCR扩增获得编码所述免疫球蛋白的核酸或通过克隆利用特异于所述特定基因 序列的寡核苷酸探针以鉴定例如来自cDNA文库的编码所述抗体的cDNA克隆从而获得编 码所述免疫球蛋白的核酸。然后，可以利用本领域熟知的任何方法，将通过PCR扩增产 生的核酸克隆至可复制的克隆载体内。5.2.重组抗体的制备可以利用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定 点突变和 PCR 等(参见，例如 Sambrook etal.，见上文；和 Ausubel et al.，eds.，1998， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,描述的技术，其均通过
引用整体并入本文)，对所述抗体的核苷酸序列进行处理。可以向抗体中引入突变，例如 在表位结合结构域区或者在任意部分引入氨基酸取代、缺失和/或插入，从而增强或降 低生物活性。可以使用包含编码抗体的核苷酸序列的表达载体用于抗体或其抗原结合片段的 重组表达。可以利用之前节段中讨论的本领域熟知的技术，通过重组DNA技术产生包含 编码抗体分子、抗体的H-链和/或L-链或其用于产生抗体或其抗原结合片段的部分的 核苷酸序列的载体。可以利用本领域技术人员熟知的方法构建包含抗体或其抗原结合片 段的编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重 组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可以将编码VH、VL、VH和VL两者、VH 和/或VL的抗原结合片段或者抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列克隆至此载体中用 于表达。此序列可以与编码可以是天然的或与原始抗体异源的信号肽的多核苷酸融合。 然后，可以将由此制备的表达载体引入到适合表达所述抗体的宿主细胞中。因此，本发 明包括包含编码免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸 的宿主细胞。可以利用本发明的两种表达载体共转染所述宿主细胞，其中，第一载体编码源 自H-链的多肽，第二载体编码源自L-链的多肽。所述两种载体可以包含能够均等表达 H-链和L-链多肽的同一选择标记物，或者不同的选择标记物，从而确保两种质粒的维 持。或者，可以使用编码并能够同时表达H-链和L-链多肽的单个载体。H-链和L-链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。在另一个实施方式中，还可以利用本领域已知的各种噬菌体展示法产生抗体。 在噬菌体展示法中，功能抗体结构域被展示在具有编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒 表面。在具体的实施方式中，可以利用此噬菌体来展示由库(repertoire)或组合抗体文库 (例如人或鼠)表达的抗原结合域，例如Fab和Fv或者通过二硫键稳定的Fv。可以利用抗 原，例如利用标记抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原，选择或鉴定表达与目标抗 原结合的抗原结合域的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常为包括fd和M13在内的 丝状噬菌体。所述抗原结合域作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的重组融合蛋白 表达。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的实例包括在Brinkman etal., J.Immunol.Methods, 182 41-50, 1995 ； Amesetal., J.Immunol.Methods, 184 177-186，1995 ； Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.，24 952-958，1994 ； Persic et al.，Gene，187 9-18, 1997 ； Burton et al., Advances in Immunology，57 191-280,
1994； PCT 申请号 PCT/GB91/01134 ； PCT 公开 W090/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； W095/15982 ； WO 95/20401 ；和美国专利 号 5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 中描述 的方法，其均通过引用整体并入本文。如上述参考文献中的描述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码 区并用于产生包括人抗体或其它任何目标片段在内的所有抗体，并按照例如以下详述在 包括例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌在内的任何期望宿主中表 达。例如，也可以利用本领域已知的方法，例如在PCT公开WO 92/22324 ； Mullinax et al., BioTechniques，12(6) 864-869，1992 ；和 Sawai et al.，AJRI, 34: 26-34，
1995；和 Better et al.，Science, 240 1041-1043，1988 (均通过引用整体并入本文)中 公开的方法，采用重组产生Fab、Fab，和F(ab，)2片段的技术。可用于产生单链Fvs 和抗体的技术的实例包括在美国专利号4,946,778和5,258,498 ； Huston et al., Methods in Enzymology, 203 46-88，1991 ； Shu et al.，PNAS, 90: 7995-7999，1993 ；和 Skerra et al., Science, 240 1038-1040，1988 中描述的技术。在通过上述任一方法产生本发明的抗体分子后，可以通过本领域已知的纯化免 疫球蛋白分子的任一方法对其进行纯化，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析 (尤其是在蛋白A或蛋白G纯化后针对特异抗原的亲和层析)和根据体积的柱层析)、 离心、差异溶解度或通过用于蛋白纯化的其它标准技术对其进行纯化。此外，本发明的 抗体或其片段可以与本文描述的异源多肽序列或本领域已知的其它物质融合，以便于纯 化。对于包括抗体在人体内的应用和体外检测试验在内的一些应用，可以优选使用 嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在下文5.3节中将详细讨论嵌合抗体和人源化抗体。 与其它化合物或异源多肽融合或结合的抗体可用于体外免疫试验、纯化方 法(例如亲和层析)以及体内治疗应用或诊断应用中。参见，例如PCT
发明者上出利光, 今重之, 尚卡尔·库马尔, 曹仲欣, 鹤下直也 申请人:株式会社遗传科技