专利名称：突变体青霉素g酰基转移酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及经突变的青霉素酰基转移酶和用于制备β -内酰胺抗生素的方法，其中在存在经突变的青霉素酰基转移酶时借助于活化的侧链将β-内酰胺核心酰化。
背景技术：
内酰胺家族的抗生素是临床应用中最重要的一类抗菌化合物。天然存在的 β -内酰胺抗生素的较窄杀菌谱、它们较低的酸稳定性和越来越多的抗性问题引起了对于半合成抗生素(SSA’ s)(例如半合成青霉素(SSP’s)和半合成头孢菌素(SSC’s))的开发。 通常，半合成内酰胺抗生素的化学合成在低温下使用反应性中间产物和有机溶剂在严苛条件下进行，这导致较高的下游加工成本和环境不友好的过程。因此人们持续努力，以通过酶促转化代替传统化学方法，以便获得更加可持续的半合成内酰胺抗生素生产。天然β -内酰胺典型地由β -内酰胺核心(例如6-氨基-青霉烷酸(6-ΑΡΑ)、 7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)及其他)和所谓的侧链组成，所述侧链通过酰胺键与核心连接。青霉素G酰基转移酶(EC 3.5. 1. 11)是一种水解酶，其被广泛用于去除青霉素G(PenG)、头孢菌素G(CefG)和相关抗生素的侧链，从而生产相应的脱酰的核心6-APA 和7-ADCA以及各自被释放的侧链(在PenG和CefG的情况下为苯乙酸(PAA))。这些脱酰的β-内酰胺中间产物是SSA(例如氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯、头孢噻肟等等)的构造块 (building blocks)。关于 PenG 酰基转移酶的最近综述见 Rajendhran J，and Gunasekaran P. ， J Biosci. Bioeng. (2004),97,1-13, Arroyo M et al. ， Appl Microbiol Biotechnol. (2003)60'507-14, Sio CF and Quax WJ. Curr Opin Biotechnol. (2004),15,349-55, Chandel, Α. K. et al. Enzyme and Microbial Technology(2008) ,42, pp. 199-207。除了对β -内酰胺化合物脱酰基之外，已发现PenG酰基转移酶和氨基酯水解酶也可以被用于合成内酰胺抗生素。在该过程中，PenG酰基转移酶催化被活化的侧链与脱酰的β-内酰胺中间产物(例如6-APA、7-ADCA、7-ACA及其他)的缩合。酶催化的β-内酰胺抗生素合成可以在平衡受控的转化过程中发生，或在动力学受控的转化过程中发生。 在平衡受控的转化条件下，可以达到的产物累积水平受到反应热动力学平衡的控制，这在半合成抗生素的合成中是不想要的，特别是当反应在水性介质中进行时。在动力学受控的转化中，酶催化酰基从活化的侧链(即酰基供体)转移到β-内酰胺核心(即亲核受体)。 为了制备半合成的青霉素，被活化的侧链可以是酰胺衍生物或是芳香族羧酸的甲基酯。在这种情况下，产物累积水平受酶的催化特性控制，并且可瞬时获得酰基转移产物的高的非平衡浓度。SSA’ s的合成中使用的侧链的例子是经活化的苯基甘氨酸、经活化的羟苯基甘氨酸、经活化的二氢苯基甘氨酸等等。PenG酰基转移酶通过酰基-酶中间产物催化酰胺和酯的水解，所述中间产物中 β -亚基的N-端丝氨酸被酯化至酰基。在水解的情况下，水攻击酰基-酶并且驱动水解完成。存在添加的外界亲核试剂(例如6-APA、7-ADCA)的氨基时，亲核试剂和水均攻击酰基酶，分别产生想要的酰基-转移产物(抗生素)和不想要的经水解的酰基供体。
PenG酰基转移酶发挥酰基转移酶(即合成SSA’ s)的能力已经在多种半合成的 β -内酰胺抗生素的酶促生产中以工业规模利用。然而，在SSA’s的生产中，由于经活化的前体侧链的损失，水导致的水解反应降低了转移反应的效率。合成速率( 和水解速率(H) 之间的比例是评价PenG酰基转移酶合成性能的重要参数。S/H比例等于酶促酰基转移反应期间确定的条件下合成的产物(SSA)与水解产物相比的摩尔比。合成的产物在本文中被定义为从经活化的侧链和β-内酰胺核心形成的β-内酰胺抗生素。水解产物在本文中被定义为经活化的侧链的相应酸。对经济上有吸引力的方法而言，期望S/H比较较高，同时酶活性优选地也足够高。转化中观察到的S/H比例依赖于反应物、反应条件和转化的进行。Youshko et al.显示S/H比例的初始值既依赖于酶的动力学特性，又依赖于亲核受体(例如6-APA)的 农it—HYoushko，M. I. and Svedas,V. K. ,Biochemistry (Moscow) (2000) ,65,1367—1375禾口 Youshko,M. I. et al. Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics(2002), 1599,134-140。在固定的条件和亲核试剂浓度下，初始S/H比例可被用于比较不同PenG酰基转移酶和/或不同PenG酰基转移酶突变体的性能。另外，可以通过测量作为时间函数的转化期间的合成和水解，来比较不同PenG酰基转移酶的性能，所述测量允许计算转化不同阶段的S/H比例。酰化反应中PenG酰基转移酶的合成活性(=形成合成产物的速率=合成速率=生产速率)指定义的条件下每单位时间在酰化反应中形成的内酰胺抗生素的量。优选地测定初始活性。初始酶活性可如下测定进行酰化反应，然后构建合成的产物量与反应时间相比的图表，即所谓的发展曲线。通常在转化开始时，产物形成速率相对恒定，并且可以从发展曲线的斜率直接推导活性。在转化开始时合成活性已经开始降低的情况下，可通过发展曲线的外推和t = O时斜率的计算获得初始速率。为了比较不同PenG酰化酶的活性，合成活性应当被标准化至相同量的蛋白质。通过与合成初始速率相同的方式， 可以从经活化的经水解侧链量比反应时间的图表来测定水解的初始速率。PenG酰基转移酶已成为涉及PenG酰基转移酶突变体的若干研究的对象。在上文 Raiendhran and Gunasekara(2004)中给出了对公开的突变的详尽列表。近期更多研究由 Gabor,Ε. M. and Janssen,D. B. , Protein Engineering,Design and Selection(2004),17, 571-579 ;Jager,S. A. W. et al. Journal of Biotechnology(2008), 133,18-26 ；Wang,J. ,et al. Applied Microbiology and Biotechnology (2007), 74,1023-1030 公开。Gist-brocades的国际专利申请W096/05318教导了如何通过突变一个或多个氨基酸位置上的底物结合位点来修饰PenG酰基转移酶的特异性。显示也可以通过这种方式调整PenG酰基转移酶的S/H比例。另夕卜，国际专禾Ij 申请 W098/20120 (Bristol-Meyers Squibb)、 W003/055998 (Gist-brocades)和中国专利申请 CNlOl 177688 (Shanghai Institute for Biological kiences的)描述了由β _内酰胺核心和经活化的侧链，借助于PenG酰基转移酶突变体酶促制备β-内酰胺抗生素的方法。W098/20120公开了 Escherichia coli PenG酰基转移酶α-亚基中氨基酸位置142和146上和β -亚基中氨基酸位置Μ、56或177 上的突变。特别地，在β M上具有突变(其中苯丙氨酸被丙氨酸代替，F β 24Α)的PenG酰基转移酶变体似乎在青霉素和头孢菌素合成中生产显著更高的产率。然而在W003/055998 中显示，在使用酰胺前体代替酯前体与所述突变体F β 24Α组合的方法中，S/H比例仍然教导，但是酶促活性如此之低，使得该突变体在经济上吸引力小得多。相反，W003/055998中显示，其中α-亚基中第145位精氨酸被亮氨酸(Ra 145L)、半胱氨酸(Ra 145C)或赖氨酸 (Ra 145Κ)代替的PenG酰基转移酶突变体也显示经改进的S/H比例，但是除此之外还保持了更高水平的合成活性，特别是使用酰胺前体时。然而，所有这些突变体的合成活性都比野生型PenG酰基转移酶的合成活性小。CN101177688 公开了对 Bacillus megaterium PenG 酰基转移酶的突变体而言，S/ H比例的改进也伴随着合成活性的降低。TUHH-Technologie GmbH 的 EP-1418230 公开了 Alcaligenes faecalis PenG酰基转移酶，其中α -亚基的翻译后成熟是不完全的，导致对青霉素G和6-硝基-3-苯乙酰胺苯甲酸(也称作ΝΙΡΑΒ)更高的水解活性。所述α-亚基的不完全加工由α和β亚基之间所谓的连接子区域中的氨基酸取代引起。没有描述此类突变是否也能提高合成活性。上文讨论的现有技术显示，尽管可能提高PenG酰基转移酶的多种突变体的S/H比例，但是与野生型PenG酰基转移酶相比，S/H比例的此类改进伴随着合成活性的降低。因此，这些突变体的缺点是在此类转化中需要长的转化时间或非常高浓度的突变体PenG酰基转移酶，这使得此类突变体的工业应用在经济上没有吸引力，如果不是不可能的话。本发明的一个目的是提供下述突变体PenG酰基转移酶，所述酶与野生型酶相比具有提高的S/H比例，同时维持或更优选地提高合成活性，从而适用于工业方法。发明详述在第一方面中，本发明提供了源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体具有位于选自下组的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述组由氨基酸位置A3、Α77、Α90、Α144、Α192.Β24, Β109、Β148、Β313、Β460 和Β488组成，所述氨基酸位置根据具有SEQ ID No :1所示氨基酸序列的hcherichia coli 青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号，如下文所示MKNRNRMIVNCVTASLMYYffSLPALAEQSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTWfflJYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLGKDFVKFDKDIRRNYWPDAIRAQIMLSPEDMSILQGYADGMNAWIDKVNTNPETLLPKQFNTFGFTPKRWEPFDVMIFVGTMAWSDSTSEIDNULLTALKDKYGVSQGMVFNQLKWLVNPSAPTTIAVQESNYPLkfnqqnsqta allprydlpapmldrpakgadgallaltagknretiaaofaogganglagyptt snmwvigkskaQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWGSTAGFGDDVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWVK^SREETITVKNGQAETFTVWRTVHGNILQTDQTTQTAYAKSRAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQMKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPVPGTGKWDWKGLLPFEMNPKVYNPQSGYIANWMSPQKDYPASDLFAFLWOiADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQDLNLRLFLPTLQAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPGSAILNVWLTSM.KRTWAAVPMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGMILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEWLMLEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAMEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSDRPVLAWDWAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDaKMYENFGRKSLWLTKQDVEAHKESQEVLHVQR所述基因编码的完整多肽链由信号肽(26个氨基酸一单下划线部分)、α -亚基 (209个氨基酸)、连接肽(Μ个氨基酸一双下划线部分)和β -亚基(557个氨基酸)组成。信号肽以及连接肽均在翻译后成熟(post-translational maturation)期间被去除， 籍此得到由α-亚基和β-亚基组成的有酶活性的青霉素G酰基转移酶。在α-亚基中氨基酸被编号为A1-A209，在β-亚基中氨基酸被编号为Bl到Β557。野生型青霉素G酰基转移酶在本文中被定义为天然存在的青霉素G酰基转移酶。 野生型青霉素G酰基转移酶可以是任何合适的野生型青霉素G酰基转移酶，并且优选地选自由以下组成的组具有SEQ ID No :1所示氨基酸序列的hcherichia coli青霉素G酰基转移酶，和与SEQ ID No :1至少30%同源的青霉素G酰基转移酶。优选地，野生型青霉素G 酰基转移酶选自由以下组成的组表1中概括的、与hcherichia coli青霉素G享有30% 或更多同源性的19种青霉素G酰基转移酶。表 1.
权利要求
1.源自野生型青霉素G的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体具有位于选自下组的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述组由氨基酸位置A3、A77、 A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460 和 B488 组成，所述氨基酸位置基于具有 SEQ ID No 1中所示氨基酸序列的hcherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号。
2.根据权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体至少具有位置BM上的氨基酸取代和位于选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代，所述组由 A3、A77、A90、A192、B148、B313、B460 和 B488 组成。
3.根据权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体至少具有位置B460上的氨基酸取代和位于选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代，所述组由 A3、A77、A90、A192、B24、B148、B313 和 B488 组成。
4.根据权利要求2和3所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体至少具有位置BM上的氨基酸取代，至少具有位置B460上的氨基酸取代，以及任选地具有位于选自下组的位置上的氨基酸取代，所述组由A3、A77、A90、A192、B148、B313和B488 组成。
5.根据权利要求4所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体至少具有位置B24上的氨基酸取代，至少具有位置B460上的氨基酸取代，至少具有位置B148 上的氨基酸取代，以及任选地具有位于选自下组的位置上的氨基酸取代，所述组由A3、A77、 A90、A192、B313 和 B488 组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述野生型青霉素G酰基转移酶选自由具有SEQ ID No :1中所示氨基酸序列的 Escherichia coli青霉素G酰基转移酶和与SEQ ID No :1至少30%同源的青霉素G酰基转移酶组成的组。
7.编码前述权利要求中任一项所述的突变体青霉素G酰基转移酶的核酸序列。
8.包含如权利要求7所述的核酸序列的表达载体。
9.包含如权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
10.用于生产如权利要求1-6中任一项所述的突变体青霉素G酰基转移酶的方法。
11.用于生产半合成的内酰胺抗生素的方法，所述方法包括经活化的侧链与β-内酰胺核心的酶促偶联，其特征在于使用如权利要求1-6中任一项所述的突变体原核青霉素 G酰基转移酶。
12.用于生产半合成的内酰胺抗生素的方法，所述方法包括经活化的侧链与内酰胺核心的酶促偶联，其特征在于使用如权利要求1-6中任一项所述的突变体原核青霉素 G酰基转移酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述半合成的内酰胺抗生素选自由半合成的青霉素和半合成的头孢菌素组成的组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述半合成的青霉素是阿莫西林或氨苄西林。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述半合成的头孢菌素是头孢氨苄、头孢羟氨苄或头孢拉定。
16.用于在存在下述酶时生产阿莫西林的方法，所述酶催化活化形式的HPG与6-ΑΡΑ 的偶联，其中经活化的HPG、优选地选自甲基酯和乙基酯组成的组的酯，与6-ΑΡΑ的摩尔比< 3.0，优选地< 2. 5，更优选地< 2.0和更优选地< 1.5，并且以6-APA(摩尔/摩尔) 为基础并且在所述酶促偶联反应后测量的阿莫西林产率> 90%，优选地> 91%，优选地 ^ 92%，优选地> 93%，优选地> 94%和更优选地> 95。
17.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶是具有下述特性的酰基转移酶从 500mmole/升HPGM和530mmole/升6-APA生产阿莫西林(即转化)，并且在测试A中所述条件下进行的转化结束时产生少于5mmole/升的6-APA。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述酰基转移酶如权利要求1-6任一中定义。
全文摘要
本发明涉及源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于所述突变体在选自下组的一个或多个氨基酸位置上具有氨基酸取代，所述组由根据具有SEQ ID No1中所示氨基酸序列的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号的氨基酸位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460和B488组成。
文档编号C12N9/84GK102264904SQ200980152465
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月23日
发明者哈罗德·莫洛·穆迪, 德 托马斯·杜斯·范, 理查德·克尔曼, 德 简·米特斯卡·拉恩·范 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司