专利名称：阳离子脂质及应用方法
阳离子脂质及应用方法对相关申请的交叉参考本申请要求提交于2004年6月7日的美国临时专利申请号60/ 578,075，提交于2004年9月17日的60/610,746，和提交于2005年5月9 日的60/679,427的权益，出于所有目的将其每个的全部内容特此并入作为 参考。发明背景有效和安全的基因递送系统是将在临床上有用的基因治疗所需要的。 病毒载体是相对有效的基因递送系统，但是遭遇到多种局限，诸如逆转成 野生型的可能以及免疫应答问题。结果，非病毒基因递送系统正在受到越 来越多的关注(Worgall， " a/.， T/wwa" T7zera;^ 8:37-44 (1997); Peeters， a/" //wma" Gewe TTzerapy 7:1693-1699 (1996); Yei, ef "/.， 772era/7_y 1:192-200 (1994); Hope, ef a/" M /腦/ar Mem&r匿万油gy 15:1-14 (1998))。质粒DNA-阳离子脂质体复合物是目前最常用的非病毒基因递送 载亍本(Felgner， 5"",ew/zy c ^wen'caw 276:102-106 (1997); Chonn， ef a/" Cw re/^ C^/m'o"/"所ofec/2"o/ogy 6:698-708 (1995))。然而，复合物较大，系统很不 确定，其不适于全身应用并可激发相当大的毒性副作用(Harrison, " a/.， 5/otec/2w/《was1 19:816-823 (1995); Huang, ef a/" A^fwre 5/o&c/zwo/ogy 15:620-621 (1997); Templeton, " a/.,淑,飾&c/7wo/ogv 15:647-652 (1997); Hofland， da/"尸/2^macewfea/Ae化a厂c/z 14:742-749 (1997》。最近的工作已经显示质粒DNA可被包封在小的( 70 nm直径)"稳定的 质粒-脂质颗粒"(SPLP)中，其由包封在双层脂质载体中的单一质粒组成 (Wheeler, "a/. Ge"e T7zera; 少6:271-281 (1999))。这些SPLPs典型地包含"融 合性的(fosogenic)"脂质二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)，低水平的阳离子脂 质，并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣时在水性介质中是稳定的。SPLP具有
全身应用，因为在静脉内(i.V.)注射后，它们显示延长的循环生存期，由于 在这些区域增加的血管通透性，它们优先聚集在远侧肿瘤位点，并可在这些肿瘤位点介导转基因表达。在i.v.注射包含萤光素酶标记基因的SPLP 后，在肿瘤位点观察到的转基因表达的水平优于使用质粒DNA-阳离子脂 质体复合物(lipoplexes)或裸DNA可获得的水平。尽管如此，对于一些应 用中的理想治疗益处，可能需要提高水平的表达(见，例如，Monck，eM/., / Z>wg 7^g. 7:439-452 (2000))。典型地，脂质体和SPLPs都包括阳离子脂质。通常，所述阳离子脂质 具有2条烷基链，醚(氧)键，和胺头部基团诸如，例如DODAC和DODMA。 典型地，烷基链包括不饱和的单一位点。不幸的是，仅具有不饱和单一位 点的阳离子脂质可缺乏柔性。包含这些阳离子脂质的脂质体或SPLP可缺 乏足够的膜流动性，因此影响将生物活性剂递送到细胞或患者中的功效。脂质柔性在开发脂质体或SPLP药物递送系统中是重要的。因此，理 想的是开发更具有柔性的阳离子脂质，由此增加脂质体或SPLP的膜流动 性。本发明满足了这个和其它的需要。本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具体地，已经令人惊讶地发现本发 明的阳离子脂质通过增加脂质体或SPLP的膜流动性而提高了脂质体以及 核酸-脂质颗粒(SPLPs)的性质，由此增加在脂质体和SPLP中递送生物活 性剂的功效。具体而言，本发明提供具有下列结构的式I的化合物在上述式I的化合物中，R1和W独立地是H或C,-C3垸基。R3和 W在式I的化合物中进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷发明概述 基基团，并且R3和W至少其中之一包括至少两个不饱和位点。R3和R4 可以是相同的或不同的。如果是不同的，R3和W可以在垸基链长度方面， 在不饱和的位点方面，或在不饱和的位点的数目方面是不同的。R3和R4 可以包括至少两个不饱和位点(例如R3和R"可以是，例如十二碳二烯基、 十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基(linoleyl)、 二十碳二烯基)。在优选 的实施方案中，R3和R"都是亚油基。R3和R"可以包含至少三个不饱和 位点(例如R3和R"可以是，例如，十二碳三烯基、十四碳三烯基，十六 碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基)。本发明还提供具有下列结构的式II的化合物I x-R1__N+_R3R4 (II).在上述式II中，R1和R2进行独立地选择并且是H或CrC3烷基。R3 和^进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团，其中 R3和W至少一个包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R3和 R"都是相同的，即R3和W都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中， R3和W是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亚油基(C18)。 在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R3和R"都是相 同的。在另一个优选的实施方案中，R3和R"都包含至少两个不饱和位点。 在一些实施方案中，R3和W独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基， 十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R3和R4 都是亚油基。在一些实施方案中，R3和R"包含至少三个不饱和位点并且 独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基 和二十碳三烯基。在另一个方面，本发明提供脂质体，所述脂质体包含式I，式II或其 组合的阳离子脂质。所述脂质体还可以包含PEG-脂质(例如，PEG-二酰基 甘油，PEG-二垸氧基丙基，PEG-神经酰胺，PEG-磷脂酰乙醇胺或其混合 物)。所述脂质体可以是空载的，或备选地，所述脂质体还可以包含一种或 多种生物活性剂。适合的生物活性剂包括，但不限于，抗肿瘤药、抗生素、
免疫调节剂，消炎药和作用在中枢神经系统上的药剂。类似地，适合的生物活性剂包括，但不限于，肽、蛋白质和核酸(例如单或双链DNA，单链 或双链RNA，包括siRNA)。在另一个方面，本发明提供将生物活性剂递送到细胞的方法，所述方 法包括使细胞与包含式I，式II或其组合的阳离子脂质的脂质体接触，其 中所述生物活性剂被包封在脂质体中。类似地，在另一个方面，本发明提 供将生物活性剂递送给患者的方法，所述方法包括向患者施用包含式I， 式II或其组合的阳离子脂质的脂质体，其中所述生物活性剂被包封在脂质 体中。在另一个方面，本发明提供核酸-脂质颗粒，所述核酸-脂质颗粒包含 核酸；式I，式II，或其组合的阳离子脂质；非阳离子脂质；和PEG-脂质 缀合物。在另一个方面，本发明提供将核酸引入细胞的方法，所述方法包括使 细胞与核酸-脂质颗粒接触，所述核酸脂质颗粒包含式I，式n，或其组合 的阳离子脂质，非阳离子脂质，PEG-脂质缀合物，和核酸。本发明的其它特征，目标和优势及其优选实施方案将通过下面的详细 描述，实施例，权利要求和附图而变得显而易见。附图简述
图1举例说明本发明的两个示范性阳离子脂质的结构:l,2-二亚油基氧 基-N,N-二甲基氨基丙垸(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨 基丙烷(DLenDMA)。图2举例说明DLinDMA的合成路线。图3举例说明DLenDMA的合成路线。图4举例说明显示结合在SNALP中的阳离子脂质的表观pKa的数据。 图5举例说明显示31P-NMR分析的结果的数据，所述"P-NMR用于 确定不饱和对相变温度的影响。图6举例说明这样的数据，所述数据显示在体外转染稳定表达萤光素 酶的Neuro2a细胞后，由SPLP(gp， SNALP)使基因表达的沉默，所述SPLP 包含DODAC, DODMA,或DLinDMA并包封抗萤光素酶siRNA序列。图7举例说明显示体外SNALP介导的基因沉默的数据。 图8举例说明显示在静脉内递送包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后 48小时，在肿瘤中萤光素酶基因表达的数据。所述SPLP包括PEG-C-DMA 缀合物和DODMA或DLinDMA其中任一。所述PEG部分具有2000或 750的分子量。图9举例说明显示在静脉内施用包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后 48小时，在携带Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠中萤光素酶基因表达的数 据。所述SPLP包括各种比例的(即15%, 10%, 5%或2.5 %)的PEG-C-DMA 和DODMA或DLinDMA 。图10举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含不 同比例(即2%， 5%， 10%，或15%)的PEG-C-DMA的3H-CHE-标记的 SPLP或SNALP或空载小泡后，在雄性A/J小鼠的血浆中剩余的SPLP、 SNALP或空载小泡的注射剂量的百分比。图11举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含各 种比例的PEG-C-DMA的SH-CHE-标记的制剂后48小时，在携带Neuro-2A 肿瘤的雄性A/J小鼠中，SPLP， SNALP或空载小泡的生物分布。所述 SNALP和空载小泡包括DLinDMA。所述SPLP包括DODMA。图12举例说明这样的数据，所述数据显示在静脉内施用包含 DLinDMA的SNALP后48小时，在A/J小鼠中的远端、稳定的Neuro2A-G肿瘤中萤光素酶表达的沉默。图13举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和 包封抗-萤光素酶siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中萤光素 酶表达的沉默。图14举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和 包封抗-萤光素酶的siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中的萤 光素酶表达的沉默。在缺乏或存在氯喹的情况下进行SNALP制剂的递送。图15举例说明显示细胞吸收SNALP的数据。发明详述 I. 介绍
本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。当结合到脂质小泡(例如，脂质体， SPLP和SNALP)中时，本文所述的阳离子脂质赋予增加的融合性 (fUsogenicity)。II. 定义术语"脂质"指一组有机化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且 特征是在水中不溶，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成至 少三类(l)"简单的脂质"其包括脂肪和油以及蜡；(2)"化合物脂质"其包 括磷脂和糖脂；(3)"衍生的脂质"诸如类固醇。"脂质小泡"指可用于传递化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限 于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质包被包括大 分子组分的内部，诸如包括干扰RNA序列的质粒，伴随减少的水性内部； 或脂质团聚体或胶团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物 中。用于本文时，"包封的脂质"可指提供具有充分包封、部分包封或两者 的化合物的脂质制剂。在一个优选的实施方案中，将所述核酸充分包封在 脂质制剂中(例如形成SPLP， pSPLP，或其它SNALP)。用于本文时，术语"SNALP"指稳定的核酸脂质颗粒，包括SPLP。 SNALP代表包被减少的水性内部的脂质的小泡，所述内部包括核酸(例如， ssDNA, dsDNA, ssRNA， microRNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA), ds脂A， siRNA或质粒，包括自其中转录干扰RNA的质粒)。用于本文时，术语 "SPLP"指包括被包封于脂质小泡中的核酸(例如，质粒)的核酸脂质颗粒。 SNALPs和SPLPs典型地包含阳离子脂质，非阳离子脂质，和阻止所述颗粒 聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALPs禾卩SPLPs具有全身施用， 因为它们在静脉内(i.v.)注射后显示延长的循环寿命，在远端位点(例如，在 身体上与施用位点分隔的位点上)聚集并且可以介导被转染的基因在这些 远端位点的表达。SPLPs包括"pSPLP"，其包括如在WO 00/03683中提及的 被包封的縮合剂-核酸复合物。术语"形成小泡的脂质"倾向于包括任何具有疏水部分和极性头部基 团的两亲性脂质并且其本身可以在水中自发形成双层小泡，示例为大多数术语"采用小泡的脂质"倾向于包括稳定与脂双层结合的任何两亲性 脂质，以及其它的两亲性脂质，其疏水部分与内部，双层膜的疏水区域接 触，并且其极性头部基团部分朝向外部，膜的极性表面。采用小泡的脂质 包括这样的脂质，其能够独立地适宜于采用非层状的相，还能够在存在双层稳定组分时，采取双层结构。典型的实例是DOPE (二油酰磷脂酰乙醇 胺)。双层稳定组分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质，聚 酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质衍生物)、肽、蛋白质、去污剂、脂质衍生 物、PEG-脂质衍生物诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG、与二酰基甘油偶联 的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，和与神经酰胺缀合的PEG(见，美国 专利号5，885,613)。PEG可以直接与脂质缀合或可以通过接头部分与脂质连 接。可以使用适合于将PEG偶联于脂质的任何接头部分，包括，例如，包 含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。用于本文时，术语"包含非酯的接头部分"指不包含羧酸酯键(-OC(O)-) 的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基 (-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲 (-NHC(O)NH-) ,二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(0)CCH2CH2C(0)-)， 琥珀酰胺(-NHC(0)CH2CH2C(0)NH-)，醚，二硫化物等，及其组合(诸如包 含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在优选的实施方案中， 将氨基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。在其它的实施方案中，包含酯的接头部分用于将PEG偶联于脂质。 适合的包含酯的接头部分包括，例如碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基 (succinoyl)，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其组合。术语"两亲性脂质"部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部 分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。两亲性脂质通常是脂质小泡的主要 成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如碳水化合物，磷酸盐(酯)，羧基、 硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以 通过包含非极性基团来赋予，所述非极性基团包括，但不限于，长链饱和 和不饱和脂族烃基团和由一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这 样的基团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨脂质和鞘脂类。 磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、 溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰 磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘磷脂、 鞘糖脂家族、二酰基甘油和P-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另 外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯和固醇。术语"中性脂质"指在选定的pH以未带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH下，这样的脂质包括，例如，二 酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、神经鞘磷脂、脑磷脂、 胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。术语"非阳离子脂质"指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质。术语"阴离子脂质"指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰 乙醇胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中 性脂质连接的阴离子修饰基团。术语"阳离子脂质"指在选定的pH，诸如生理pH下携带净正电荷的许 多脂质种类中的任何一种。这些脂质包括，但不限于，1,2-二亚油基氧基 -N，N-二甲基氨基丙烷("DLinDMA"), 1，2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙 烷("DLenDMA")，双十八烷基二甲铵("DODMA")， 二硬脂酰二甲铵 ("DSDMA"), N，N-二油基-N,N-氯化二甲铵("DODAC") ; N-(2,3-二油基氧基) 丙基)-N，N，N-氯化三甲铵("DOTMA") ; N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲铵 ("DDAB"); N-(2，3- 二油酰氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵("DOTAP"); 3-(N-(N，,N，-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇("DC-Chol")和N-(l,2二 肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵("DMRIE")。例如，在 低生理pH上具有阳性电荷的阳离子脂质包括，但不限于:DODAP, DODMA, 和DMDMA。在某些情形中，阳离子脂质包括可质子化的叔胺头部基团、 C18烷基链，在头部基团和烷基链之间的醚键，和0-3个双键。这些脂质 包括，例如DSDMA,DLinDMA,DLenDMA，禾口DODMA。所述阳离子脂质 可以包括醚键和pH可滴定的头部基团。这些脂质包括，例如DODMA。术语"疏水脂质"指具有非极性基团的化合物，其包括，但不限于，长 链饱和和不饱和脂族烃基团并且这些基团任选地被一个或多个芳香族、脂 环族或杂环族基团所取代。合适的实例包括，但不限于，二酰基甘油、二 垸基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨 基丙烷。术语"融合性的"指脂质体，SNALP或其它药物递送系统与细胞膜融合 的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器，例如内体、核等的膜。术语"核酸"或"多核苷酸"指包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸的以单或双链形式存在的聚合物。核酸包括包含已知核苷酸类似物或修 饰的主链残基或键的核酸，其是合成的，天然存在的，或非天然存在的， 其具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式进 行代谢。这些类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯 (phosphorothioates)，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-0-甲基核 糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核苷酸 的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存 在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还暗含 地涵盖其保守性修饰的变体(例如，简并密码子替换)，等位基因，直向同 源物，SNPs和互补序列以及明显指出的序列。具体地，可通过产生序列来 获得简并密码子替换，在所述序列中一个或多个选定(或所有)的密码子的 第三个位置由混和的碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer " "/.， A^c/e/c y4c^i es. 19:5081 (1991); Ohtsuka"a/" J历o/. C/zem. 260:2605-2608 (1985); 禾口 Cassol & a/. (1992); Rossolini " a/" Mo/. Ce〃.尸ra6^ 8:91-98 (1994))。 "核苷酸"包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱基，和磷酸基团。核苷 酸通过磷酸基团进行连接在一起。核苷酸包括化学修饰的核苷酸，如在例 如WO 03/74654中所述。"碱基"包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺 嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然类似物，以及 嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于取代新的反应基的修饰，所 述反应基诸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧酸盐(酯)和卤代烷。DNA可 以以反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预压縮的DNA、聚合酶链式反
应(PCR)的产物、载体(Pl, PAC， BAC， YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合 序列、染色体DNA或这些基团的衍生物的形式存在。术语核酸与基因、质 粒、cDNA、 mRNA和干扰RNA分子(例如，合成的siRNA或表达自质粒的 siRNA)交互使用。III阳离子脂质本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和 DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具体地，本发明提供具有下列结构 的式I的新的阳离子脂质在上述式I中，R1和W独立地进行选择并且是H或CrC3烷基。R3和 W独立地进行选择并且是具有约10-约20个碳原子的垸基基团，其中R3 和W至少其中之一包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R3和 R"都是相同的，即R3和W都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中， R3和R"是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亚油基(C18)。 在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R3和R"都是相 同的。在另一个优选的实施方案中，R3和R"都包含至少两个不饱和位点。 在一些实施方案中，R3和W独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基， 十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R3和R4 都是亚油基。在一些实施方案中，R3和W包含至少三个不饱和位点并且 独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基 和二十碳三烯基。本发明还提供具有下列结构的式II的新的阳离子脂质<formula>formula see original document page 16</formula>
在上述式II中，R1和W进行独立地选择并且是H或d-C3垸基。R3 和W进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的垸基基团；R3和 R"至少一个包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R3和W都是 相同的，即R3和R"都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中，R3和 W是不同的，即R3是十四碳三烯基(C14)，且W是亚油基(C18)。在优选 的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即RS和R"都是相同的。 在另一个优选的实施方案中，R3和R"都包含至少两个不饱和位点。在一 些实施方案中，R3和W独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六 碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R3和W都是 亚油基。在一些实施方案中，R3和W包含至少三个不饱和位点并且独立 地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二 十碳三烯基。IV包含阳离子脂质的基于脂质的载体系统在一个实施方案中，本发明提供稳定的核酸-脂质颗粒(SPLPs或 SNALPs)和其它的基于脂质的载体系统(例如，脂质体，胶束，病毒体， 脂质-核酸颗粒，核酸复合物及其混合物)，其包含本发明的阳离子脂质， 即式I，式II，或其组合的阳离子脂质。本发明的脂质-核酸颗粒典型地包 括核酸，式I或式II的阳离子脂质，非阳离子脂质和PEG-脂质缀合物。 式I或式II的阳离子脂质典型地包含存在于所述颗粒中的从约2%到约 60%，从约5%到约50%，从约10%到约45%，从约20%到约40%,或 约30%的总脂质。所述非阳离子脂质典型地包含存在于所述颗粒中的约 5%到约90%,从约10%到约85%，从约20%到约80%，从约 30%至U约70%，从约40%至U约60%或约48%的总脂质。所述PEG-脂质缀合物典型地包含存在于所述颗粒中的从约1%到约20%，从约 1.5%到约18%，从约4%到约15%,从约5%到约12%,或约2%的总脂 质。本发明的核酸-脂质颗粒还可以包含胆固醇。如果存在，胆固醇典型地 包含存在于所述颗粒中的约10%到约60%，约12%到约58%,从约20% 到约55%，或约48%的总脂质。对于本领域技术人员将容易变得显而易见
的是，例如，使用在本文所述的ERP测定，核酸-脂质颗粒的成分的比例 可以变化。例如，对于全身递送，阳离子脂质可以包含存在于所述颗粒中的约5%到约15%的总脂质，而对于局部或区域性递送，所述阳离子脂 质包含存在于所述颗粒中的约40%到约50%的总脂质。本发明的核酸-脂质颗粒典型地具有约50 nm到约150nm，更典型地 约100nm到约130 nm，最典型地约110 nm到约115nm的平均直径并且 是基本无毒的。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸对于水 溶液中核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备的方法公开在美国 专利号5,753,613; 5,785,992; 5,705,385; 5,976,567; 5,981,501; 6,110,745; 6,320,017和WO 96/40964。A.阳离子脂质可以将式I和II的阳离子脂质单独，或组合以一种或多种其它的阳离 子脂质种类或非阳离子脂质种类来用在本发明中。本文所述的式i和式n的阳离子脂质典型地在选定的pH，诸如生理pH上携带净正电荷。令人惊奇地发现，包含具有多个不饱和位点，例如 至少两个或三个不饱和位点的垸基链的阳离子脂质在形成具有增加的膜 流动性的脂质-核酸颗粒中是特别有用的。已经将也在本发明中是有用的许 多阳离子脂质和相关类似物描述在同时待审的USSN 08/316,399;美国专 利号5,208,036， 5，264，618, 5,279,833和5,283,185，和WO 96/10390中。另外的适合的阳离子脂质包括，例如双十八烷基二甲铵("DODMA")， 二硬脂酰二甲铵("DSDMA")， N，N-二油基-N，N-二甲铵("DODAC"); N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N,N-氯化三甲铵("DOTMA") ; N，N -二硬脂酰 -N,N-溴化二甲铵("DDAB"); N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N,N，N-氯化三甲铵 ("DOTAP"); 3-(N-(N，，N，-二甲基氨基乙垸)-氨基甲酰基)胆固醇("DC-Chor) 和N-(1，2 二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵 ("DMRIE")。将在本发明中也有用的许多这些脂质和相关类似物，描述在 美国专利号5,208,036， 5，264，618， 5，279，833， 5,283,185， 5,753,613和 5，785，992中。
B.非阳离子脂质用于本发明的非阳离子脂质可以是能够产生稳定复合体的多种中性 不带电荷的，两性离子或阴离子脂质中的任一种。它们优选地是中性的， 尽管它们可以备选地是带正电荷或带负电荷的。用在本发明中的非阳离子 脂质的实例包括磷脂-相关的物质，诸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵 磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，脑磷脂， 心磷脂，磷脂酸，脑苷脂，二鲸蜡基磷酸酯，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)， 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)， 二油酰磷脂酰 甘油(DOPG)， 二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)， 二油酰-磷脂酰乙醇胺 (DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺 (POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸 酯(DOPE-mal)， 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)， 二棕榈酰磷酸乙醇胺 (DMPE)， 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)， 16-0-单甲基PE， 16-0-二甲基 PE， 18-l-反式PE， l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。非阳离子脂质 或固醇诸如胆固醇可以存在。另外的不含磷的脂质是，例如，硬脂胺，十 二烷胺，十六垸胺，乙酰基棕榈酸酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六垸基 酯，十四垸酸异丙酯，两性丙烯酸酯聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基 -芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸酰胺，二(十八垸基)二甲基溴化铵等，二酰基 磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，和脑苷 脂。其它的脂质诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺可以存在。非阳 离子脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000， PEG 5000和与磷 脂或与神经酰胺(被称作PEG-Cer)缀合的聚乙二醇，如在同时待审的USSN 08/316,429中所描述的。在优选的实施方案中，非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱(例如，二硬 脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷 脂酰胆碱)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油 酰磷脂酰乙醇胺)，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是来自具有CKrC24碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地是酰基基团是月桂酰，肉豆蔻酰，棕榈酰，硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，非阳 离子脂质将是胆固醇，1，2-M-二油酰磷脂酰乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。 C.双层稳定组分除了阳离子和非阳离子脂质之外，本发明的SPLPs包含双层稳定组分(BSC)诸如ATTA-脂质或PEG-脂质，诸如偶联于二垸氧基丙基的 PEG(PEG-DAA)，如在例如WO 05/026372中所述，偶联于二酰基甘油的 PEG(PEG-DAG)，如在例如美国专利
发明者I·麦克拉克伦, J·海斯, L·R·帕尔默 申请人:普洛体维生物治疗公司