专利名称：使用酶促反应和偶联反应的肽合成的制作方法
使用酶促反应和偶联反应的肽合成本发明涉及用于酶促合成肽的方法。肽(尤其是寡肽)具有许多应用，例如用作药物、食物或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。就本发明的目的而言，肽表示两个或更多个氨基酸的任何链。就本发明的目的而言，“寡肽”表示基于2-200个氨基酸、尤其基于2-100个氨基酸、更尤其基于2-50个氨基酸的肽，优选地为2-200个氨基酸、更优选地为2-100或2-50个氨基酸的任何线性链。术语 “多肽”用于表示与针对寡肽所规定的数量相比基于更大数量的氨基酸的肽。化学-酶促肽合成就本发明的目的而言被定义为其中一个或多个肽键通过酶促偶联反应形成的肽合成，其具有优于化学肽合成的若干优点。例如，由于不需要或仅需要有限的氨基酸侧链保护，在大规模生产情况下的成本价格更低。另外，该方法对环境更加友好。例如，不需要化学计量用量的毒性化学试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(EDCI)。另外，这类方法可以使用更少的有机溶剂进行。另外，酶催化的偶联没有外消旋化(见例如 kwald 和 H. -D. Jakubke, "Peptides =Chemistry and Biology”，第 1 次重印， Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002，第250页)，导致更纯的产物和/或更容易的分离。对化学-酶促偶联方法而言，有两种产生肽键的途径。在所谓的热力学(或平衡控制的)途径中，羧基组件(即要在其C-端偶联的组件)带有游离的羧酸官能度，而在动力学控制的途径中使用活性羧基组件，例如主要的η-烷基酯。热力学途径具有三种主要的缺点i)平衡通常位于肽键切割一侧，从而偶联产率较低；ii)通常需要大量酶；iii)反应速率通常非常低。在动力学控制的途径中，需要烷基酯作为起始材料，但是需要少得多的酶，反应时间显著更短，并且最重要的是，可获得的最大产率通常显著更高。因此对工业应用而言，基于动力学途径(即使用活化的羧基组件) 的酶促肽合成概念是最有吸引力的(见例如N. Sewald and H. -D. Jakubke, in :“P印tides Chemistry and Biology，，，第 1 次重印，Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002，第 4· 6· 2 节)。化学-酶促肽合成可以以C — N端方向或者以N — C端方向进行，但是也可以包括下述片段的酶促偶联，所述片段单独地使用化学合成被合成，或者通过化学和化学-酶促偶联步骤的组合被合成。Chen et al.描述了在“低水性”(low aqueous)有机溶剂中使用在所述有机溶剂中有活性并且稳定的蛋白酶的偶联(J. Org. Chem. 1992，57，6960-65， Biomed. Biochim. Acta 1991，50，181,Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991，1,445)。在这些出版物中描述的方法的缺点是在低水性条件下几乎没有一种酶是有活性且稳定的，并且酶具有有限的底物范围。因此，通常需要长的反应时间和大幅过量的氨基酸或肽亲核体。有时在肽中的其他位置上仍然存在一些水解，并且通常转酰氨基反应发生在片段之一中现存的肽键上(即现存肽键之一上氨基酸或肽亲核体的酶催化的亲核攻击)。因此，产率有时较低。另外，产物的纯化通常是困难的。
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另一种途径是所谓的“底物模拟物”，如F. Bordusa et al在Current Protein and Peptide Science 2002，3，159-180中综述。在这种途径中，C-活化的氨基酸或肽具有酯片段，所述酯片段与特定氨基酸相似至下述程度对所述特定氨基酸选择性的酶迅速地与带有该酯片段的任何氨基酸反应。一个良好的例子是使用如Bordusa et al.所发现的4_胍基苯基(Gp)，所述Gp与Arg相似至下述程度在水解特性方面对Arg-X序列(X代表任何蛋白原性氨基酸(proteinogenic amino acid))特异性的胰蛋白酶能够将几乎任何(带有Gp 酯的)C-末端与多种氨基酸和肽亲核体偶联。例如，M-Thormann et al在Biochem. 1999， 38,6056证明N-受保护的D-Ala-OGp能够偶联至多种氨基酸和肽亲核体。因此，D-氨基酸和非蛋白原性氨基酸也能够被高效并入，并且片段中不发生肽键水解，除非存在偶联酶对其特异性的肽键(例如对胰蛋白酶而言Arg-X键)。底物模拟物途径的缺点是底物模拟物 (例如Gp酯)需要费力的多步骤化学合成，这是难以规模化进行的，并且通常发生氨基酸的外消旋化；底物模拟物也是不稳定的，因此难以大规模操作，并且有时它们在水性溶液中的溶解度较低。在“OrganicLetters, 2001, Vol 3，No. 26，p4157_4159”中，Liu 和 Tam 报道了一种方法，其中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg被用于在1，3_丙二醇中和包含1-2. 5%水的1，4_丁二醇中催化某些N-端Boc-保护的氨基酸和未受保护的肽的C-端3-羟丙基酯或4-羟丁基酯的形成。另外描述了氨基酸(亮氨酸)或肽与获得的酯在反应介质(不同于发生酯形成的介质)中的酶促偶联。其中发生偶联的反应介质包含大量的水。在“Biotechnology and Bioengineering，1997，vol. 54，no. 3，p287_290，，中， Mitin et al.报道了一种方法，其中木瓜蛋白酶被用于在含有至少10wt%水的甘油中催化 N-端Boc和N-端Cbz保护的氨基酸和肽的C-端甘油酯的形成，以最大70%的产率得到酯。 由于木瓜蛋白酶的变性，使用含有少于10wt%水的溶液导致低得多的酯产率。另一种途径是使用“经活化的”酯如氨基甲酰基甲基(Cam)酯(例如T. Miyazawa et al. J. Chem. Soc.，Perkin Trans. 1，2002，390—395所述)或2，2，2-三氟乙基酉旨(如 A. Yan et al. Tetrahedron, 61, 2005, 5933-5941所述)。与“真实的”底物模拟物相比，这些酯通常更容易制备并且更稳定，但是仍然需要昂贵和对环境不友好的化学步骤。另外，这些酯的制备通常导致氨基酸的一些外消旋化。例如，可以通过用2-氯乙酰胺处理酰基供体的Cs 盐来制备Cam酯，并可以使用碳二亚胺化学法制备Tfe酯。通常使用便宜和容易获得的蛋白酶如木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶将Cam和Tfe酯与氨基酸或肽亲核体偶联。因此，也可以将D-氨基酸并入肽中(尚未并入ftx))。通常仍然需要用于肽合成和/或用于制备可用于肽合成的中间产物化合物的替代性方法。这类方法可例如提供另外的策略，所述策略提高肽合成中的灵活性和/或允许合成使用已知的策略不能或者难以获得的特定肽。例如，在可接受的时间内以良好的产率酶促偶联多种氨基酸仍然是一种挑战。因此，仍然需要下述经改进的策略，所述策略用于将蛋白原性以及非蛋白原性氨基酸(例如D-α-氨基酸、β-氨基酸、苯基甘氨酸、D0PA、 α -烷基化的氨基酸)或肽(其N-端氨基酸残基是任何这些氨基酸的残基)通过它们的 N-端氨基官能团与另一氨基酸或肽的C-端羧酸官能团偶联。另外，仍然需要下述经改进的技术，所述技术用于将蛋白原性以及非蛋白原性氨基酸(例如D-α-氨基酸、β-氨基酸、 苯基甘氨酸、D0PA、α -烷基化的氨基酸)或肽(其C-端氨基酸残基是任何这些氨基酸的
4残基)通过C-端羧基官能团与另一氨基酸或肽的N-端胺官能团偶联。另外，尤其需要下述经改进的技术，所述技术涉及通过N-端胺官能团使任何氨基酸或肽与空间受阻的氨基酸(例如缬氨酸或异亮氨酸)或C-端氨基酸残基是空间受阻的氨基酸(例如缬氨酸或异亮氨酸)的肽酶促偶联。另外，仍然需要对环境相对友好的、新的相对简单的方法。目前发现，通过以特定方式组合氨基酸或肽的经活化的C-端酯或经活化的C-端硫酯的酶促制备，以及所述经活化的酯或经活化的硫酯与另一氨基酸或肽的酶促偶联，可以提供此类方法。因此，本发明涉及用于酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下⑴和(ii)酶促制备酯或硫酯(i)N_端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z选自下组包含至少两个取代基的SP3-杂化的碳，所述取代基包含和SP3-杂化的碳直接连接的杂原子，和包含一个或两个取代基的SP2-杂化的碳，所述取代基包含和 SP2-杂化的碳直接连接的杂原子，酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中进行；和将制备得到的酯或硫酯与(任选地C-端受保护的)氨基酸或与(任选地C-端受保护的)肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少水的反应介质中合成肽。术语“C-端受保护的”在本文中被用于表示对C-端羧基提供保护基，一般基本上保护羧基免于同另一分子的氨基偶联。C-端保护基尤其可以是C-端酯，其中C-端羧基至少基本上被保护从而免于在使用的肽合成条件下同胺偶联。t-烷基通常被用作保护基。术语“N-端受保护的”在本文中被用于表示对N-端氨基提供保护基，一般至少基本上保护N-端氨基免于参与C-端羧基与N-端氨基的偶联。在本发明方法中制备的酯或硫酯可分别被称作“经活化的酯”或“经活化的硫酯”， 因为此类酯能够参与偶联反应。相反，可被用于制备经活化的酯的酯或游离的C-端羧酸不能够参与偶联，或至少在偶联反应中具有显著更低的反应性，例如少于在本发明方法中酶促制备的经活化的酯的反应性的一半，少于其反应性的十分之一，或少于其反应性的百分之一。尤其对通常难以偶联(具有低偶联率)的氨基酸、C-端氨基酸残基或N-端氨基酸残基而言，由于氨基酸或C-端氨基酸残基的活化，可以通过本发明的方法实现偶联速率的大幅提高。偶联氨基酸或氨基酸残基的困难的典型例子是D-氨基酸或其氨基酸残基和其他非蛋白原性氨基酸或其氨基酸残基。其他例子包括空间受阻的氨基酸，例如缬氨酸和异亮氨酸，或其氨基酸残基。酯或硫酯的酶促制备在下文中可分别称作酯化或硫酯化。所述术语包括下述情况，其中(硫)酯的制备涉及N-端受保护的氨基酸或肽C-端酯与(硫)醇的反应。更具体地，此类反应已知为(硫)酯交换反应。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点其提供了使用本发明方法偶联
5多种氨基酸或多种肽的可能性，所述氨基酸或肽中参与偶联反应的末端氨基酸残基有所差异，包括脯氨酸和非蛋白原性氨基酸或含有参与偶联的脯氨酸或非蛋白原性末端氨基酸残基的肽。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点经活化的(硫)酯以环境友好的方式(即不生产化学计量数量的废弃化合物)以高产率合成，而无外消旋化或其他副反应。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点其提供了在所述方法中使用的一种或多种酶的高稳定性和/或活性。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点经酶促制备的酯的水解程度较小(在实现(硫)酯制备和偶联的典型时间段内)，至少在若干实施方案中未观察到可检出的酯水解。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点经酶促制备的肽的水解程度较低，至少在若干实施方案中未观察到可检出的经酶促制备的肽的水解。在一个实施方案中，本发明的方法具有以下优点其提供了高的总体反应率，即从 N-受保护的氨基酸或肽起始化合物到经合成的肽的高转化率，导致用相对短的反应时间实现特定产率。本发明的方法尤其允许氨基酸或肽与另一氨基酸或肽偶联，而不需要偶联配偶体之一大幅过量，从而在相对较短的时间内以可接受的基于另一偶联配偶体的产率获得合成的肽。用于制备(经活化的)(硫)酯的N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽或N-端受保护的肽C-端酯与任选地C-端受保护的氨基酸或肽的摩尔比在2 1到1 3的范围内，尤其是1 1到1 2的范围内，优选地1 1到1 1.5 的范围内选择。在一个特定地优选的方法中，所述摩尔比在1 1到1 1.1的范围内。本发明的方法尤其具有以下优点已发现有可能酶促制备N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽的经活化的C-端酯或硫酯，尤其是N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽的C-端氨基甲酰基甲基(Cam)酯或C-端2，2，2-三氟乙基(Tfe)酯，作为化学-酶促肽合成的一部分。尤其出人意料地发现，可以使用蛋白酶或脂肪酶以高产率酶促制备Cam 和Tfe酯，甚至更好的是，使用蛋白酶或脂肪酶的活化步骤可以与使用蛋白酶的肽键形成步骤同时进行，以多于90%的产率得到缩合产物(要合成的肽)，而无可观的副反应，甚至使用等摩尔量的待偶联的氨基酸或肽时也是如此，即不需要过量的氨基酸或肽发挥亲核体的作用。还发现有可能合成肽而无可观的外消旋化，在“困难的”氨基酸如脯氨酸或非蛋白原性氨基酸例如D-氨基酸存在于待装配的肽键一侧或两侧的情况下也是如此。根据本发明的方法尤其提供了一种相对简单的方法，因为可能在所谓的“一锅法” 中进行(硫)酯化。在一锅法中发生(硫)酯化和偶联，这些反应之间不进行(所制备的酯或硫酯的)分离步骤。甚至可能通过从反应开始时将所有物质(例如待偶联的氨基酸或其酯和/或肽或其酯，醇/硫醇，溶剂和酶)包括在内来进行本发明的方法，这在以高产率在相对短时间内获得要合成的肽方面可以是特别有益的。因此，在本发明的一种尤其合适的一锅法中，酯或硫酯的制备在存在任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽时进行，所述氨基酸或肽要与所制备的酯或硫酯偶联。在本发明的又一个一锅法中，(硫)酯化和偶联可相继发生，即制备酯或硫酯后添
6加任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽。在本发明的又一个一锅法中，首先使用脂肪酶或酯酶进行(硫)酯的制备，之后添加酶(通常为蛋白酶)用于催化偶联反应。在催化偶联的酶对(硫)酯的制备有害的情况下可尤其遵循此类途径，所述情况例如因为所述酶对催化(硫)酯制备的酶的活性或稳定性具有不良影响。还可能使用这些一锅法的中间产物形式，例如初始时仅包括本发明方法中使用的一种或多种物质的部分，并且将剩余部分之后添加。尤其可以逐渐或逐步添加要与所制备的酯或硫酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽的部分。原则上，催化(硫)酯化的酶和催化偶联的酶可以相同，尤其是相同的脂肪酶、酯酶或蛋白酶。例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg或南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B可以被用于此类实施方案。已发现，对在相对短时间内获得所合成的肽而言尤其有利的是使用至少两种酶， 即至少一种选自脂肪酶和酯酶组的酶，和至少一种蛋白酶。我们认为在本发明的一锅法中， 脂肪酶或酯酶(主要)催化(硫)酯化且蛋白酶(主要)催化偶联反应。要被(硫)酯化的N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽原则上可以是任何 (蛋白原性或非蛋白原性的)氨基酸或以蛋白原性和/或非蛋白原性氨基酸为基础的任何肽。在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中对酯或硫酯的酶促制备而言，(i)N-端受保护的氨基酸或N-端受保护的肽与(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇反应。N-端受保护的氨基酸或肽尤其可以由式I的化合物表示。
R\ RB
OH
O
η此处P代表N-端保护基。合适的N-端保护基是可用于合成(寡)肽的N-保护基。这类基团是本领域技术人员已知的。合适的N-保护基的例子包括羰基型保护基，例如 ‘Cbz’(即苄氧羰基)、‘Boc’(即叔丁氧羰基)、‘For’(即甲酰基)、Fmoc (即9-芴基甲氧羰基)和‘PhAc，(即苯乙酰基)。可以分别使用酶P印tide Deformylase或PenG酰基酶将基团For或PhAc酶促引入和切割。化学切割方法是本领域中公知的。本文中η是至少为1的整数。η尤其可以至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、 至少为6、至少为8、至少为9或至少为10。η尤其可以是100或更小、75或更小、50或更小、 25或更小、20或更小、15或更小或10或更小，例如5或更小。每个Ra和每个Rb独立地表示H或有机片段，优选地为氨基酸侧链。因此，不要求 Ra在所有η个氨基酸单元中均相同。类似地，不要求Rb在所有η个氨基酸单元中均相同。在本发明的上下文中，“氨基酸侧链”表示任何蛋白原性(proteinogenic)或非蛋
7白原性的氨基酸侧链。氨基酸侧链中的反应性基团可以通过氨基酸侧链保护基保护，或者可以被脱保护。氨基酸侧链的合适保护基是本领域技术人员已知的。需要时尤其可以对酸性或碱性侧基的所有或部分提供保护基，从而改进氨基酸或肽的溶解度。蛋白原性氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸。蛋白原性氨基酸包括丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸。非蛋白质原氨基酸可尤其选自D-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA (3，4- 二羟基-L-苯丙氨酸)、β -氨基酸、4-氟-苯丙氨酸或α -烷基化的氨基酸。在一个特定的实施方案中，用于制备参与偶联反应的酯或硫酯的N-端受保护的氨基酸或肽是与要制备的(硫)酯不同的C-端酯，例如叔烷基酯或另一酯，其在肽合成的酶促偶联反应中一般不显示显著活性，或者显示至少比要制备的(硫)酯更低的活性。在此种情况下，(硫)酯的制备可以被称作(硫)酯交换。在要与待制备的醇或硫醇反应的化合物是酯的一个实施方案中，典型地其为上文所述氨基酸或肽的酯。因此，该酯可由式II表示
权利要求
1.用于酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯(i) N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇、或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z选自下组包含至少两个取代基的SP3-杂化的碳，所述取代基包含和SP3-杂化的碳直接连接的杂原子，和包含一个或两个取代基的 SP2-杂化的碳，所述取代基包含和SP2-杂化的碳直接连接的杂原子，酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少水的反应介质中进行；和将制备得到的酯或硫酯与任选地C-端受保护的氨基酸或与任选地C-端受保护的肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少水的反应介质中合成肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述偶联在存在用于催化所述酯或硫酯的制备的酶时进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备或所述偶联由至少一种选自脂肪酶、酯酶和蛋白酶的酶催化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用蛋白酶和选自脂肪酶和酯酶组的酶，其中至少这些酶之一催化所述酯或硫酯的制备，其他酶至少催化所述偶联。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述酯或硫酯的制备以及所述偶联均由选自脂肪酶、酯酶和蛋白酶组的单一酶催化。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中使用选自以下脂肪酶的组的脂肪酶， 所述脂肪酶来自假丝酵母，优选地来自南极假丝酵母，尤其是南极假丝酵母脂肪酶B。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自下组丝氨酸型羧肽酶，金属羧肽酶，半胱氨酸型羧肽酶，丝氨酸内肽酶，半胱氨酸内肽酶，天冬氨酸内肽酶和金属内肽酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶是选自枯草杆菌蛋白酶组的丝氨酸内肽酶，优选地是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用至少一种被固定的酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酯的制备和所述偶联在下述反应介质中进行，所述反应介质包含ι. O重量％或更少水，尤其是0. 5重量％或更少水，更尤其是0.1重量％或更少水。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z是氨基甲酰基、三氟甲基或三氯甲基。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中两个X均表示氢。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酯或硫酯的制备在存在以下物质时进行要与所制备的酯或硫酯偶联的任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽，和催化所述偶联反应的酶。
14.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中在制备了所述酯或硫酯之后添加所述任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进行所述偶联时不首先从所述反应介质中分离所述制备得到的酯或硫酯。
全文摘要
本发明提供了酶促合成肽的方法，所述方法包括由以下(i)和(ii)酶促制备酯或硫酯(i)N-端受保护的氨基酸、N-端受保护的氨基酸C-端酯、N-端受保护的肽、或N-端受保护的肽C-端酯，和(ii)式HO-CX2-Z所表示的醇或式HS-CX2-Z所表示的硫醇，每个X独立地表示卤素原子或氢原子；且Z选自下组包含至少两个取代基的sp3-杂化的碳，所述取代基包含和sp3-杂化的碳直接连接的杂原子，以及包含一个或两个取代基的sp2-杂化的碳，所述取代基包含和sp2-杂化的碳直接连接的杂原子，酯或硫酯的制备在以反应介质中液体重量为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中进行；和将制备得到的酯或硫酯与(任选地C-端受保护的)氨基酸或与(任选地C-端受保护的)肽酶促偶联，从而在以反应介质总重为基础包含2重量％或更少的水的反应介质中合成肽。
文档编号C12P21/02GK102216324SQ200980146237
公开日2011年10月12日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者克劳迪娅·卡森, 凯瑟琳娜·赫伯蒂娜·玛丽亚·斯彻伯斯, 彼得·珍·伦纳德·马里奥·奎德弗利格, 蒂莫·努伊真斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司