专利名称：用于核酸递送系统的支化阳离子脂质的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于寡核苷酸递送的阳离子脂质和含有该阳离子脂质的纳米颗粒组合物，以及使用该纳米颗粒组合物调控基因表达的方法。
背景技术：
在过去数年间已提出将使用核酸的疗法作为治疗各种疾病的努力尝试。例如反义疗法的疗法是疾病治疗中的有力手段，这是因为治疗性基因可选择性地调控与疾病有关的基因表达并且使得在使用其它治疗方法时所发生的副作用最小。然而，使用核酸的疗法由于基因的较差稳定性和无效递送而受到限制。提出了若干基因递送系统以克服所述障碍并且将治疗性基因有效地引入靶区域，例如体外和体内的癌细胞或组织内。为改进递送和增强治疗性基因的细胞吸收的这类尝试涉及利用脂质体。目前可用的脂质体未有效地将寡核苷酸递送到体内，尽管在质粒的递送方法已取得一些进展。在寡核苷酸的递送中，期望的递送系统应包含足以中和寡核苷酸的负电荷的正电荷。最近，Stuart, D. D 等在 Biochim.Biophys. Acta，2000，1463 :219-229 和 Semple， S. C.等在Biochim. Biophys. Acta, 2001，1510 152-166分别描述的涂覆阳离子脂质体 (CCL)和稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP)配制剂，报导了提供具有小的尺寸、高的核酸包封率、良好的血清稳定性以及长的循环时间的纳米颗粒。然而，与使用裸寡核苷酸相比，它们没有显示出显著改善的体内活性(特别是在除肝脏外的器官中)。期望提供允许获得寡核苷酸在细胞例如癌细胞中增强的细胞吸收度和提高的生物利用度的核酸递送系统。如果核酸递送系统贮存稳定且临床使用安全，则这也是期望的。虽然具有所述尝试和进展，但是仍需要提供改进的核酸递送系统。本发明解决了这种需要。发明概述本发明提供了用于核酸递送的阳离子脂质和含有其的纳米颗粒组合物。多核酸例如寡核苷酸包封在纳米颗粒复合物内，所述纳米颗粒复合物含有阳离子脂质、促融合脂质和PEG脂质的混合物。根据本发明的该方面，所述用于核酸(即寡核苷酸)递送的阳离子脂质具有式 ⑴
权利要求
1. 一种式(I)的阳离子脂质
2.权利要求1的化合物，其中Q1和Q2包括
3.权利要求1的化合物，其中Q'工和…2包括
4.权利要求1的化合物，其中Y1为0。
5.权利要求1的化合物，其中Y2为0；且Y5为0。
6.权利要求1的阳离子脂质，其中L1，当与(Y4)c-(CR2R3)d-C(= Υ5)ε部分组合时，独立地选自“(CR21R22) tl-[C ( = Y6)] el- (Y4) c- (CR2R3) d-C ( = Y5) e-； “(CR21R22) tlV (CR23R24) t2- (Y8) e2- [C ( = Y6)] el- (Y4) c- (CR2R3) d-C ( = Y5) e-， "(CR21R22CR23R24Y7) t3- [C ( = Y6)] el- (Y4) c- (CR2R3) d_C ( = Y5) e-， "(CR21R22CR23R24Y7) t3 (CR25R26) t4- (Y8) e2- [C ( = Y6)] el_ (Y4) c_ (CR2R3) d_C ( = Y5) e-， "(CR21R22CR23R24Y7) t3 (CR25R26) t4- (Y8) e2- [C ( = Y6)] el_ (CR27R28) tl-(Y4) c- (CR2R3) d_C ( = Y5)"[(CR21R22CR23R24) t5Y7] t6 (CR25R26) t4- (Y8) e2- [C ( = Y6)] el_ (Y4) c_ (CR2R3) d_C ( = Y5) e-，
7.权利要求1的阳离子脂质，其中l1,当与(y4)c-(cr2r3)d-c( = y5)e的部分组合时独立地选自
8.权利要求1的阳离子脂质，其中ln_13和l’n_13独立地选自 _(cr，21r，22)ql (y' 8)v’ [c( = y，9)]v(cr，23r，24)q2-,
9.权利要求1的阳离子脂质，其中ln_13和l’n_13独立地选自以下 -(ch2)4-,-(ch2)3-, -o(ch2)2--c ( = 0)0 (ch2) 3", -c( = 0) nh (ch2) 3-,
10.权利要求1的化合物，其中X(Q1) (Q2) (Q3)部分是
11.权利要求1的阳离子脂质，该阳离子脂质具有式(Ia)
12.权利要求1的阳离子脂质，该阳离子脂质选自
13.一种包含权利要求1的式(I)的阳离子脂质的纳米颗粒组合物。
14.权利要求13的纳米颗粒组合物，其还包含促融合脂质和PEG脂质.
15.权利要求14的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质选自
16.权利要求14的纳米颗粒组合物，其中所述促融合脂质选自D0PE、D0GP、P0PC、DSPC、 EPC和它们的混合物。
17.权利要求14的纳米颗粒组合物，其中所述PEG脂质选自PEG-DSPE、PEG-二棕榈酰甘油酰胺、C16mPEG-神经酰胺和它们的混合物。
18.权利要求14的纳米颗粒组合物，纳米颗粒组合物还包含胆固醇。
19.权利要求14的纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物选自以下的混合物式(I)的阳离子脂质、二酰基磷脂酰乙醇胺、缀合到磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的PEG、和胆固醇；式(I)的阳离子脂质、二酰基卵磷脂、缀合到磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的PEG、和胆固式(I)的阳离子脂质、二酰基磷脂酰乙醇胺、二酰基磷脂酰-胆碱、缀合到磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的PEG、和胆固醇；式(I)的阳离子脂质、二酰基磷脂酰乙醇胺、缀合到神经酰胺(PEG-Cer)的PEG、和胆固醇；或式(I)的阳离子脂质、二酰基磷脂酰乙醇胺、缀合到磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的PEG、缀合到神经酰胺(PEG-Cer)的PEG、和胆固醇。
20.权利要求18的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质与纳米颗粒组合物中存在的总脂质的摩尔比为约10% -约99.9%。
21.权利要求18的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质与纳米颗粒组合物中存在的总脂质的摩尔比为约15% -约25%。
22.权利要求18的纳米颗粒组合物，其中阳离子脂质、基于非胆固醇的促融合脂质、PEG脂质和胆固醇与纳米颗粒组合物中存在的总脂质的摩尔比为约 15-25% 20-78% 0-50% 2-10%。
23.权利要求18的纳米颗粒组合物，其中包括以纳米颗粒组合物中存在的总脂质的约 17% 60% 20% 3%的摩尔比的所述阳离子脂质、DOPE、胆固醇和C16mPEG-神经酰胺， 其中所述阳离子脂质为
24.一种包含用权利要求18的纳米颗粒组合物包封的核酸的纳米颗粒。
25.权利要求24的纳米颗粒，其中所述核酸是单链或双链的寡核苷酸。
26.权利要求24的纳米颗粒，其中所述核酸选自脱氧核苷、核糖核苷酸、锁核酸(LNA)、 短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适体、肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、 三环-DNA、双链寡核苷酸(诱捕0DN)、催化RNA (RNAi)、适体、镜相异构物、CpG低聚物以及它们的组合。
27.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸为反义寡核苷酸。
28.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸具有硫代磷酸酯连接键。
29.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸包括LNA。
30.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸具有约8-约50个核苷酸。
31.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制以下基因的表达致癌基因、促血管生成途径基因、促细胞增殖途径基因、病毒致病原基因和促炎途径基因。
32.权利要求25的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸选自反义HIF-Iα寡核苷酸、反义存活蛋白寡核苷酸、反义ErbB3寡核苷酸、反义β -联蛋白寡核苷酸和反义Bcl-2寡核苷酸。
33.权利要求25的化合物，其中所述寡核苷酸包含以SEQID NO :1，SEQ ID NOs 2和 3，SEQ ID NO :3,SEQ ID NO :4，SEQ ID N0:5，SEQ ID NO :5 JPSEQ ID NO :6 给出的 8 个或更多个连续的核苷酸。
34.权利要求24的纳米颗粒，其中阳离子脂质和核酸的电荷比为约1 1-约20 1。
35.权利要求24的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有约50nm-约150nm的大小。
36.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，该方法包括将权利要求24的纳米颗粒组合物给药到需要其的哺乳动物。
37.一种将寡核苷酸引入到细胞中的方法，该方法包括使所述细胞与权利要求24的纳米颗粒接触。
38.一种抑制人体细胞或组织的基因表达的方法，该方法包括 使所述人体细胞或组织与权利要求24的纳米颗粒接触。
39.权利要求38的方法，其中所述细胞或组织为癌细胞或组织。
40.一种下调哺乳动物的基因表达的方法，该方法包括 将有效量的权利要求24的纳米颗粒给药到需要其的哺乳动物。
41.一种抑制癌细胞生长或增殖的方法，该方法包括 使所述癌细胞与权利要求24的纳米颗粒接触。 权利要求40的方法，该方法还包括将化疗剂进行给药。
42.一种治疗哺乳动物的癌症的方法，该方法包括将有效量的权利要求15的纳米颗粒给药到需要其的哺乳动物。
43.权利要求42的方法，其中所述癌症具有向肝脏的转移性。
全文摘要
本发明涉及用于寡核苷酸递送的阳离子脂质和使用纳米颗粒组合物调控靶基因表达的方法。特别地，本发明涉及通过支化间隔基而具有多个带正电荷的部分的胆固醇及其衍生物，以及包封在阳离子脂质、促融合脂质和PEG脂质的混合物中的寡核苷酸的纳米颗粒组合物。
文档编号C12N15/88GK102216462SQ200980145887
公开日2011年10月12日 申请日期2009年7月31日 优先权日2008年11月17日
发明者乌德春, 史连军, 彦魏丽, 赵洪 申请人:安龙制药公司