抑制黑素生成的新组合物及其应用的制作方法

专利名称：抑制黑素生成的新组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及减少黑素细胞中黑色素合成的组合物及其应用。
背景技术：
在男性中，由黑色素的合成和分布引起的色素沉着在皮肤、毛发和虹膜的色素 上皮中最为显著。因此，皮肤、毛发和眼睛的颜色主要取决于存在的色素类型及其浓 度。这种色素沉着受到许多内部和外部因素的调控，例如暴露于紫外辐射。黑色素是由黑素细胞是从酪氨酸(真黑色素)或酪氨酸和半胱氨酸(褐黑素)形 成的单体通过加成或缩合而产生的大分子。合成黑色素或黑素生成的机制特别复杂并涉 及各种不同的酶，主要是酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白(酪氨酸酶相关蛋白-1或Tyrp-1)。 在黑素生成过程中，这些酶具体催化酪氨酸转变成DOPA(二羟基苯丙氨酸)，然后转变 成多巴醌。从这种分子出发，两条代谢途径允许合成真黑色素或褐黑素。黑素生成在黑素细胞中包含的特化细胞内细胞器——黑素体中发生。尽管黑素 体属于第一批在形态学上被描述的细胞器(Seiji等，1963)，但对它们的蛋白组成及其生 物发生的了解仍然相对少。根据形态学标准，黑素体的成熟可以分成四个阶段。阶段I对应于由膜划分的 区室，具有不定量的腔内膜。阶段II是椭球形结构，具有特征性的蛋白样条纹。这些条 纹在黑色素浓缩、有毒合成中间体的消除和促进黑色素向角质细胞的转移中发挥重要作 用(Seiji等，1963)。阶段III的黑色素被检测为沿着条纹的电子致密的沉积物。阶段IV 是电子致密结构，其中不再能看到内部条纹。该阶段对应于准备好向角质细胞转移的成 熟黑素体(Van Den Bossche 等，2006)。在生物发生过程中，通过加入对黑色素合成关键的酶和其向外周运输所需的效 应物，获得了 “色素性”成熟黑素体(阶段III和IV) (Raposo等，2001)。因此，参与黑 素生成的酶在高尔基体中合成并然后转移到前黑色素体中。对该转移中所涉及的机制的 了解仍然相对少。这种类型的转移特别需要衔接蛋白(AP)复合物的参与，这种蛋白是异 源四聚体，具有在运输小泡中召集酶的作用。这样的复合物有4种，即AP-1到AP-4。 本发明人以前已经显示AP-3复合物参与了酪氨酸酶向黑素体的转移。但是，缺乏AP-3 不消除色素沉着并且不影响Tyrp-1的运输。他们也观察到AP-1衔接物复合物能够与酪 氨酸酶和Tyrp-1的胞质结构域的氨基酸序列相互作用，这不能阐明该复合物在黑素生成 中的准确功能(Theos等，2005)。与此相似，也已显示驱动蛋白即Kifl3A，能够与AP_1 的亚基相互作用(Nakagawa等，2000)。在缺乏黑素体的细胞系中观察到了这种相互作 用。因此，在黑素细胞细胞系中这种相互作用的存在以及它在黑素生成中的作用，还没 有确立。黑素细胞功能障碍可以导致色素沉着异常。色素沉着不足可能源自于色素脱失 疾病，特别是白化病和白癜风。相反，局部色素沉着过度可能源自于某些黑素细胞病 症，例如特发性黑斑病或引起例如老年性色素斑(老年斑)的良性黑素细胞机能亢进和增殖。色素沉着过度也可由事故、例如由光敏作用或病变后瘢痕形成引起。这些色素沉着过度可以通过经局部途径给药的脱色素物质进行治疗。脱色素 分子作用于皮肤黑素细胞，并干扰黑素生成的一个或多个阶段。具体来说，已知的脱 色素物质是氢醌及其衍生物、抗坏血酸及其衍生物、胎盘提取物、曲酸、熊果苷、亚 氨苯酚(WO 99/22707)、肉毒碱和苯醌的组合(DE 19806947)、氨基苯酚酰胺衍生物 (FR2772607)和苯并噻唑衍生物(WO 99/24035)。这些物质可能表现出各种不同的缺点，特别是由于其不稳定性、其使用需要高 浓度、其非特异性作用或其毒性、刺激性或引起过敏的性质。因此，在美容和皮肤病学 领域中正在努力寻求用于经局部途径治疗或防止色素沉着过度的有效且无害的脱色素物 质。在最近几年中，出现了治疗由黑素细胞功能障碍引起的疾病的新手段。特别是 设想了反义寡核苷酸的应用。事实上，文献WO 99/25819描述了用于通过调控生腱蛋白 的表达来增加色素沉着以治疗白癜风和其他色素脱失疾病的寡核苷酸，文献FR 2804960 描述了调控酪氨酸酶或Tyrp-1的表达以治疗色素沉着过度的反义寡核苷酸。发明概述本发明的目的是提供新的脱色素剂，它们无毒、无刺激性、不引起过敏，对黑 素生成具有特异性作用，并在通过局部途径给药的适合剂型中稳定。首先，本发明涉及药物或美容用组合物，其至少包含与AP-1衔接物复合物相互 作用的驱动蛋白特别是Kifl3A的抑制剂、AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、或AP-1衔 接物复合物亚基、或AP-1复合物与同AP-1复合物相互作用的驱动蛋白之间的相互作用 的抑制剂。在本发明的第一个优选实施方案中，所述抑制剂是驱动蛋白Kifl3A的抑制 剂。在本发明的第二个优选实施方案中，所述抑制剂是AP-1衔接物复合物亚基的抑制 剂。在本发明的第三个优选实施方案中，所述抑制剂是AP-1衔接物复合物亚基或AP-1 复合物和与AP-1复合物相互作用的驱动蛋白、特别是驱动蛋白Kifl3A之间的相互作用 的抑制剂。在具体实施方案中，所述抑制剂是小分子、适配体、抗体、核酸或显性失活 肽。优选，所述抑制剂是适配体、抗体、核酸或显性失活肽。在优选实施方案中，本发明涉及包含至少一种核酸的药物或美容组合物，所述 核酸包含能够与AP-1衔接物复合物亚基或同AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、 特别是Kifl3A的编码基因或mRNA特异性杂交并能够降低或抑制该蛋白表达的序列， 或由该序列构成。在本发明的第一个优选实施方案中，所述至少一种核酸包含能够与同 AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的编码基因或mRNA特异性杂 交并能够降低或抑制该蛋白表达的序列，或由该序列构成。在本发明的第二个优选实施 方案中，所述至少一种核酸包含能够与AP-1衔接物复合物亚基的编码基因或mRNA特异 性杂交并能够降低或抑制该蛋白表达的序列，或由该序列构成。优选，所述核酸是反义 寡核苷酸或iRNA，优选为siRNA。所述核酸可以具有从15到50个核苷酸、优选从15 到30个核苷酸的序列。在优选实施方案中，所述核酸包含选自序列SEQ ID No 1到6和 11到24的序列。组合物还可以包含一种或多种其他活性物质，优选选自鞣花酸；熊果苷；间苯 二酚；维生素C;泛酸化物；曲酸；胎盘提取物；直接或间接干扰促黑激素(MSH)、其受体或促肾上腺皮质激素(ACTH)的分子；多元醇例如甘油、乙二醇或丙二醇；维生 素；角质溶解剂和/或表皮剥脱剂例如水杨酸；a-羟基酸例如乳酸或苹果酸；抗坏血 酸；视黄酸；视黄醛；视黄醇；棕榈酸化物、丙酸化物或乙酸化物；抗糖基化和/或 抗氧化剂例如生育酚、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、赖氨 酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、腺苷三磷酸；抗炎性剂；安抚剂及其混合 物；化学或物理滤阳光剂和脱氧核糖核酸或核糖核酸，及其衍生物。在优选实施方案 中，该组合物适合于局部使用。另一方面，本发明涉及本发明的药物或美容组合物在制备治疗或预防色素性病 症的药物中的用途。在优选实施方案中，色素性病症是色素沉着过度。另一方面，本发明涉及本发明的药物或美容组合物作为美容剂的用途。优选， 美容剂是脱色素剂。附图简述

图1A 显示 了在用 siRNA 对照、siRNA-AP-1 ( y 1 A)、siRNA-AP-3 ( 3 3A)或 siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞的细胞裂解液上，通过western印迹实验获得的结果。使 用的第一抗体是抗Kifl3A抗体。图1B显示了使用抗Kifl3A抗体或抗衔接蛋白(AP-1)抗体从黑素细胞细胞 裂解液产生的免疫沉淀的结果。用于显现western印迹的第一抗体是抗Kifl3A抗体。图1C显示了在用siRNA对照或siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞的蛋白提取液 上，通过western印迹实验获得的结果。在这里，通过使用0 -微管蛋白的表达作为参 比，定量评估了驱动蛋白Kifl3A和AP-1复合物亚基P 1A的表达水平。图2显示的图显示了用siRNA对照或siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞中黑色素的 百分率。用siRNA对照转染的黑素细胞中黑色素的量被当作等于100%。黑色素的量通 过在492nm波长处测量细胞裂解液的光密度来测定。图3显示了用siRNA对照或siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞的切片的电子显微镜照片。图4显示了在用siRNA对照或siRNA-P 1A转染的黑素细胞的蛋白提取液上通过 western印迹实验获得的结果。在这里，通过使用0 -微管蛋白的表达水平作为参比，定 量评估了 AP-1复合物的y 1和衔接蛋白亚基的表达。图5A和5B显示的图显示了在用siRNA对照、siRNA- y 1A或siRNA- y -衔接 蛋白(图5A)或用siRNA- y -衔接蛋白与siRNA-y 1A的组合(图5B)感染的黑素细胞 中，白色细胞、即不含成熟的色素性黑素体的黑素细胞的百分率。这些测量值通过使用 光学显微镜(相差显微镜)直接计数来获取。图6显示的图显示了在用siRNA对照、siRNA-y 1A或siRNA- y -衔接蛋白与 siRNA-u 1A的组合转染的黑素细胞中黑色素的百分率。用siRNA对照转染的黑素细胞 中黑色素的量被当作等于100%。黑色素的量通过在492nm波长处测量细胞裂解液的光 密度来测定。图7显示了用siRNA对照和用siRNA-y 1A转染的黑素细胞切片的电子显微镜照 片。照片上的罗马数字对应于细胞中出现的黑素体成熟的阶段。发明详述
本发明人以出人意料的方式显示，利用AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂或与 AP-1相互作用的驱动蛋白的抑制剂，特别是利用阻断AP-1衔接物复合物的亚基或与 AP-1相互作用的驱动蛋白在黑素细胞中的表达的核酸，能够降低黑色素的合成。他们事 实上观察到，这种核酸不仅能够破坏高尔基体的黑素生成酶系向前黑色素体的运输，从 而阻断这些细胞器的成熟，而且能够降低黑素生成酶系的表达。因此，本发明人揭示， 这种类型的核酸通过作用于黑素生成的不同阶段，能够降低或抑制黑素细胞中黑色素的 合成，从而构成了新的特别有效的脱色素剂。首先，本发明涉及一种药物或美容组合物，其至少包含与AP-1衔接物复合物相 互作用的驱动蛋白特别是Kifl3A的抑制剂、AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、或AP-1 衔接物复合物的亚基或AP-1复合物与同AP-1复合物相互作用的驱动蛋白之间的相互作 用的抑制剂。本文献中使用的术语“AP-1”是指在高尔基体反面网络结构中起作用的AP-1 衔接物复合物。不应该将其与同名的转录因子混淆，所述转录因子由jun和fos家族成员 的基因编码的蛋白构成。AP-1衔接物复合物由4个亚基Y、0 1、和Pi构成，这 些亚基中任何一个的失活足以使复合物去稳定并使其不起作用(Bnmn，2007)。在本发明的第一个优选实施方案中，所述抑制剂是与AP-1相互作用的驱动蛋 白、特别是驱动蛋白Kifl3A的抑制剂。本发明涉及与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的任何类型的抑制 剂。抑制剂可以是能够降低驱动蛋白的活性或表达的任何分子。抑制剂可以是小分子、 适配体、抗体、核酸或显性失活肽，但不限于此。术语“小分子”是指小于1,000道尔顿的分子，特别是有机或无机化合物。抑 制驱动蛋白的小分子包括但不限于乙酰丙嗪、氯吩噻嗪、氯丙嗪、N-甲基氯丙嗪、氰甲 丙嗪、氟非那嗪、甲哌啶嗪、左美丙嗪、甲氧丙嗪、去甲氯丙嗪、甲哌丙嗪、奋乃静、 吩噻嗪、丙氯拉嗪、普鲁米近、丙酰马嗪、putaperazine、硫乙拉嗪、硫普哌嗪、硫利 达嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪，以及在专利申请和专利WO 01/98278、W002/057244、 WO 02/079169、WO 02/057244、WO 02/056880、W003/050122、WO 03/050064、 WO 03/049679、WO 03/049678、W003/049527、WO 03/079973、US 6,890,933、WO 2008/070739、W02006/060737、WO 2006/119146 和 US 6,777,200 中描述的抑制分子。在实施方案中，抑制剂是适配体、抗体、核酸或显性失活肽。这里使用的术语 “显性失活肽”是指包含与AP-1相互作用的驱动蛋白的至少一部分并能抑制或降低其活
性的肽。优选，显性失活肽仅仅由与AP-1相互作用的驱动蛋白的一部分、即对应于驱动 蛋白尾部的部分构成。因此，该肽能够与AP-1复合物相互作用，但是在缺少对应于驱动 蛋白头部片段的情况下，不能沿着微管移动，从而不能实现其功能。已经描述了驱动蛋白Kifl3A的几种显性失活肽。具体来说，通过只表达Kifl3A 蛋白对应于驱动蛋白尾部的部分，获得了 Kifl3A的显性失活肽(Nakagawa等，2000)。在本发明的优选实施方案中，驱动蛋白抑制剂是核酸，所述核酸包含能够与同 AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的编码基因或mRNA特异性杂交并能够降低 或抑制该蛋白表达的序列，或由该序列构成。这样的核酸在下文更详细地描述。在本发明的第二个优选实施方案中，所述抑制剂是AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂。本发明涉及AP-1衔接物复合物的亚基之一的任何类型的抑制剂。AP-1衔接物 复合物的亚基之一的抑制剂是指能够降低AP-1衔接物复合物的亚基之一的活性或表达的 任何分子。抑制剂可以是小分子、适配体、抗体、核酸或显性失活肽，但不限于此。优 选，抑制剂是适配体、抗体、核酸或显性失活肽。具体来说，Y和Pi亚基的抑制剂是 优选的。术语“小分子”是指小于1,000道尔顿的分子，特别是有机或无机化合物。已经描述了 AP-1衔接物复合物亚基的几种显性失活肽。具体来说，通过在结 合酪氨酸的口袋中引入突变，获得了 Pi亚基的显性失活突变体，其描述在Wonderlich等 (2008，J.Biol.Chem.，vol.283, 3011-3022)中。抑制剂可以是AP-1的亚基之一的特异性抗体。这些抗体中有几种是可商购的， 例如Y亚基或0 1亚基的特异性抗体(Sigma-Aldrich)。在本申请中，抑制剂也指能够减少或阻止AP-1衔接物复合物的亚基与该复合物 的其他亚基结合的任何分子，即能够减少或阻止AP-1复合物形成的任何分子。例如，抑 制分子可能能够结合于AP-1的亚基之一并引起构象改变，阻止上述亚基与AP-1的一个 或多个其他亚基结合，从而阻断AP-1复合物的形成。它也可以屏蔽亚基之间相互作用的 结构域。在本发明的优选实施方案中，AP-1衔接物复合物的抑制剂是核酸，所述核酸包 含能够与AP-1衔接物复合物亚基的编码基因或mRNA特异性杂交并能够降低或抑制该蛋 白表达的序列，或由该序列构成。这样的核酸在下文中更详细描述。在本发明的第三个优选实施方案中，所述抑制剂是AP-1衔接物复合物亚基或 AP-1复合物与同AP-1复合物相互作用的驱动蛋白、特别是驱动蛋白Kifl3A之间的相互 作用的抑制剂。本发明涉及AP-1衔接物复合物的亚基或AP-1复合物与同AP-1复合物 相互作用的驱动蛋白之间的相互作用的任何类型的抑制剂。优选，驱动蛋白是Kifl3A。 优选，AP-1的亚基是0 1亚基。驱动蛋白Kifl3A的尾部与AP-1复合物的0 1亚基相 互作用(Nakagawa等，2000)。抑制剂可以是能够降低或抑制驱动蛋白与AP-1复合物之 间相互作用的任何分子。抑制剂可以是小分子、适配体或抗体，但不限于此。优选， 抑制剂是针对0 1亚基与Kifl3A相互作用的结构域或针对驱动蛋白Kifl3A尾部与3 1 亚基相互作用的结构域的抗体。抗体与一种或另一种分子结合，从而阻断了 Kifl3A与 AP-1复合物之间的相互作用。此外，抑制剂也可以是诱饵(decoy)，其复制了 M亚基 与Kifl3A相互作用的结构域或驱动蛋白Kifl3A尾部与0 1亚基相互作用的结构域，该诱 饵与Kifl3A或AP-1竞争这两种元件之间的相互作用。当用于本发明时，术语“抗体”包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重 组抗体及其片段。抗体片段是指例如F(ab)2、Fab、Fab’或sFv片段。在具体实施方 案中，抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，优选为IgG或IgM。用于生产抗体的 方法对于本技术领域的专业人员来说是熟知的。本文中使用的术语“适配体”是指能够与AP-1复合物的亚基或与同AP-1相互 作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A特异性结合的核酸或肽的分子。在优选实施方案中，适 配体是核酸，优选为RNA，一般包含5到120个核苷酸(Osborne等，1997)。它们可以 按照被称为 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (指数富集配体的系统进化))的方法在体外进行选择。在本说明书中，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸” 和“核苷酸序列”可以互换使用，是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。在本文件中使用的术语“iRNA”或“干扰RNA”是指干扰特定信使RNA 从而导致其降解及减少其翻译成的蛋白的任何单链或双链RNA。该术语包括小干扰 RNA(siRNA)、双链 RNA (dsRNA)、单链 RNA (ssRNA)、短发夹 RNA(shRNA)、DNA 指 导的 iRNA(ddiRNA)和微小 RNA(miRNA)。在本文件中，术语“杂交”是指在核酸的两条链的互补碱基之间能够建立起 Watson-Crick氢键以形成双链体。在本文件中，术语“能够特异性杂交”意味着本发 明使用的核酸能够在高度严紧的杂交条件下与编码AP-1的亚基或与AP-1相互作用的 驱动蛋白的基因或转录本杂交。高度严紧的杂交条件已在在文献中广泛描述，例如在 Sambrook 等(1989)、Maniatis 等(1982 或它们最近的再版之一)、Ausubel 等(1995) 中，这些条件可以由本技术领域的专业人员按照适合的已知技术，根据核苷酸片段的大 小进行调整。在纯粹说明性的基础上，如下的高严紧性条件是有利的。两条链(特别 是DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA)之间的杂交分两个阶段进行(a)在含有5X SSC(1XSSC对应于0.15MNaCl/0.015M柠檬酸钠溶液)、50%甲酰胺、7%十二烷基硫 酸钠(SDS)、lOXDenhardt溶液、5 %硫酸葡聚糖和1 %鲑鱼精子DNA的磷酸盐缓冲液 (20mm，pH7.5)中，在42°C下预杂交3小时；(b)在取决于探针尺寸的温度下(例如对 于尺寸超过100个核苷酸的探针，在42°C下)杂交20小时，然后用2X SSC/2% SDS溶 液在20°C下进行两次20分钟的清洗，用0.1X SSC/0.1% SDS溶液在20°C下进行一次20 分钟的清洗。对于长度超过100个核苷酸的探针来说，最后的清洗使用0.1X SSC/0.1% SDS溶液在60°C下进行30分钟。在本发明的情况中，术语“编码AP-1的亚基或与AP-1相互作用的驱动蛋白的 基因”被用于表示编码AP-1的Y、0 1、o 1和Pi亚基之一或与AP-1相互作用的驱 动蛋白、特别是Kifl3A的基因组序列。该术语包括基因的5’非编码区、含有起始密 码子的区域、编码区和3’非编码区。术语“编码AP-1的亚基的基因”被用于表示编 码AP-1的Y、0 1、0 1和Pi亚基之一的基因组序列。该术语包括基因的5’非编码 区、含有起始密码子的区域、编码区和3’非编码区。术语“编码与AP-1相互作用的 驱动蛋白的基因”被用于表示编码与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的基因 组序列。该术语包括基因的5’非编码区、含有起始密码子的区域、编码区和3’非编 码区。在本发明的范围内，术语“编码AP-1的亚基或与AP-1相互作用的驱动蛋白的 mRNA”被用于表示从编码相应蛋白的基因的转录得到的核糖核苷酸序列。该术语包括 3’和5’非翻译区(3' -UTR和5' -UTR)、外显子和任选的未剪接的内含子。术语
“编码AP-1的亚基的mRNA”被用于表示从编码相应蛋白的基因的转录得到的核糖核苷 酸序列。术语“编码与AP-1相互作用的驱动蛋白的mRNA”被用于表示从编码相应蛋 白的基因的转录得到的核糖核苷酸序列。更具体来说，术语“编码驱动蛋白Kifl3A的 mRNA”被用于表示从编码驱动蛋白Kifl3A的基因的转录得到的核糖核苷酸序列。基因组序列和蛋白可以通过它们在GenelD数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)中的编号来识别。因此，AP-1的Y、31、01和1；1亚基的 GenelD 登记号分别为 GeneID164、GeneID162、GeneID1174、GeneID8907,人类驱动蛋 白 Kifl3A 的 GenelD 登记号是 GeneID63971。术语“黑色素(melanin)”、“黑素(melanins)” 和“黑色色素(melanic pigments)”在本文中可以互换使用。它们包括在黑素体中可能合成的各种不同色素，包
括真黑素或褐黑素。在本文件中，术语“药物组合物”是指含有可药用载体和/或赋形剂的本发明 的组合物。在本文件中，术语“美容组合物”是指含有可美容用的载体和/或赋形剂的本 发明的组合物。在本说明书中，术语“脱色素剂”是指能够抑制或减少黑素细胞中黑色素的合 成、从而使肤色变浅的活性剂。当被导入到黑素细胞中时，本发明的抑制剂能够诱导AP-1的一个或多个亚基或 与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的表达或活性的降低或抑制，或能够诱导 AP-1衔接物复合物的亚基或AP-1复合物与同AP-1复合物相互作用的驱动蛋白、特别是 驱动蛋白Kifl3A之间的相互作用的降低或抑制，结果是黑色素合成的显著减少。在优选实施方案中，当被导入到黑素细胞中时，本发明使用的核酸能够诱导 AP-1的一个或多个亚基或与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的表达的降低或 抑制，结果是黑色素合成的显著下降。在具体实施方案中，当被导入到黑素细胞中时， 本发明使用的核酸能够诱导AP-1的一个或多个亚基的表达的降低或抑制，结果是黑色素 合成的显著下降。在另一个具体实施方案中，当被导入到黑素细胞中时，本发明使用的 核酸能够诱导与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl3A的表达的降低或抑制，结果 是黑色素合成的显著下降。这些核酸可以在转录或翻译水平上起作用。表达中的“降低”是指例如基因表达产物减少30%、50%, 70%, 80%, 90% 或 95%。本发明使用的核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体。它们可以是单链或 双链形式或二者的混合物。它们可以任选包含至少一个修饰的或非天然的核苷酸，例如 包含修饰碱基例如次黄苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、脱氧尿苷、二 氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或任何其他允许杂交的修饰碱基的核苷酸。本发明使 用的核酸也可以在核苷酸间连键的水平上修饰，例如硫代磷酸酯、H-膦酸酯或烷基-膦 酸酯，或在骨架的水平上修饰，例如a-寡核苷酸、2’ -0-烷基核糖或PNA (肽核酸) (M.Egholm等，1992)。这些核酸可以通过本技术领域的专业人员已知的所有方法来制 备，例如化学合成、文库筛选、体内转录或DNA重组或扩增技术。在本发明的具体实施方案中，核酸可以是当被导入到细胞中时，诱导了抑制细 胞中靶基因表达的干扰RNA(ddiRNA)产生的DNA。这种技术被本技术领域的专业人员 称为DNA指导的干扰RNA。在另一个优选实施方案中，核酸是RNA，优选为干扰RNA(iRNA)。这些RNA 可以是天然的、合成的或通过重组技术产生的。它们也可以包含修饰的核苷酸或化学修 饰，以允许它们例如增加其对核酸酶的抗性并由此增加其在细胞中的寿命。RNA干扰是本技术领域的专业人员熟知的现象，它使得在转录后水平上特异性抑制靶基因的表达成 为可能。许多专利和专利申请描述了使用iRNA分子抑制基因表达；实例包括文献WO 99/32619、US 20040053876、US 20040102408 和 WO 2004/007718。优选，iRNA 分子 是双链的siRNA分子，其长度约为15到50个核苷酸，优选约15到30个核苷酸。在本发明的替代性实施方案中，用于降低或抑制AP-1的亚基或与AP-1相互作 用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的表达的核酸是反义核酸。在具体方式中，用于降低或 抑制AP-1的亚基的表达的核酸是反义核酸。在另一个具体方式中，用于降低或抑制与 AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的表达的核酸是反义核酸。该反义核酸可以 与编码AP-1的亚基或同AP-1相互作用的驱动蛋白的有义核酸的全部或一部分互补。在 具体方式中，反义核酸可以与编码AP-1的亚基的有义核酸的全部或一部分互补。在另一 个具体方式中，反义核酸可以与编码同AP-1相互作用的驱动蛋白的有义核酸的全部或一 部分互补。它可以例如与mRNA互补。反义核酸一般包含与AP-1的亚基或同AP-1相互 作用的驱动蛋白的转录本的至少一部分互补的核苷酸序列，并通过经典的Watson-Crick 相互作用与这些转录本选择性杂交。在具体方式中，反义核酸一般包含与AP-1的亚基的 转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。在另一个具体方式中，反义核酸一般包含与同 AP-1相互作用的驱动蛋白的转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。因此，反义抑制性 核酸可以与编码AP-1的Y、0 1、o 1和Pi亚基或编码与AP-1相互作用的驱动蛋白的 基因的转录本结合，并例如在mRNA的情况下阻断接近目标转录本5’末端的细胞翻译机 制，妨碍其翻译成蛋白，并能在体内抑制目标转录本的表达(Kumar等，1993)。在具体 方式中，反义抑制性核酸可以与编码AP-1的Y、0 1、ol和yl亚基的基因的转录本结 合。在另一个具体方式中，反义抑制性核酸可以与编码同AP-1相互作用的驱动蛋白、特 别是Kifll3A的基因的转录本结合。这样的多核苷酸已描述在例如专利EP 0092574中。 优选，反义核酸与编码AP-1的亚基或编码与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A 的mRNA互补。在具体方式中，反义核酸与编码AP-1的亚基的mRNA互补。在另一个 具体方式中，反义核酸与编码同AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的mRNA互 补。当抑制性核酸是反义类型时，它可以覆盖编码目标转录本的序列的全部或一部分， 或3’或5’非编码序列的全部或一部分。优选，反义抑制性核酸与核糖体结合序列和 翻译起始序列互补。抑制性核酸一般具有至少10个核糖核苷酸的长度，例如长度为10、 15、20、25、30、35、40、45或50个核糖核苷酸，优选长度为15到30个核糖核苷酸。本发明使用的反义核酸可以通过本技术领域的专业人员已知的化学合成方法或 重组DNA技术合成。反义DNA或RNA特别可以化学合成，通过线性模板(例如通过 PCR)或环状模板(例如从病毒或非病毒载体)的体外转录生产，或可以通过从病毒或非 病毒载体体内转录生产。反义核酸可以被修饰以增加其稳定性、其对核酸酶的抗性、其 特异性或其药理学性质。例如，反义核酸可以包含修饰的核苷酸，用于增加有义和反义 核酸之间形成的双链体的稳定性。在另一个实施方案中，抑制性核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性并因此 能够切开与其互补的单链核酸、例如mRNA的催化性RNA分子。可以按照本技术领域的 专业人员熟知的方法(参见例如Fanning和Symonds，2006)设计、合成和生产编码AP_1 的亚基或与AP-1相互作用的驱动蛋白的转录本的特异性核酶。核酶一般具有两个性质不同的区域。第一个区域对目标转录本、即编码AP-1的亚基或与AP-1相互作用的驱动 蛋白的基因的转录本具有一定特异性，因此能够与后者结合，而第二个区域赋予核酶切 开、连接和剪接目标转录本的催化活性。在具体方式中，第一个区域对目标转录本、即 编码AP-1的亚基的基因的转录本具有一定特异性。在另一个具体方式中，第一个区域对 目标转录本、即编码与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的基因的转录本具有 一定特异性。可以使用各种不同类型的核酶，例如锤头核酶或环状核酶、发夹核酶或套 索核酶。本发明使用的干扰RNA或反义核酸可以以前体或编码它们的DNA分子的形式给药。本发明使用的核酸一般具有15到50个核苷酸的长度，优选长度为15到30个核苷酸。在本发明中，核酸能够与编码AP-1复合物的亚基或同AP-1相互作用的驱动蛋 白、特别是Kifll3A的基因或转录本特异性杂交。在实施方案中，核酸能够与编码AP-1 复合物的亚基的基因或转录本特异性杂交。在另一个实施方案中，核酸能够与编码同 AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的基因或转录本特异性杂交。然而，应该理 解，本发明的核酸不必与靶序列具有100%的互补性才能特异性杂交。具体来说，具有至 少等于约90%的互补性程度的核酸能够特异性杂交。优选，本发明的核酸与靶序列之间 的互补性程度等于95%、96%, 97%, 98%, 99%或100%。在优选实施方案中，本发明使用的核酸包含能够与编码AP-1衔接物复合物的亚 基或编码驱动蛋白Kifl3A的基因或mRNA特异性杂交的一个或多个序列，或由所述一个 或多个序列构成。优选，核酸包含选自序列SEQ ID No 1到6和11到24的一个或多个 序列，或由所述一个或多个序列构成。在具体实施方案中，本发明使用的核酸包含能够 与编码AP-1衔接物复合物亚基的基因或mRNA特异性杂交的一个或多个序列，或由所述 一个或多个序列构成。优选，核酸包含选自序列SEQID No 5、6和11到24的一个或多 个序列，或由所述一个或多个序列构成。更优选，核酸包含能够与编码AP-1的P1A或
衔接蛋白亚基的基因或mRNA特异性杂交的一个或多个序列，或由所述一个或多个序 列构成。在另一个具体实施方案中，本发明使用的核酸包含能够与编码驱动蛋白Kifl3A 的基因或mRNA特异性杂交的一个或多个序列，或由所述一个或多个序列构成。优选， 核酸包含选自序列SEQ ID No 1到4的一个或多个序列，或由所述一个或多个序列构成。在特别优选的实施方案中，本发明使用的核酸包含由下列序列对之一形成的双 链干扰RNA分子或由其构成SEQ ID No.l和2，SEQ IDNo.3和4，SEQ ID No.5和6， SEQIDNo.ll 禾口 12，SEQIDNo.13 和 14，SEQ ID No.15 禾口 16，SEQ ID No.17 和 18， SEQ ID No. 19 禾口 20，SEQ ID No.21 和 22 以及 SEQ ID No.23 和 24。在具体实施方案中， 本发明使用的核酸包含由下列序列对之一形成的双链干扰RNA分子或由其构成SEQID No.l和2以及SEQ ID No.3和4。在另一个具体实施方案中，本发明使用的核酸包含由 下列序列对之一形成的双链干扰RNA分子或由其构成SEQIDNo.5和6，SEQIDNo.ll 和 12，SEQID No. 13 禾口 14，SEQ ID No.15 禾口 16，SEQ ID No.17 禾口 18，SEQ ID No. 19 和 20，SEQ ID No.21 和 22 和 SEQ ID No.23 和 24。本发明涉及药物或美容组合物，其至少包含AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、与AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白特别是Kifll3A的抑制剂、或AP-1衔接物 复合物亚基或AP-1复合物与同AP-1复合物相互作用的驱动蛋白之间的相互作用的抑制 剂，特别是在本申请中定义的任何抑制剂。在优选实施方案中，如本申请中所描述，本发明涉及药物或美容组合物，其特 别包含至少一种核酸，所述核酸包含能够与编码AP-1衔接物复合物亚基或编码同AP-1 衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的基因或mRNA特异性杂交并能降 低或抑制该蛋白的表达的序列，或由该序列构成的。在具体实施方案中，如本申请中所 描述，药物或美容组合物包含至少一种核酸，所述核酸包含能够与编码AP-1衔接物复合 物亚基的基因或mRNA特异性杂交并能降低或抑制该蛋白的表达的序列，或由该序列构 成。在另一个具体实施方案中，如本申请中所描述，药物或美容组合物包含至少一种核 酸，所述核酸包含能够与编码同AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白的基因或mRNA 特异性杂交并能降低或抑制该蛋白的表达的序列，或由该序列构成。优选，驱动蛋白是 驱动蛋白Kifl3A。在优选实施方案中，组合物是药物或美容组合物，其制剂适合于局部给药。组 合物中使用的抑制剂以有效量存在。根据使用的抑制剂的类型，有效量是降低或抑制 AP-1衔接物复合物亚基或与AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl 13A的 表达或活性的量，或降低或抑制AP-1衔接物复合物亚基或AP-1复合物与同AP-1复合 物相互作用的驱动蛋白之间的相互作用的量。根据优选实施方案，当抑制剂是核酸时，组合物中使用的核酸以有效量存在， 例如在组合物总重量的0.00001%到10%、优选从0.0003%到3% (w/w)的范围内。本申请中使用的术语“有效量”是能够明显减少黑色素合成的本发明使用的抑 制剂的量。在优选实施方案中，本申请中使用的术语“有效量”是能够明显减少黑色素 合成的本发明使用的核酸的量。具体来说，这种减少可以引起皮肤颜色的可见的变化。 这种减少可以是例如未治疗细胞中存在的黑色素的量的5%、10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%或50%。它可以通过在实施例中描述的或本技术领域的专业人 员已知的方法之一来测量。本发明的组合物可以包含几种相同或不同类型并具有相同或不同靶的抑制剂。 它可以包括AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、或与AP-1衔接物复合物相互作用的驱动 蛋白、特别是Kifll3A的抑制剂、或AP-1衔接物复合物亚基或AP-1复合物与同AP-1复 合物相互作用的驱动蛋白之间的相互作用的抑制剂。它可以包括具有类似性质(例如仅 为核酸)或不同性质(例如适配体、抗体和/或核酸)的抑制剂。在优选实施方案中， 该组合物可以包括几种核酸，所述核酸含有本申请中所述的能够与编码AP-1衔接物复合 物的亚基或编码同AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的基因或 mRNA特异性杂交并能够降低或抑制该蛋白的表达的序列。它也可以包含靶向AP-1的 相同亚基或AP-1的不同亚基、或与AP-1相互作用的相同驱动蛋白或与AP-1相互作用 的不同驱动蛋白的几种抑制性核酸的组合。在具体实施方案中，组合物可以包括几种核 酸，所述核酸含有本申请中所述的能够与编码AP-1衔接物复合物亚基的基因或mRNA特 异性杂交并能够降低或抑制该蛋白的表达的序列。它也可以包含靶向AP-1的相同亚基或 AP-1的不同亚基的几种抑制性核酸的组合。在另一个具体实施方案中，组合物可以包括几种核酸，所述核酸含有本申请中所述的能够与编码同AP-1衔接物复合物相互作用的驱 动蛋白、特别是Kifll3A的基因或mRNA特异性杂交并能够降低或抑制该蛋白的表达的 序列。它也可以包含靶向与AP-1相互作用的相同驱动蛋白或与AP-1相互作用的不同驱 动蛋白的几种抑制性核酸的组合。本发明的组合物还可以包含旨在加强所需效应的一种或多种附加的活性物质， 例如鞣花酸；熊果苷；间苯二酚；维生素C;泛酸化物；曲酸；胎盘提取物；直接或 间接干扰促黑激素(MSH)、其受体或促肾上腺皮质激素(ACTH)的分子；多元醇例如甘 油、乙二醇或丙二醇；维生素；角质溶解剂和/或表皮剥脱剂例如水杨酸；a-羟基酸 例如乳酸或苹果酸；抗坏血酸；视黄酸；视黄醛；视黄醇；棕榈酸化物、丙酸化物或乙 酸化物；抗糖基化和/或抗氧化剂例如生育酚、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺 素焦磷酸、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、腺苷三磷酸；抗炎 性剂；安抚剂及其混合物；化学或物理滤阳光剂和脱氧核糖核酸或核糖核酸，及其衍生 物。本发明的组合物可以以通常用于局部给药的任何盖仑制剂的形式出现，特别是 水性水醇或油性溶液、水包油或油包水或多重乳液、水性或油性凝胶、液体、糊剂或固 体无水产物、油在聚合物相中的分散体例如纳球和纳囊的形式，或更好的是在法国专利 FR 2534487中描述的离子性和/或非离子性脂质囊泡的形式。具体来说，本发明的组合物可以包含囊封在脂质体中的本申请所述的至少一种 抑制剂，优选为抑制性核酸。按照本发明，“脂质体”是指人工制造的由磷脂层构成的小囊泡，彼此由水性 隔室彼此隔开。它们具有与细胞膜非常近似的结构，使它们能够彼此合并并同时释放出 它们所包含的活性成分。本发明使用的脂质体可以是多室脂质体或MLV(多室囊泡)、 小单室脂质体或SUV (小单室囊泡)或大单室脂质体或LUV (大单室囊泡)。脂质体也 可以是非离子性脂质体，其壁不由磷脂构成而是由非离子性脂类构成。本发明的组合物可以或多或少是流体，并具有白色或有色霜剂、润发油、乳 液、洗液、浆液、糊剂或泡沫的外观。任选地，它可以气溶胶的形式施加到皮肤。它也 可以粉状或非粉状固体形式提供，例如以小棒形式。它也可以提供成用于在面部或手部 区域局部施用的贴片、笔、刷和涂敷器。它可以用作皮肤护理产品和/或化妆产品。正如预期的，本发明的组合物也可以包含皮肤病学和美容领域中常用的佐剂， 例如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活性成分、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香 水、填充剂、滤光剂、色素、气味吸收剂和着色剂。这些不同佐剂的量是在相关领域中 传统使用的量。这些佐剂根据其性质可以被导入到油相、水相、脂质囊泡和/或纳粒 中。当本发明的美容用或皮肤病学组合物是乳液时，油相与组合物的总重量相比的 比例可以在5%到80重量％、优选5%到50重量％的范围内。在乳液形式的组合物中使 用的油、乳化剂和辅助乳化剂选自在相关领域中传统使用的。组合物中存在的乳化剂和 辅助乳化剂相比于组合物总重量的比例，在0.3%到30重量％、优选0.5%到20重量％的 范围内。可以与本发明的抑制剂、特别是与本发明的核酸组合使用的油的实例，包括矿物油例如矿脂；植物来源的油例如鳄梨油或大豆油；动物来源的油例如羊毛脂；合成油 例如全氢化角鲨烯；硅化油例如环甲基硅酮和氟化油例如全氟聚醚。还可以用作脂肪类 物质的是脂肪醇例如鲸蜡醇、脂肪酸或蜡例如巴西棕榈蜡或地蜡。可以与本发明的核酸组合使用的乳化剂和辅助乳化剂的实例包括脂肪酸与聚乙 二醇的酯例如PEG-20硬脂酸酯，和脂肪酸与甘油的酯例如硬脂酸甘油酯。可以与本发明的抑制剂、特别是核酸组合使用的亲水性胶凝剂的实例包括羧基 乙烯基聚合物(卡波姆)、丙烯酸共聚物例如丙烯酸/烷基丙烯酸共聚物、聚丙烯酰胺、 多糖、天然树胶和粘土。作为亲脂性胶凝剂，可以使用例如改性粘土例如有机膨润土、 脂肪酸的金属盐、疏水二氧化硅或聚乙烯。本发明还涉及本发明的组合物作为美容剂的用途。在优选实施方案中，美容剂 是脱色素剂。本发明涉及药物或美容组合物在治疗色素性病症中的应用，所述组合物至少含 有AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、与AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白特别是 Kifll3A的抑制剂、或AP-1衔接物复合物亚基或AP-1复合物与同AP-1复合物相互作 用的驱动蛋白之间相互作用的抑制剂。根据具体实施方案，抑制剂可以是小分子、适配 体、抗体、核酸或显性失活肽，但不限于此。在优选实施方案中，本发明涉及含有至少一种核酸的药物组合物在治疗色素性 病症中的应用，所述核酸包含能够与编码AP-1衔接物复合物亚基或编码与AP-1衔接物 复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifll3A的基因或mRNA特异性杂交并能够降低或 抑制该蛋白的表达的序列。在具体方式中，本发明涉及含有至少一种核酸的药物组合物 在治疗色素性病症中的应用，所述核酸包含能够与编码AP-1衔接物复合物亚基的基因或 mRNA特异性杂交并能够降低或抑制该蛋白的表达的序列。在另一种具体方式中，本发 明涉及含有至少一种核酸的药物组合物在治疗色素性病症中的应用，所述核酸包含能够 与编码同AP-1衔接物复合物相互作用的驱动蛋白、特别是Kifl 13A的基因或mRNA特异 性杂交并能够降低或抑制该蛋白的表达的序列。本发明还涉及本发明的药物组合物在制备治疗或预防色素性病症的药物中的应用。本发明的另一个主题内容是用于人类皮肤的脱色素和/或漂白或者治疗或预防 色素性病症的美容或药物方法，所述方法在于向待脱色素的皮肤施加本发明的美容或药 物组合物。待治疗的色素性病症可以是色素沉着过度或色素沉着不足。局部色素沉着过度 可以由某些黑素细胞失调引起，其特征为黑色素积累。待治疗的色素性病症可以是色素 沉着过度，例如特发性黑斑病(与妊娠或服用口服避孕药无关)，黑斑病(也称为黄褐斑 或妊娠斑)，光化学着色斑(也称为老年性着色斑、老年斑、晒斑、衰老斑或色斑)，来 自粉刺的色素分泌后效，由擦伤、烧伤、瘢痕、皮肤病和/或接触性过敏、草地皮炎引 起的炎症后色素沉着，由毒藤引起的色素沉着，雀斑，痣例如先天性巨痣、贝克痣或斯 皮茨痣。色素沉着过度可以是遗传决定的或代谢或药物相关起源的。它们可以由事故 例如光过敏或病变后瘢痕形成引起。色素性病症也可以表现为色素沉着不足，例如白癜 风。在优选实施方案中，待治疗的色素性病症是色素沉着过度。优选，色素沉着过度是黑斑病、特发性黑斑病或老年性着色斑。在色素沉着过度的情况下，治疗的目的是对色素沉着过度的区域脱色素，从而 减少或抑制与这些具体的色素性病症相伴的可见症状。在色素沉着不足的情况下，治疗的目的可以是通过使其余的色素沉着区域脱色 素而使皮肤的颜色统一。本发明的目的，在色素沉着过度的情况下是避免色素沉着过度区域的外观，在 色素沉着不足的情况下是避免皮肤颜色不一致的外观。下面实施例的提出是作为说明而不是限制性的。
实施例材料与方法细胞、抗体和试剂将人类黑素细胞系MNT-1维持在以前描述过的培养中(Raposo等，2001)。本实施例中使用的抗体如下所列-抗微管蛋白兔多克隆抗体(ab6046，Abeam )；-兔抗ii1A(AP-1的亚基)多克隆抗体(Dr丄intonTraub，匹兹堡大学)；-小鼠抗衔接蛋白单克隆抗体(克隆100/3;SIGMA )；-小鼠抗Tyrpl单克隆抗体(酪氨酸酶相关蛋白-1)，其得自于培养物 TA99 (Mel-5)(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection), Manassas, VA，USA)的上清液；-抗酪氨酸酶多克隆抗体(abl5175，Abeam )；-抗Pmel 17 单克隆抗体(HMB50，Labvision )；-兔抗Kifl3A 多克隆抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery, USA)；-抗辣根过氧化物酶(HRP)兔多克隆和小鼠单克隆抗体 (Jackson Immunoresearch )；以及-与德克萨斯红偶联的兔抗小鼠抗体(Invitrogen )。本实施例中使用的抗体之外的试剂如下所列-与胶体金粒子偶联的蛋白-A(荷兰Utrecht大学细胞显微术中心)；-蛋白G 琼脂糖(Invitrogen ,目录号 15920-010)；-用于western 印迹的试剂盒，其含有 NuPAGE Bis-Tris 4-12%凝胶、NuPAGE 3-8% Tris-乙酸凝胶、MES-SDS迁移和转移缓冲液(Invitrogen )；-ECL试剂盒“western印迹检测试剂”(Amersham )，用于显现PVDF膜 (Millipore )上的 HRP 活性；-聚甲醛(PFA)和牛血清白蛋白(BSA)( Sigma )；-皂苷(CarloErba Reagents )；以及-用于固定荧光显微镜盖玻片的介质，带有DAPI的“ProLong Gold抗衰减试 齐[J (Gold Antifade Reagent) ” (Invitrogen )。
干扰RNA的序列SEQ ID No. 1 有义 Kifl3A siRNAGGCGGGUAGCGAAAGAGUA dTdTSEQ ID No.2 反义 Kifl3A siRNA UACUCUUUCGCUACCCGCCdAdG SEQ ID No.5 有义 AP-1 u 1A siRNAGGCAUCAAGUAUCGGAAGA dTdTSEQ ID No.6 反义 AP-1 u 1A siRNAUCUUCCGAUACUUGAUGCC dTdTSEQ ID No.7 有义 AP-3 ( 3 3A) siRNAGGCUGAUCUUGAAGGUUUA dTdTSEQ ID No.8 反义 AP-3 ( 3 3A) siRNAUAAACCUUCAAGAUCAGCC dTdTSEQ ID No.9 有义对照 siRNA UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdTSEQ ID No. 10 反义对照 siRNA ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdTSEQ ID No. 19 有义、-衔接蛋白 siRNAACCGAAUUAAGAAAGUGGU dTdTSEQ ID No.20 反义 Y -衔接蛋白 siRNAACCACUUUCUUAAUUCGGU dTdTRNA 干扰将IX 106个细胞接种到10cm培养皿中两天，然后用预热的PBS清洗两次，然 后在培养箱中在4ml OptiMem培养基(Invitrogen )中培养40分钟。 通过将10 i! 1 20 i! M siRNA与840 y 1 OptiMem培养基混合并将该混合物在室温 下温育20分钟，获得溶液A。通过将50 u 1 Oligofectamine (Invitrogen )与巧0 y 1
OptiMem培养基混合并将该混合物在室温下温育20分钟，获得溶液B。然后将溶液A和B混合并在室温下放置20分钟。然后将该混合物沉积在已经 在培养箱中保持4小时的细胞上。然后向细胞加入5ml含有40%胎牛血清(FCS)的完全 培养基。24小时后，回收细胞并以1.5X105个细胞/孔的浓度接种到6孔板中。第二 天通过调整体积重复该同样流程。Western 印迹在RNA干扰后，将细胞用PBS清洗两次，然后将每个孔用200 iU裂解缓冲液 (50mM Tris, 150mMNaCl, 10mM EDTA, 1% Triton, 蛋白酶抑制剂，pH 8)在冰上
温育15分钟。然后将细胞刮掉，离心(15,000rpm，4°C )，并收集上清液。通过BCA蛋白 分析试剂盒(Pierce )测量总蛋白量。将10gm每种上清液上样到凝胶上，在200V下进 行迁移35分钟。然后在30V下用1小时将凝胶转移到PVDF膜(Millipore )。然后将 膜用PBS/0.1% Tween/5% BSA缓冲液在室温下饱和1小时，与在WB缓冲液(PBS/0.1% Tween)中稀释的第一抗体温育45分钟，用WB缓冲液清洗3次，每次10分钟，与在WB 缓冲液中稀释的相应的HRP偶联的第二抗体温育45分钟，在WB缓冲液中清洗3次，每 次10分钟。然后使用ECL试剂盒(western印迹检测试剂)(Amersham )显示HRP活 性。荧光显微术将事先接种在玻璃盖玻片上的细胞(0.5X105个细胞/盖玻片)用预热的PBS清 洗两次，然后在PBS/4%PFA溶液中固定10分钟。在室温下用PBS清洗两次后，通过用 50mM Glycine/PBS处理10分钟来中和未反应的过量PFA。然后用添加有2mg/ml BSA的 PBS进行两次各3分钟的清洗，将非特异性结合位点饱和，并用通透化缓冲液(PBS/2% BSA/0.05%皂苷)使细胞变得可通透。然后将盖玻片与25 iU在通透化缓冲液中稀释的第一抗体在室温下接触45分钟，通过用通透化缓冲液进行两次各3分钟的清洗除去过量 抗体。然后将盖玻片与25 u 1在通透化缓冲液中稀释的第二抗体在室温下温育45分钟。在用通透化缓冲液进行两次各3分钟的清洗并接着用PBS清洗一次后，用15 y 1 固定介质(含有DAPI的ProLong Gold抗衰减试剂，Invitrogen )将盖玻片固定在显
微镜载玻片上，以减弱观察时荧光的损失。免疫沉淀将黑素细胞在75cm2烧瓶中培养至合生，然后用裂解缓冲液(50mM Tris， 150mMNaCl，10mM EDTA, 1% Triton, 蛋白酶抑制剂，pH 7.3)在 4°C下裂解 20 分 钟。然后将细胞刮掉，离心(15,000rpm，4°C)，收集上清液。将用蛋白G琼脂糖偶联 的珠子在裂解缓冲液中清洗，并将20ml这样的珠子与裂解液在4°C下在旋转下温育1小 时。然后将裂解液以4,000rpm离心并收集上清液，将上清液与事先已经与1 P g兔抗体 (Kifl3A对照)或小鼠抗CD9抗体(AP-1 y -衔接蛋白对照)温育1小时的清洗过的珠子 温育。然后通过以4,000rpm离心裂解液，并使上清液与20 u 1清洗过的珠子接触来进行 免疫沉淀，其中所述珠子事先在4°C下在旋转下与1 y g兔抗体(Kifl3a对照)、抗Kifl3a 抗体(Kifl3a)、小鼠抗CD9抗体(AP_1 Y _衔接蛋白对照)或小鼠抗衔接蛋白抗体 (AP-1Y-衔接蛋白)温育过2小时。然后将裂解液以4,000rpm离心，收集上清液并上 样在凝胶上，用于western印迹分析。电子显微术将事先接种在6孔板中并用“对照” siRNA和siRNA-Kifl3A或siRNA- y 1A处
理过的黑素细胞，用0.2M pH 7.4磷酸缓冲液中的2% PFA与2%戊二醛的混合物(常规 显微术)或2% PFA与0.5%戊二醛的混合物(免疫染色)，在室温下固定4小时。常规显微术在0.2M 二甲砷酸钠缓冲液中清洗几次后，将细胞用2%锇酸 (0s04)溶液固定45分钟。在用蒸馏水漂洗后，将细胞用浓度逐渐增加的乙醇脱水，然 后包被在Epon812树脂中。在60°C下聚合48小时后，获取超薄切片，用4%乙酸双氧 铀示差5分钟，然后在电子显微镜(Philips CM 120，FEI Company )下观察。照片使用 KeenView相机(SIS ，德国)获取。免疫染色在含有0.1M甘氨酸的0.2M磷酸缓冲液中清洗几次后，按照以前在 Raposo等(1997)的文献中所描述的，对细胞进行制备以用于超薄冷冻切片。简单来说，首先将细胞沉淀包被在10%明胶中。在4°C固化后，切出1_3的 块，并在2.3M蔗糖中浸渍2小时。将细胞块冷冻在其承载物上，使用超薄冷冻切片机 (Leica ，奥地利)获取超薄冷冻切片。将回收在电子显微镜格网上的切片用抗Tyrpl和 抗Pmell7抗体免疫染色。这些抗体用与胶体金粒子偶联的蛋白A进行可视化。将切片 示差并包被在乙酸双氧铀和甲基纤维素的混合物中，然后在电子显微镜(Philips CM120， FEI Company )下观察。照片使用KeenView相机(SIS ，德国)获取。黑饩素的定量在RNA干扰后，将细胞在PBS中清洗两次，并与150 u 1黑色素缓冲液(50mM Tris, 2mM EDTA, 150mMNaCl, 蛋白酶抑制剂，pH 7.4)温育。然后将它们刮去并
收集在单一级份中，然后以最大强度超声20秒。然后取10iU来定量蛋白(使用BCA蛋白分析试剂盒，Pierce)，并取200iig蛋白，在4°C下以15,000rpm离心15分钟。除 去上清液，将沉淀用500 y 1乙醇/乙醚(1 1)溶液洗涤。最后，将沉淀用230 u 1 2M NaOh/2()%DMSO溶液在55°C下溶解。溶解后，取200 y 1以便在492nm处测量光密度。白饩细胞的定量使用落射荧光显微镜在被制备用于免疫荧光的细胞上执行定量。在相反差中观 察细胞，对着色的成熟黑素体的存在(黑色)或不存在(白色)进行定量。实施例1在用siRNA-AP-1 ( y 1A)、siRNA_Kifl3A 和 siRNA-AP-3 ( 3 3A)转染的黑素细
胞的细胞裂解液上进行的Western印迹实验，能够显示Kifl3A的表达不受AP_1或AP_3 失活的破坏(图1A)。另一方面，在用siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞中，Kifl3A的表 达被完全抑制(图1A和1C)，而AP-1的y 1A亚基的表达不被破坏。因此，这些结果 显示了 siRNA使黑素细胞中该蛋白失活的有效性和特异性。此外，在黑素细胞上执行的免疫沉淀实验，能够显示Kifl3A蛋白与衔接蛋 白AP-1亚基共沉淀，因此以前在非黑素细胞细胞系中观察到的Kifl3A与AP-1之间的相 互作用(Nakagawa等，2000)，也存在于黑素细胞细胞系中(图1B)。通过在492nm波长处测量细胞裂解液的光密度，确定了在用siRNA_Kifl3A转染 的黑素细胞中的黑色素与用siRNA对照转染的细胞中存在的量的相对量(图2)。图2中 给出的结果显示，使用siRNA_Kifl3A与用siRNA对照转染的细胞相比，能够获得合成的 黑色素的量的约40%的降低。对于用siRNA_Kifl3A或siRNA对照转染的黑素细胞，在电子显微术下进行了观 察，观察在常规电子显微术下(图3)或用抗Tyrpl抗体进行免疫染色(数据未显示)。常规电子显微术实验可以显示，用siRNA对照转染的黑素细胞含有许多具有大 量黑色素的黑素体(图3上的黑色)。另一方面，用siRNA_Kifl3A转染的黑素细胞不含 或含有很少色素。在用siRNA对照转染的细胞中，免疫染色显示出许多正在浓缩Tyrpl蛋白的成熟 阶段III或IV的黑素体。另一方面，使用用siRNA_Kifl3A转染的细胞，没有可见的成 熟黑素体，Tyrpl酶分散在具有内体特征的囊泡状结构中。因此，驱动蛋Kifl3A的失活扰乱了前黑色素体中黑素生成酶系的转移，从而阻 断了这些细胞器的成熟，结果这些细胞器不能确保黑色素的合成。Mrk这些实验获得的结果首先使得能够观察到特定siRNA的使用使黑素细胞中的驱 动蛋白Kifl3A失活。获得的结果还显示，使用驱动蛋白Kifl3A的特异性siRNA，能够显著降低-黑素细胞中产生的黑色素的量_含有着色的成熟黑素体的黑素细胞的量，以及-黑素细胞中成熟黑素体(第III或IV阶段)的比例。因此，通过这些实验，本发明人显示了与AP-1相互作用的驱动蛋白、特别是驱 动蛋白Kifl3A的特异性siRNA对黑色素的生产具有显著影响，因此能够有效用作脱色素 剂。
实施例2在转染的黑素细胞上进行的western印迹实验(图4)能够显示，在用 siRNA-u 1A转染的黑素细胞中，与siRNA对照转染的黑素细胞相比，AP_1的ylA亚 基的表达大幅降低。这种表达的下降也包括AP-1的另一个亚基衔接蛋白表达的降 低，结果使AP-1衔接物复合物去稳定。因此，这些结果证实了仅仅失活AP-1的一个亚 基就足以使该复合物完全去稳定。此外，以意外的方式观察到在用siRNA-ylA转染因 此AP-1缺陷的细胞中，黑素生成的关键酶酪氨酸酶的表达大幅降低，Tyrp-1酶的表达也 是同样，尽管强度较弱。因此，这些结果显示，仅仅一个AP-1亚基的失活就足以使衔接物复合物去稳定 和失活，并且也扰乱黑素生成主要酶的表达。通过在光学显微镜(相差)下直接计数，对转染过的黑素细胞中的白色细胞、 即不含着色的成熟黑素体的细胞进行了定量(图5A和5B)，并通过在492nm波长处测 量细胞裂解液的光密度，确定了这些细胞中的黑色素与用siRNA对照转染的细胞中存在 的量相比的百分率(图6)。 图5A、5B和6显示了在用siRNA对照、siRNA-1 y A、 siRNA- y -衔接蛋白或siRNA-1 y A与siRNA- y -衔接蛋白的组合转染的黑素细胞上获 得的结果。图5A和5B中给出的结果显示，使用siRNA-1 y A、siRNA-衔接蛋白 (图5A)或同时使用两者(图5B)，与用siRNA对照转染的细胞相比，能够显著增加被 转染的黑素细胞中白色细胞的比例。对于单独用siRNA-1 y A转染的细胞来说，这种增 加达到24%。这些结果得到图6中给出的结果的证实，在图6中显示，siRNA-luA、 siRNA-衔接蛋白或两者同时转染，与用siRNA对照转染的细胞相比，能够显著降低 细胞中合成的黑色素的量。在使用siRNA-1 u A转染的细胞中，这种降低能够达到40% 以上。因此，这些结果显示，通过一个或多个siRNA使AP-1复合物的一个或多个亚基 失活，能够显著降低黑素细胞中黑色素的合成。对于用siRNA-y 1A或siRNA对照转染的黑素细胞，在电子显微术下进行了观 察，观察在常规电子显微术下(图7)或用抗Tyrpl抗体进行免疫染色(数据未显示)。使用常规电子显微术的实验可以显示，用siRNA对照转染的黑素细胞含有许多 具有大量黑色素的黑素体(图7上的黑色)。另一方面，用siRNA-P1A转染的黑素细胞 不含或含有很少色素。在用siRNA对照转染的细胞中，免疫染色显示出许多正在浓缩Tyrpl蛋白的成熟 阶段III或IV的黑素体。另一方面，用siRNA-P1A转染、因此其中AP-1衔接物复合 物被失活的细胞，仅含有不成熟的阶段I或II的黑素体。在这些细胞中没有可见的成熟 黑素体。Tyrpl酶总是通过抗体检测，但是仅仅存在于具有内体特征并缺乏色素的囊泡状 结构中。因此，这些观察表明，AP-1复合物的失活扰乱了前黑色素体中黑素生成酶系的 转移，从而阻断了这些细胞器的成熟，结果这些细胞器不能确保黑色素的合成。Mrk这些实验获得的结果首先使得能够观察到特定siRNA的使用使黑素细胞中的 AP-1复合物失活。此外，显示了仅仅一个AP-1衔接物复合物亚基的失活就足以使所述复合物去稳定并因此失活。获得的结果还显示，使用AP-1衔接物复合物亚基的特异性siRNA，能够显著降 低-黑素细胞中产生的黑色素的量，_含有着色的成熟黑素体的黑素细胞的量，以及-黑素细胞中成熟黑素体(第III或IV阶段)的比例。因此，通过这些实验，本发明人显示了 AP-1衔接物复合物亚基的特异性siRNA 对黑色素的生产具有显著影响，因此能够有效用作脱色素剂。参考文献Ausubel 等，1995，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing and Wiley-Interscience.Braun 等，2007，Mol.Biol.Cell，18，4921-4931.M.Egholm 等，1992，J.Am.Chem.Soc, 114，1895-1897.Fanning和Symonds，2006，《通向药物的RNA，实验药物学手册》(RNA Towards Medicine, Handbook of Experimental Pharmacology)，ed.Springer.Kumar 等，1993，Microbiol.Mol.Biol.Rev，62，1415-1434.Maniatis 等，l982，《分子克隆实验指南》(Molecular cloning，Alaboratory Manual)，Cold Spring Harbor.Nakagawa 等，2000，Cell, 103，569-581.Osborne等，作为治疗和诊断试剂的适体问题与前景(Aptamers as therapeutic and diagnostic reagents problems and prospects)，CurrOpin Chem Biol. 1997Jun ； 1(1): 5-9Raposo等，1997，《实验免疫学手册》，“超薄冷冻切片的免疫金标记在免 疫学中的应用 ” (Immunogold labeling of ultrathin cryosections application in immunology, In: Handbook of Exp.Immunol) vol.4, L.A.Herzenberg, D.Weir, L.A.Herzenberg 禾口 C.Blackwell 主编，Cambridge, MA: Blackwell Science, Inc., 1-11Raposo 等，2001，J.Cell Biol.152, 809-824.Sambrook 等，1989，《分子克隆实验指南》(Molecular cloning，Alaboratory Manual)，Cold Spring Harbor.Seiji 等，1963，Nature, Mar 16 ； 197 1082-4.Theos 等，2005，Mol.Biol.Cell，16，5356-5372.VanDenBossche 等，2006，Traffic, 7，769-778.
权利要求
1.一种药物或美容组合物，其至少包含驱动蛋白Kifl3A的抑制剂、AP-I衔接物复合 物亚基的抑制剂、和/或AP-I衔接物复合物亚基或AP-I复合物与驱动蛋白Kifl3A之间 的相互作用的抑制剂。
2.权利要求1的组合物，其特征在于所述抑制剂是驱动蛋白Kifl3A的抑制剂。
3.权利要求1的组合物，其特征在于所述抑制剂是AP-I衔接物复合物亚基的抑制剂。
4.权利要求1的组合物，其特征在于所述抑制剂是AP-I衔接物复合物亚基或AP-I 复合物与驱动蛋白Kifl3A之间的相互作用的抑制剂。
5.权利要求1到4任一项的组合物，其特征在于所述抑制剂是小分子、适配体、抗 体、核酸或显性失活肽。
6.权利要求1到5任一项的组合物，其特征在于所述抑制剂是适配体、抗体、核酸或 显性失活肽。
7.权利要求1到6任一项的组合物，其特征在于所述抑制剂是核酸，所述核酸包含 能够与编码AP-I衔接物复合物的亚基或编码驱动蛋白Kifl3A的基因或mRNA特异性杂 交、并能够降低或抑制所述蛋白表达的序列。
8.权利要求7的组合物，其特征在于所述核酸是反义寡核苷酸或iRNA，优选为 siRNA。
9.权利要求5到8的组合物，其特征在于所述核酸具有从15到50个核苷酸、优选从 15到30个核苷酸的序列。
10.权利要求5到9任一项的组合物，其特征在于所述核酸包含选自序列SEQID No 1至Ij 6禾口 11至Ij 24的 歹|J。
11.权利要求1到10任一项的组合物，其特征在于其还包含一种或多种其他活性物 质，所述一种或多种其他活性物质优选自鞣花酸；熊果苷；间苯二酚；维生素C;泛酸 化物；曲酸；胎盘提取物；直接或间接干扰促黑激素(MSH)、其受体或促肾上腺皮质 激素(ACTH)的分子；多元醇，例如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素；角质溶解剂和/ 或表皮剥脱剂，例如水杨酸；α-羟基酸，例如乳酸或苹果酸；抗坏血酸；视黄酸；视 黄醛；视黄醇；棕榈酸化物、丙酸化物或乙酸化物；抗糖基化和/或抗氧化剂例如生育 酚、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨 酸、苯丙氨酸、吡哆醇、腺苷三磷酸；抗炎剂；安抚剂及其混合物；化学或物理滤阳光 剂和脱氧核糖核酸或核糖核酸，及其衍生物。
12.权利要求1到11任一项的组合物，其特征在于其适合于通过局部途径给药。
13.权利要求1到12任一项的药物组合物在制备治疗或预防色素性病症的药物中的应用。
14.权利要求13的应用，其特征在于所述色素性病症是色素沉着过度。
15.权利要求1到12任一项的组合物作为美容剂的应用。
16.权利要求15的应用，其特征在于所述美容剂是脱色素剂。
全文摘要
本发明涉及新的药物或美容组合物，其至少包含AP-1衔接物复合物亚基的抑制剂、与AP-1相互作用的驱动蛋白特别是Kif13A的抑制剂、或AP-1衔接物复合物亚基与所述驱动蛋白之间的相互作用的抑制剂，以及所述药物或美容组合物在制造用于治疗色素性病症和作为脱色素剂的药物中的用途。
文档编号C12N15/113GK102014859SQ200980114392
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月21日 优先权日2008年4月22日
发明者伊尔瑟·赫贝恩, 塞德里克·德勒瓦, 格拉萨·拉波索, 达妮埃尔·滕萨 申请人:法国国家科学研究中心, 法国居里学院