专利名称：小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化
方法。
背景技术：
小麦是重要的粮食作物之一，自1992年Vasil等将GUS/Bar基因导入小麦获得首 例转基因小麦以来，转基因小麦研究有了长足的发展，小麦转基因的常用方法为基因枪法 (microprojectilebombardment)、花粉管通道法(polly tube pathway)禾口农杆菌介导法 (Agrobacterium mediated transformation)。由于小麦不是农杆菌的天然宿主及禾谷类 植物没有损伤反应现象，所以基因枪转化一直是小麦遗传转化的主要方法，尽管小麦遗传 转化的方法不少，但各种方法的转基因效率很低，一个重要的原因是转化方法不成熟。基因 枪转化的受体多为幼胚、成熟胚及其体细胞愈伤组织，但这些受体在基因枪轰击后再生率 低已成为一个限制因子，同时，经基因枪转化体细胞获得的转基因株是一个外源基因杂合 体，须经再自交2代才能选出转化基因完全纯合的个体，育种程序复杂。离体培养中花药愈 伤组织高频率的再生特性及当代加倍纯合特点已引起了人们的重视，利用花药愈伤组织进 行遗传转化，不仅愈伤组织再生特性好，而且再生苗直接加倍后即可成为基因型完全纯合 的稳定双倍体。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种小麦花药愈 伤组织基因枪转化方法，该方法利用小麦花药愈伤组织再生频率高、再生株加倍即为纯合 二倍体的特点，通过基因枪轰击、小麦花药愈伤组织再生与再生株染色体加倍，快速、高效 地进行小麦遗传转化，克服了传统的小麦体细胞遗传转化中，体细胞愈伤组织再生特性差、 遗传转化效率低的缺陷。 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案 —种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，包括以下步骤 1)小麦花药愈伤组织诱导选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小 麦幼穗，在2°C 4t:条件下低温放置2天； 低温放置后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在花药愈伤组织诱导培 养基上，于25°C 27t:条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组织； 所述的小麦花药愈伤组织诱导培养基以通用培养基W14为基准，添加以下物 质2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D) :2. 0mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0. 5mg/L，蔗糖 100000mg/L，琼脂粉5000mg/L ; 调整花药愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2) 灭菌20分钟; 2)高渗培养小麦花药组织诱导培养40天后陆续产生花药愈伤组织，分批挑选小
3米粒大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到高渗培养基中培养5h ;所述的高渗培养
基为愈伤组织诱导培养基再附加0. 2mol/L甘露醇和0. 2mol/L山梨醇；
3)基因枪轰击转化经高渗培养后的花药愈伤组织用常规的基因枪转化方法 进行轰击转化，基因枪轰击参数为金粉直径l.Oym，阻挡网与轰击材料之间的距离为 6. 0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1 y g/60 y g，每皿材料轰击1次；
4)恢复培养基因枪轰击后的花药愈伤组织在上述高渗培养基上继续培养8h，然 后转移到小麦花药愈伤组织诱导培养基上恢复培养6h ; 5)分化筛选培养恢复培养6h后的花药愈伤组织转至分化筛选培养基上进行光 照分化筛选培养；培养温度为25 28t:，光照度30001x，每天光照12h ;
所述的分化筛选培养基选用通用培养基W14，以通用培养基W14为基准，添加以下 物质6-呋喃基氨基嘌呤(KT) :2.0mg/L， a-奈乙酸(NAA) :0. lmg/L，酪蛋白500mg/L，生 物素0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉5000mg/L ; 调整分化筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2)灭菌20
分钟；经基因枪轰击、恢复生长的花药愈伤组织在分化筛选培养基上分化出芽苗。 6)壮苗、生根培养待花药愈伤组织分化的芽苗长至2 3片叶时转移到生根、壮
苗培养基上，于25°C 、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养； 所述的壮苗、生根培养基选用通用培养基W14，以通用培养基W14为基准，W14通 用培养的无机盐浓度降低一半，添加a _奈乙酸(NAA)O. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉 5000mg/L ; 调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2)灭菌20 分钟； 7)染色体加倍在壮苗、生根培养基上根、苗生长健壮的花粉植株及时移栽到营 养钵中，于15°C 、 1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长10天后，用含0. 05%的 秋水仙素和1. 5%的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍， 注射在清晨8 10时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25 ii L，花粉植株经染色体 加倍后得到加倍纯合个体； 8)分子检测并筛选用常规的分子检测技术对加倍纯合个体进行分子检测，筛选 稳定的转基因纯合株。 本发明的小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法与传统的体细胞愈伤组织基因 抢转化相比，本发明的基因枪轰击后的花药愈伤组织再生频率高，再生株经染色体加倍后 可直接获得转基因纯合稳定株，克服了传统的体细胞愈伤组织基因抢转化中，愈伤组织再 生频率低、转化株基因杂合，须经自交2代选择纯合体的技术弊端，提高了小麦遗传转化和 分子育种效率，转化效率达8%以上。
图1基因枪轰击后的花药愈伤组织高频率再生
图2经RT-PCR检测的花药愈伤组织转基因再生植株
以下结合具体实施方式
对本发明做进一步的详细说明。
具体实施例方式
—、具体实施例 实施例1 : 本发明的小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，包括以下步骤 1)小麦花药愈伤组织诱导选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小
麦幼穗，在2t:条件下低温放置2天； 低温放置后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在花药愈伤组织诱导培
养基上，于25t:条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组织； 小麦花药愈伤组织诱导培养基是以通用培养基W14为基准，添加以下物质2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) :2. 0mg/L，酪蛋白:500mg/L，生物素0. 5mg/L，蔗糖100000mg/ L，琼脂粉:5000mg/L ; 调整花药愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2) 灭菌20分钟。 通用培养基W14的配方为硝酸钾(KN03) :2000mg/L，磷酸二氢氨(NH4H2P04): 380mg/L，氯化牵丐(CaC12 2H20) :140mg/L，硫酸镁(MgS04 7H20) :200mg/L，硫酸钾 (K2S04) :700mg/L，硫酸亚铁(FeS04 7H20) :27. 8mg/L，乙二酸四乙钠(Na2EDTA) :37. 3mg/ L，硫酸锰(MnS04 4H20) :8mg/L，硫酸锌(ZnS04 7H20) :3. Omg/L，硼酸(H3B03) :3. Omg/ L，碘化钾(KI) :0. 5mg/L，钼酸钠(Na2Mo04 2H20) :0. 005mg/L，硫酸铜(CuS04 5H20): 0. 025mg/L，氯化钴(CoC12 6H20) :0. 025mg/L，盐酸硫胺素2mg/L，盐酸吡哆锌0. 5mg/L， 烟酸0. 5mg/L，甘氨酸:2mg/L ; 2)高渗培养小麦花药组织诱导培养40天后陆续产生花药愈伤组织，分批挑选小 米粒大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到高渗培养基中培养5h ;高渗培养基为愈 伤组织诱导培养基再附加0. 2mol/L甘露醇和0. 2mol/L山梨醇； 3)基因枪轰击转化经高渗培养后的花药愈伤组织用常规的基因枪转化方法 进行轰击转化，基因枪轰击参数为金粉直径l.Oym，阻挡网与轰击材料之间的距离为 6. Ocm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1 y g/60 y g，每皿材料轰击1次；
4)恢复培养基因枪轰击后的花药愈伤组织在上述高渗培养基上继续培养8h，然 后转移到小麦花药愈伤组织诱导培养基上恢复培养6h ; 5)分化筛选培养恢复培养6h后的花药愈伤组织转至分化筛选培养基上进行光 照分化培养；培养温度为2『C，光照度30001x，每天光照12h ; 分化筛选培养基选用通用培养基W14，以通用培养基W14为基准，添加以下物质 6-呋喃基氨基嘌呤(KT) :2.0mg/L， a-奈乙酸(NAA) :0. lmg/L，酪蛋白500mg/L，生物素: 0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉5000mg/L ; 调整分化筛选培养基的pH值为5. 6，置于高压灭菌锅(压力1. 0kg/cm2)灭菌20
分钟；经基因枪轰击、恢复生长的花药愈伤组织在分化筛选培养基上分化出芽苗。 6)壮苗、生根培养待花药愈伤组织分化的芽苗长至2 3片叶时转移到生根、壮
苗培养基上，于25°C 、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养； 壮苗、生根培养基以通用培养基W14为基准，将W14通用培养的无机盐浓度降低一 半，添加a —奈乙酸(NAA)O. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉:5000mg/L ;
调整壮苗、生根培养基的pH值为5. 6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟(1. 0kg/cm2);
7)染色体加倍在壮苗、生根培养基上根、苗生长健壮的花粉植株及时移栽到营 养钵中，于15°C 、 1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长10天后，用含0. 05%的 秋水仙素和1. 5%的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍， 注射在清晨8 10时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25 ii L，花粉植株经染色体 加倍后得到加倍纯合个体； 8)分子检测并筛选用常规的分子检测技术对加倍纯合个体进行分子检测，筛选 稳定的转基因纯合株。 实施例2 :本实施例与实施例1的步骤相同，区别在于本实施例的步骤1)中低温
放置的温度为4t:，低温放置后的小麦幼穗于27t:条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组
织；步骤5)中分化筛选培养温度为25°C。 实施例3 :本实施例与实施例1的步骤相同，区别在于本实施例的步骤1)中低温
放置的温度为2t:，低温放置后的小麦幼穗于26t:条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组
织；步骤5)中分化筛选培养温度为27°C。
二、本发明的方法的试验研究及结果 发明人于2008年以普通小麦小偃22X西农213、花育888X西农213及矮败X 小偃22三个杂交组合的巳代为材料，经巳代花药组织离体培养诱导愈伤组织，选取质地致 密的180块花药愈伤组织用本发明的方法进行基因枪轰击转化，经恢复培养与再生，获得 了 69个再生苗，经RT-PCR检测，获15个转基因阳性植株，转化效率达8. 3% 。
权利要求
一种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤1)小麦花药愈伤组织诱导选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在2℃～4℃条件下低温放置2天；低温放置后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在花药愈伤组织诱导培养基上，于25℃～27℃条件下遮光培养诱导小麦花药愈伤组织；所述的小麦花药愈伤组织诱导培养基以通用培养基W14为基准，添加以下物质2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2.0mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖100000mg/L，琼脂粉5000mg/L；调整花药愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；2)高渗培养小麦花药组织诱导培养40天后陆续产生花药愈伤组织，分批挑选小米粒大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到高渗培养基中培养5h；所述的高渗培养基为愈伤组织诱导培养基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；3)基因枪轰击转化经高渗培养后的花药愈伤组织用常规的基因枪转化方法进行轰击转化，基因枪轰击参数为金粉直径1.0μm，阻挡网与轰击材料之间的距离为6.0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1μg/60μg，每皿材料轰击1次；4)恢复培养基因枪轰击后的花药愈伤组织在上述高渗培养基上继续培养8h，然后转移到小麦花药愈伤组织诱导培养基上恢复培养6h；5)分化筛选培养恢复培养6h后的花药愈伤组织转至分化筛选培养基上进行光照分化筛选培养；培养温度为25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；所述的分化筛选培养基选用通用培养基W14，以通用培养基W14为基准，添加以下物质6-呋喃基氨基嘌呤(KT)2.0mg/L，α-奈乙酸(NAA)0.1mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉5000mg/L；调整分化筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力1.0kg/cm2)灭菌20分钟；经基因枪轰击、恢复生长的花药愈伤组织在分化筛选培养基上分化出芽苗。6)壮苗、生根培养待花药愈伤组织分化的芽苗长至2～3片叶时转移到生根、壮苗培养基上，于25℃、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养；所述的壮苗、生根培养基以通用培养基W14为基准，并将W14通用培养的无机盐浓度降低一半，添加α-奈乙酸(NAA)0.5mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂粉5000mg/L；调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；7)染色体加倍在壮苗、生根培养基上根、苗生长健壮的花粉植株及时移栽到营养钵中，于15℃、1500Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长10天后，用含0.05％的秋水仙素和1.5％的二甲基亚砜的染色体加倍液注射分蘖节，对花粉植株进行染色体加倍，注射在清晨8～10时进行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株经染色体加倍后得到加倍纯合个体；8)分子检测并筛选用常规的分子检测技术对加倍纯合个体进行分子检测，筛选稳定的转基因纯合株。
全文摘要
本发明公开了一种小麦花药愈伤组织基因枪遗传转化方法，包括如下步骤花药愈伤组织诱导；高渗培养；基因枪轰击转化；恢复培养；分化筛选培养；壮苗、生根培养；染色体加倍；分子检测并筛选。与传统的体细胞愈伤组织基因抢转化相比，本发明的基因枪轰击后的花药愈伤组织再生频率高，再生株经染色体加倍后可直接获得转基因纯合稳定株，克服了传统的体细胞愈伤组织基因抢转化中，愈伤组织再生频率低、转化株基因杂合，须经自交2代选择纯合体的技术弊端，提高了小麦遗传转化和分子育种效率，转化效率达8％以上。
文档编号C12N15/87GK101748152SQ20101010081
公开日2010年6月23日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者任慧莉, 史勇, 崔志刚, 权军利, 李春莲, 白延红, 陈耀锋, 陈鑫 申请人:西北农林科技大学