一种制备β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制剂的方法

专利名称：一种制备β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制剂的方法。
背景技术：
0 -半乳糖苷酶(0 -D-galactosido-galatohydrolase, ^ _D_ 半乳糖苷半乳糖 水解酶，EC 3. 2. 2. 23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。这种酶能将乳糖水解成半乳糖和葡 萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用(张树政等，酶制剂工业，科学出版社，1984，p818、19)。 乳糖酶存在于植物(尤其在杏、桃、苹果)、细菌(乳酸菌、大肠杆菌等)、真菌(米曲酶、黑 曲霉、琉球曲霉、脆壁酵母、乳结合酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母)以及放线菌(天蓝链霉 菌)、动物肠道(特别是乳婴)中。乳糖则是牛奶乳清中的主要成分，乳糖约占牛奶干物质 的30%，但溶解度低，在20°C水中溶解度仅为20%，而其甜度仅为蔗糖的16%。久贮的乳制 品由于乳糖析出，呈砂样感觉，影响风味。此外，许多成人，特别是婴儿(因人种而异，西欧 占2 8%，亚洲、非洲占6(T90% )体内缺乏乳糖酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳 糖到了肠里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动， 使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称作乳糖不耐受症(G.G.伯奇等，酶与食品加工， 轻工业出版社，1991，p93 110)。乳糖酶主要用来治疗乳糖不耐受症、处理加工牛乳、乳清等，生产低乳糖牛奶和低 乳糖乳制品及减少环境污染。1.解决乳糖不耐受症患者使用乳制品的问题(G.G.伯奇等，酶与食品加工，轻工 业出版社，1991，p93 110)。由于乳糖不耐受症患者体内缺乏乳糖酶，他们就不能充分利用 乳制品中乳糖所提供的能量，乳糖在其体内不能被吸收，就成为肠道微生物菌系的能源，这 就导致乳酸和二氧化碳的形成，他们对肠道有刺激作用，并造成机体脱水进入结肠，最终会 出现腹泻，同时发生肠梗塞和胀气等，造成肠道蠕动加快，还会减少蛋白质和无机盐类等营 养物质的吸收。腹泻还会带来卫生学方面的问题和造成重复感染的机会。通过口服乳糖酶 或将乳糖酶直接加入到乳制品中可解决这一问题。在工业生产中可将乳糖酶加到乳制品中 制成低乳糖的乳制品，一方面减轻乳糖不耐受症的影响，另一方面可提高乳制品的营养。2.改良浓缩乳和浓缩乳清的质量。由于乳糖的溶解度低，在低温下极易从浓缩乳 和浓缩乳清中结晶析出，加入乳糖酶可防止冷冻乳及浓缩乳清中的乳糖结晶而引起乳酪蛋 白的凝固。此外，乳清作为饲料的利用价值很高，但乳糖对家畜的生长有一定的限制，使用 乳糖酶将乳糖分解为单糖既提高了消化率，同时也消除了乳糖结晶所产生的操作不便。3.改良冰淇淋混合物中，如有12%以上的脱脂乳圆形物时，贮藏及销售中会产 生乳糖结晶，此结晶在口中呈砂样感，降低了商品价值，乳脱脂固形物为16%，用酶分解其 50%的乳糖后，在冰箱中放置四个月仍稳定，而且增加了甜味，冰淇淋混和物中的砂糖可减 少广2%用量。此外，水解乳清和乳糖在三明治、软饮料和纺织品上浆中都有很大的用途，在 纺织上浆中使用水解乳清省去使用白蛋白，降低生产成本。近年来，利用3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶生产低聚半乳糖也受到重视。因此，乳糖酶在食品工业中作用日益显著。但目前乳糖酶并未在食品工业中得到广泛的应用，主要 原因是目前乳糖酶的产量较低，销售价格过高，添加成本昂贵。市场上销售的乳糖酶主要 来源于酵母，此种酶耐热性差，适用范围窄，不能满足食品工业多方面的需要。随着基因工 程技术的发展，寻找研制出成本低，产量高，热稳定性强，更合适食品工业生产的乳糖酶，已 成为研究热点。膜分离技术作为一种新型、高效的流体分离技术，近年来取得了令人瞩目的发展， 已广泛应用于国民经济得各个领域。在节能减排清洁生产和循环经济中发挥着重要作用。 在酶技术领域，首先引入的膜分离是用于浓缩，在发酵领域，微孔膜的出现被应用于抗生 素、氨基酸的除杂除菌分离，从而使工艺流程缩短，产品质量提高，收率增加，大大节约了能 源。但目前生产食品级酶制剂还是比较困难的，主要是因为生产过程中容易受环境中微生 物的污染。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备酶制剂的方法。本发明所提供的制备酶制剂的方法，包括如下步骤1)将含目的酶的发酵液进行微孔膜过滤，得到含目的酶的澄清液；2)将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，收集目的酶液；所述超滤柱组1和所述超滤柱组2沿着含目的酶的澄清液的流动方向串联连接； 所述超滤柱组1和超滤柱组2均至少含有一支超滤柱；所述超滤柱由壁卷成；所述壁由至少二层超滤膜和至少一层导流网组成，超滤膜 和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的澄清液沿所述 导流网流动；所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为24密尔-46密尔，所述 超滤柱组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为54密尔-86密尔；3)向所述目的酶液中加入助剂，干燥，得到目的酶制剂；所述步骤1)和步骤2)在密闭条件下进行。上述过程中，所述超滤柱组1中含有3支所述超滤柱，且3支所述超滤柱沿含目的 酶的澄清液的流动方向串联连接；和所述超滤柱组2中含有3支所述超滤柱，/且3支所述 超滤柱沿含目的酶的澄清液的流动方向串联连接。上述过程中，所述超滤柱组1含有12支所述超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄 清液的流动方向串联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组1 ；和所述超滤柱 组2含有12支所述超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串联形成一小组， 共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组2。上述过程中，所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为24密尔， 所述超滤柱组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为54密尔；或所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为35密尔，所述超滤柱 组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为60密尔；或所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为46密尔，所述超滤柱 组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为86密尔。
上述过程中，所述超滤柱组1中每支所述超滤柱中各层超滤膜的总面积为 28m2-31m2,具体为30m2、32m2或28m2 ；所述超滤柱组2中每支所述超滤柱中各层超滤膜的总 面积为 24m2-27m2，具体为 26m2、27m2 或 24m2。上述过程中，所述超滤柱组1中每支所述超滤柱和所述超滤柱组2中每支所述超 滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长0. 5m或lm ；所述超滤柱组1中每支所述超滤柱和 所述超滤柱组2中每支所述超滤柱的横截面的外直径均为2英寸或8英寸；所述超滤柱组 1中每支所述超滤柱的壁中和所述超滤柱组2中每支所述超滤柱的壁中的超滤膜均为3-4 层、导流网均为2-3层。上述过程中，所述超滤柱组1中每支所述超滤柱的平均通透量为40-52升/m2/h， 具体为40升/m2/h、45升/m2/h或52升/m2/h ；所述超滤柱组2中每支所述超滤柱的平均通 透量为30-35升/m2/h，具体为30升/m2/h、32升/m2/h或35升/m2/h ；所述超滤膜的截留 分子量为1-3万道尔顿，优选为2万道尔顿。上述过程中，所述超滤膜带孔；所述超滤膜的孔分布均勻；所述超滤膜的孔径大 小均一；所述将含目的酶的澄清液直接依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，在外界压力下进 行；外界压力大小恒定，外界压力大小为IMpa。上述过程中，所述方法中，在所述微孔膜过滤前，包括将所述含目的酶的发酵液用 压滤机进行过滤的步骤；所述步骤1)中的微孔膜过滤为循环错流过滤；所述微孔膜为孔径 为0. lum-0. 5um的陶瓷膜；所述压滤机为充气压滤机或板框压滤机；所述助剂为奶粉、麦芽 糊精或可溶性淀粉；所述干燥为喷雾干燥。上述过程中，所述目的酶为0 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶；所述含目的酶的发酵液是按照包括如下步骤的方法得到的诱导发酵巴斯德毕赤 酵母(Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，得到0 _D_半乳糖苷半乳糖水解酶。所述诱导发酵的方法包括如下步骤1)向发酵培养基中添加复合微量元素，再接种巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，培养 16 小时；2)向步骤1)的发酵体系中流加葡萄糖和复合微量元素的混合溶液，继续培养5小 时；3)向步骤2)的发酵体系中流加甲醇，进行诱导培养，得到3-D-半乳糖苷半乳糖 水解酶；所述步骤2)中，所流加的葡萄糖的总量占所述发酵培养基体积的20% (体积百分 含量)；所述葡萄糖在所述葡萄糖和复合微量元素的混合溶液中的浓度为450g/L ；所述复 合微量元素在所述葡萄糖与复合微量元素的混合溶液中的浓度为7. 5ml/L ；所述葡萄糖和 复合微量元素的混合溶液的流加速度为16ml/hr/L ；所述培养的过程中，所述发酵体系的 溶氧量为25% (体积百分含量)；所述步骤3)中，所流加的甲醇总量占所述发酵培养基体积的75% (体积百分含 量)；流加过程中，使添加的甲醇在所述发酵培养基体积中的浓度保持在0.3% (体积百分 含量)；所述诱导培养的过程中，发酵体系的溶氧量为25% (体积百分含量)；所述诱导培 养的时间为96小时或100小时；所述发酵培养基为如下培养基由磷酸二氢铵、硫酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸钙、氢氧化钾、葡萄糖和水组成；磷酸二氢铵在发酵培养基中的浓度为60g/l，硫酸钾在发 酵培养基中的浓度为17. 2g/l，硫酸镁在发酵培养基中的浓度为15. 85g/l，磷酸二氢钾在 发酵培养基中的浓度为5g/l，硫酸钙在发酵培养基中的浓度为0. 93g/l，氢氧化钾在发酵 培养基中的浓度为1. 6g/l，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为50g/l ； 所述复合微量元素由七水硫酸亚铁、氯化锌、五水硫酸铜、一水硫酸锰、氯化钴、生 物素和水组成；七水硫酸亚铁在所述复合微量元素中的浓度为70g/l，氯化锌在所述复合 微量元素中的浓度为25g/l，五水硫酸铜在所述复合微量元素中的浓度为8g/l，一水硫酸 锰在所述复合微量元素中的浓度为2. 5g/l，氯化钴在所述复合微量元素中的浓度为0. 7g/ 1，生物素在所述复合微量元素中的浓度为0. 3g/l ；所述诱导发酵是在50L发酵罐中进行的。本发明的生产乳糖酶的工艺中，首次采用双膜组合(微孔膜和超滤膜)，尤其是 在超滤膜通道中使用了不同厚度的导流网，使料液通过超滤膜通道的过程中始终保持较 快的速度，进而快速的完成超滤浓缩，解决了传统技术中在超滤后期由于料液浓度增高而 引起膜堵塞致使料液流速变缓的问题；本发明方法中，在超滤浓缩的步骤中，在进液量为 16000L、进液中酶浓度为3000U/mL，被浓缩至3_4倍的前提下，仅需要1小时；而传统技术 (用超滤膜反复循环分离)，在相同的前提下需要3-4小时。可见本发明方法大大缩短了浓 缩时间，进一步缩短了工艺流程，提高了酶制剂的生产效率。而且，本发明方法的酶提取率 很高，可达70%。另一方面，本发明方法中，经过微孔膜过滤后的无菌含酶澄清液在超滤的过程中， 只需一次流经超滤膜通道即可，无需循环的步骤，与现有技术相比，避免了料液与环境的接 触，从而保证产品在提取过程中不遭受污染，还省去了再除菌的步骤。实验证明，本发明方 法得到的酶制剂成品中菌的数量少于100个/g，而现有技术生产的酶制剂中菌的数量一般 为 1000 个/g。综上，本发明方法获得的酶制剂达到了食品级，本发明方法在制备酶制剂领域中 将有广阔的应用前景。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、制备β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制剂一、发酵制酶本实验为重组酵母在50升发酵罐中高密度发酵生产β -D-半乳糖苷半乳糖水解 酶。质粒pPIC9购自农科院生物技术研究所。按照专利(申请号02108141. 7)中所述 的方法构建重组酵母菌，将乳糖酶的编码基因导入载体PPIC9中，再转化酵母菌株GS115， 筛选得到重组酵母菌。将其中产酶效果好的一株记作巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris) LACO Y12 ；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) LACO Y12已于2010年2月8日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3630。
1、种子培养将重组酵母菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) LACO Y12 CGMCCNo. 3630接种于预培养基中，30°C摇床培养24小时，得到种子培养液。预培养基的组成由磷酸二氢铵、硫酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸钙、氢氧化钾、 葡萄糖和水组成；磷酸二氢铵在发酵培养基中的浓度为60g/l，硫酸钾在发酵培养基中的 浓度为17. 2g/l，硫酸镁在发酵培养基中的浓度为15. 85g/l，磷酸二氢钾在发酵培养基中 的浓度为5g/l，硫酸钙在发酵培养基中的浓度为0. 93g/l，氢氧化钾在发酵培养基中的浓 度为1.6g/l，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为50g/l。2、发酵培养1)菌株培养阶段向30L发酵培养基中添加复合微量元素，使复合微量元素与发 酵培养基的体积比为4. 37ml 1L，再按8%的接种量向其中接入种子培养液，搅拌培养 16hr。在此培养的过程中，向发酵体系中加入液态氨，以使发酵体系的pH值保持在5. 0， 同时液态氨也作为菌株生长的氮源。在此培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧由 100%逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80%以上，然后进入碳源饲喂阶段。所述发酵培养基为如下培养基由磷酸二氢铵、硫酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸 钙、氢氧化钾、葡萄糖和水组成；磷酸二氢铵在发酵培养基中的浓度为60g/l，硫酸钾在发 酵培养基中的浓度为17. 2g/l，硫酸镁在发酵培养基中的浓度为15. 85g/l，磷酸二氢钾在 发酵培养基中的浓度为5g/l，硫酸钙在发酵培养基中的浓度为0. 93g/l，氢氧化钾在发酵 培养基中的浓度为1. 6g/l，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为50g/l。所述复合微量元素由七水硫酸亚铁、氯化锌、五水硫酸铜、一水硫酸锰、氯化钴、生 物素和水组成；七水硫酸亚铁在所述复合微量元素中的浓度为70g/l，氯化锌在所述复合 微量元素中的浓度为25g/l，五水硫酸铜在所述复合微量元素中的浓度为8g/l，一水硫酸 锰在所述复合微量元素中的浓度为2. 5g/l，氯化钴在所述复合微量元素中的浓度为0. 7g/ 1，生物素在所述复合微量元素中的浓度为0. 3g/l。生物素购自北京经科宏达生物技术有限公司，产品目录号为14J0102 ；2)碳源饲喂阶段步骤1)完成后，向步骤1)的发酵体系中流加葡萄糖和复合 微量元素的混合溶液，混合溶液的流加速度为16ml/hr/L，葡萄糖在混合溶液中的浓度为 450g/l，葡萄糖的流加总量占初始发酵培养基体积(即30L)的20% (体积百分含量)，复 合微量元素在混合溶液中的浓度为7. 5ml/L ；此培养过程中，通气使发酵体系的溶氧量保 持在25% (体积百分含量)；此培养过程的时间为5hr。3)诱导表达阶段步骤2)完成后，向发酵体系中流加甲醇继续培养，使甲醇在发 酵体系中的浓度保持在0. 3% (体积百分含量)，甲醇的流加总量占初始发酵培养基体积 (即30L)的75% (体积百分含量)；此过程中，通气使发酵体系的溶氧量保持在25% (体 积百分含量)。在此诱导过程中每12个小时取样一次测定表达的β-D-半乳糖苷半乳糖水 解酶的累积量及酶活。共诱导表达100小时。取上述发酵过程中，诱导不同时间的发酵液进行SDS-PAGE分析，检测酶的表达量。蛋白的酶活性检测(即酶的效 价检测)酶活定义1单位乳糖酶为在pH5. 2、60°C下每分钟分解oNPG产生Iymol的 oNP (邻硝基酚)所需要的酶量；
酶活检测方法1.取0. 5ml发酵液，稀释100倍，得到酶检测液。2.吸取底物溶液 (2. 5g/L的oNPG的水溶液)800yL放在试管中，在60°C的水浴中平衡3min。3.在诱导表 达的不同时间点，吸取200 μ L待测酶检测液加入试管中，震荡混勻。在空白对照管中加入 200 μ L的0. 1Μ、ρΗ5. 2,HAc-NaAc缓冲液。4. 15min反应之后，吸取ImL的10% TCA溶液加 入每个试管中，震荡混勻。5.从水浴锅中取出反应液试管，每个试管中加入Im0VLmNa2CO3 溶液2mL。6.反应液置于Icm光程的比色皿中，用分光光度计测定420nm下的吸光值，记录 数据。
实验组用由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastor is) LACO Y12的发酵液稀释得到的 酶检测液进行实验。对照组用由对照菌GS115-pPIC9的发酵液稀释得到的酶检测液进行实验。换算公式根据乳糖酶标准曲线，得出乳糖酶酶活单位计算公式酶活力(U/ml)= (YX5XN)/15Y:生成产物oNP的量(μ mol)，根据标准曲线公式计算得出。可将420nm光吸收 值x(扣除空白对照)代入标准曲线公式，得到Y值。5 将200 μ L稀释酶液中的酶活折算为ImL酶液的活性。N:酶液的稀释倍数15:反应时间，min。共进行5罐批实验，结果取平均数。诱导表达100小时，平均效价为7000U/ml发酵液。同时在相同的条件下发酵对照菌GS115-pPIC9，作为对照组。对照组中没有检测到 酶活性蛋白。二、过滤将实验一得到的发酵液进行如下过滤步骤。1、发酵液除杂除菌发酵液经充气压滤机过滤，滤除菌体及其它固形物，收集滤 液，滤液中固形物含量大大降低；2、进一步除菌将步骤1得到的滤液用0. 1-0. 5μπι的微孔陶瓷膜进行循环错流 过滤，并不断补充蒸汽冷凝水，逐步将酶赶出，得到无菌含酶澄清液；无菌含酶澄清液中酶 活为3000U/ml无菌含酶澄清液；因为微孔过滤过程中要加入冷凝水，所以酶的浓度被稀释 了。3、超滤浓缩将步骤2得到的无菌含酶澄清液进行超滤(微孔膜过滤及超滤是在 密闭的条件下进行的)；超滤方法如下将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，得到 含酶的浓缩液，含酶的浓缩液直接进入无菌储罐。所述超滤柱组1含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串 联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组1 (即第一道膜分离系统)；所述超 滤柱组2含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串联形成一小组， 共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组2 (即第二道膜分离系统)。所述超滤柱组1和所 述超滤柱组2沿着含目的酶的澄清液的流动方向串联连接。所述超滤柱组1中，每支所述超滤柱均由壁卷成；所述壁由3层超滤膜和2层导流网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为35密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜 的总面积为30m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为40升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为2万道尔顿。所述超滤柱组2中，每支所述超滤柱均由壁卷成；所述壁由3层超滤膜和2层导流 网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的 澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为60密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜 的总面积为26m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为32升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为2万道尔顿。所述超滤膜带孔；所述超滤膜的孔分布均勻；所述超滤膜的孔径大小均一；所述将含目的酶的澄清液直接依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，是在外界压力 下进行；外界压力大小恒定，外界压力大小为IMpa。结果，经过步骤3的超滤浓缩，酶活为3000U/ml的无菌含酶澄清液被浓缩至3. 3 倍，得到的含酶浓缩液中酶活为10000U/mL。三、添加助剂及干燥向无菌储罐中加入奶粉，搅勻后喷雾干燥，然后将喷粉用奶粉调制成规定的规格， 进行包装，包装采用圆形纤维桶，内用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。检测成品中酶活力，并换算酶的提取率，记录超滤时间。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[发酵液体积(m3) X发酵 液中酶活(U/ml)]；结果，发酵液酶活为7000U/ml发酵液，成品中酶活力为30000U/g ；酶的提取率为 70%。四、效果检测对包装后的成品进行以下检测1、成品酶活检测方法将成品溶于pH5.2、0.2mol/L醋酸缓冲液中，作为酶检测 液，然后按照实验一中所述方法检测酶活；2、成品中水分含量检测方法(QB/T 1803-1993工业酶制剂通用试验方法)；3、酶活力保存率检测方法(QB/T 1804-1993工业酶制剂通用检验规则和标志、包 装、运输、贮存)；4、成品形态、颜色、溶解性。5、细菌总数检测方法(GB 4789. 2-1994食品卫生微生物学检验菌落总数测定)；7、铅(以Pb计)灰分检测方法(中华人民共和国国家标准GB\T 5009. 12-1996. 食品中铅的测定方法)；8、砷(以As计)检测方法(GB/T 5009. 11-2003食品中总砷及无机砷的测定)；9、亚硝酸盐检测方法(食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定国家标准GB/ T5009. 33-2003)；10、致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)检测方法(食品中多种致病菌快速检测方法 SN T 1869-2007)；11、大肠菌群检测方法(GB 4789-1994食品卫生微生物学检验)；理化指标成品酶活力31200U/g成品中水分含量7· 5% (质量百分含量)。酶活力保存率(20°C保存半年)86%形态具有流动性干粉末颜色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.铅(以Pb 计)0· 8mg/kg砷(以As 计)0. 39mg/kg亚硝酸盐8ppm微生物指标细菌总数86个/g致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)未检出大肠菌群15个/g。实施例2、制备β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制剂一、发酵制酶方法与实施例1中所述一致。二、过滤将实验一得到的发酵液进行如下过滤步骤。1、发酵液除杂除菌发酵液经充气压滤机过滤，滤除菌体及其它固形物，收集滤 液，滤液中固形物含量大大降低；2、进一步除菌将步骤1得到的滤液用0. 1-0. 5 μ m的微孔陶瓷膜进行循环错流过 滤，并不断补充蒸汽冷凝水，逐步将酶赶出，得到无菌含酶澄清液；无菌含酶澄清液中酶活 为3000U/ml无菌含酶澄清液；3、超滤浓缩将步骤2得到的无菌含酶澄清液进行超滤(微孔膜过滤及超滤是在 密闭的条件下进行的)；超滤方法如下将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，含酶 的浓缩液直接进入无菌储罐。所述超滤柱组1含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串 联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组1 (即第一道膜分离系统)；所述超 滤柱组2含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串联形成一小组， 共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组2 (即第二道膜分离系统)。所述超滤柱组1和所 述超滤柱组2沿着含目的酶的澄清液的流动方向串联连接。所述超滤柱组1中，每支所述超滤柱均由壁 卷成；所述壁由4层超滤膜和3层导流 网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的 澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为24密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜的总面积为32m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为45升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为1万道尔顿。所述超滤柱组2中，每支所述超滤柱均由壁卷成；所述壁由4层超滤膜和3层导流 网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的 澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为54密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜 的总面积为27m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为30升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为1万道尔顿。
所述超滤膜带孔；所述超滤膜的孔分布均勻；所述超滤膜的孔径大小均一；所述将含目的酶的澄清液直接依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，是在外界压力 下进行；外界压力大小恒定，外界压力大小为IMpa。结果，经过步骤3的超滤浓缩，酶活为3000U/ml的无菌含酶澄清液被浓缩至2. 7 倍，得到的含酶浓缩液中酶活为8000U/mL。三、添加助剂及干燥向无菌储罐中加入麦芽糊精，搅勻后喷雾干燥，然后将喷粉用奶粉调制成规定的 规格，进行包装，包装采用圆形纤维桶，内用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。检测成品中酶活力，并换算酶的提取率，记录超滤时间。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[发酵液体积(m3) X发酵 液中酶活(U/ml)]；结果，成品中酶活力为30000U/g ；酶的提取率为72% ；四、效果检测对包装后的成品进行以下检测1、成品酶活检测方法方法与实施例1中所述一致。；2、水分检测方法方法与实施例1中所述一致；3、酶活力保存率检测方法方法与实施例1中所述一致；4、成品形态、颜色、溶解性方法与实施例1中所述一致。5、细菌总数检测方法方法与实施例1中所述一致；7、铅(以Pb计)灰分检测方法方法与实施例1中所述一致；8、砷(以As计)检测方法方法与实施例1中所述一致；9、亚硝酸盐检测方法方法与实施例1中所述一致；10、致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)检测方法方法与实施例1中所述一 致；11、大肠菌群检测方法方法与实施例1中所述一致；理化指标酶活力30800U/g水分7.6%酶活力保存率(20°C以下半年)86·2%形态具有流动性干粉末
颜色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.3%铅(以Pb计)0.91mg/kg砷(以As计)0. 34mg/kg ；亚硝酸盐9. 2ppm ；微生物指标细菌总数91个/g ； 致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)未检出。大肠菌群20个/g。实施例3、制备β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制剂一、发酵制酶方法与实施例1中所述一致。二、过滤将实验一得到的发酵液进行如下过滤步骤。1、发酵液除杂除菌发酵液经充气压滤机过滤，滤除菌体及其它固形物，收集滤 液，滤液中固形物含量大大降低；2、进一步除菌将步骤1得到的滤液用0. 1-0. 5 μ m的微孔陶瓷膜进行循环错流过 滤，并不断补充蒸汽冷凝水，逐步将酶赶出，得到无菌含酶澄清液；无菌含酶澄清液中酶活 为3000U/ml无菌含酶澄清液；3、超滤浓缩将步骤2得到的无菌含酶澄清液进行超滤(微孔膜过滤及超滤是在 密闭的条件下进行的)；超滤方法如下将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，含酶 的浓缩液直接进入无菌储罐。所述超滤柱组1含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串 联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组1 (即第一道膜分离系统)；所述超 滤柱组2含有12支超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串联形成一小组， 共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组2 (即第二道膜分离系统)。所述超滤柱组1和所 述超滤柱组2沿着含目的酶的澄清液的流动方向串联连接。所述超滤柱组1中，每支所述超滤柱均由壁卷成；所述壁由3层超滤膜和2层导流 网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的 澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为46密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜 的总面积为28m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为52升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为3万道尔顿。所述超滤柱组2中，每支所述超滤柱均由壁卷成；所述壁由3层超滤膜和2层导流 网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的 澄清液沿所述导流网流动；每层导流网的厚度均为86密尔；每支所述超滤柱中各层超滤膜 的总面积为24m2 ；每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长Im ；每支所述超滤柱 的横截面的外直径为8英寸；每支所述超滤柱的平均通透量均为35升/m2/h ；所述超滤膜 的截留分子量为3万道尔顿。所述超滤膜带孔；所述超滤膜的孔分布均勻；所述超滤膜的孔径大小均一；
所述将含目的酶的澄清液直接依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，是在外界压力下进行；外界压力大小恒定，外界压力大小为IMpa。结果，经过步骤3的超滤浓缩，酶活为3000U/ml的无菌含酶澄清液被浓缩至4倍， 得到的含酶浓缩液中酶活为12000U/mL。三、添加助剂及干燥向无菌储罐中加入可溶性淀粉，搅勻后喷雾干燥，然后将喷粉用奶粉调制成规定 的规格，进行包装，包装采用圆形纤维桶，内用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。检测成品中酶活力，并换算酶的提取率，记录超滤时间。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[发酵液体积(m3)X发酵 液中酶活(U/ml)]；结果，成品中酶活力为30000U/g ；酶的提取率为65% ；四、效果检测对包装后的成品进行以下检测1、成品酶活检测方法方法与实施例1中所述一致。；2、水分检测方法方法与实施例1中所述一致；3、酶活力保存率检测方法方法与实施例1中所述一致；4、成品形态、颜色、溶解性方法与实施例1中所述一致。5、细菌总数检测方法方法与实施例1中所述一致；7、铅(以Pb计)灰分检测方法方法与实施例1中所述一致；8、砷(以As计)检测方法方法与实施例1中所述一致；9、亚硝酸盐检测方法方法与实施例1中所述一致；10、致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)检测方法方法与实施例1中所述一 致；11、大肠菌群检测方法方法与实施例1中所述一致；理化指标酶活力31060U/g水分7.5%酶活力保存率(20°C以下半年)86%形态具有流动性干粉末颜色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.铅(以Pb 计)0. 92mg/kg石申(以As 计)0. 36mg/kg亚硝酸盐9.Ippm微生物指标细菌总数88个/g致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)未检出大肠菌群18个/g。
权利要求
一种制备酶制剂的方法，包括如下步骤1)将含目的酶的发酵液进行微孔膜过滤，得到含目的酶的澄清液；2)将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，收集目的酶液；所述超滤柱组1和所述超滤柱组2沿着含目的酶的澄清液的流动方向串联连接；所述超滤柱组1和超滤柱组2均至少含有一支超滤柱；所述超滤柱由壁卷成；所述壁由至少二层超滤膜和至少一层导流网组成，超滤膜和导流网相间排列，每层导流网均夹设在两层超滤膜之间；所述含目的酶的澄清液沿所述导流网流动；所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为24密尔-46密尔，所述超滤柱组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为54密尔-86密尔；3)向所述目的酶液中加入助剂，干燥，得到目的酶制剂；所述步骤1)和步骤2)在密闭条件下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1中含有3支所述超滤柱， 且3支所述超滤柱沿含目的酶的澄清液的流动方向串联连接；和所述超滤柱组2中含有3 支所述超滤柱，且3支所述超滤柱沿含目的酶的澄清液的流动方向串联连接。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1含有12支所述超滤柱， 其中每3支沿含目的酶的澄清液的流动方向串联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形 成超滤柱组1 ；和所述超滤柱组2含有12支所述超滤柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液 的流动方向串联形成一小组，共形成4小组，4小组并联形成超滤柱组2。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1中的各超滤柱中 的每层导流网的厚度均为24密尔，所述超滤柱组2中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均 为54密尔；或所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为35密尔，所述超滤柱组2 中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为60密尔；或所述超滤柱组1中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为46密尔，所述超滤柱组2 中的各超滤柱中的每层导流网的厚度均为86密尔。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1中每支所述超 滤柱中各层超滤膜的总面积为28m2-31m2，具体为30m2、32m2或28m2 ；所述超滤柱组2中每支 所述超滤柱中各层超滤膜的总面积为24m2-27m2，具体为26m2、27m2或24m2。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1中每支所述超 滤柱和所述超滤柱组2中每支所述超滤柱均沿含目的酶澄清液的流动方向长0. 5m或lm ； 所述超滤柱组1中每支所述超滤柱和所述超滤柱组2中每支所述超滤柱的横截面的外直径 均为2英寸或8英寸；所述超滤柱组1中每支所述超滤柱的壁中和所述超滤柱组2中每支 所述超滤柱的壁中的超滤膜均为3-4层、和导流网均为2-3层。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述超滤柱组1中每支所述超 滤柱的平均通透量为40-52升/m2/h，具体为40升/m2/h、45升/m2/h或52升/m2/h ；和所 述超滤柱组2中每支所述超滤柱的平均通透量为30-35升/m2/h，具体为30升/m2/h、32升 /m2/h或35升/m2/h ；和所述超滤膜的截留分子量为1_3万道尔顿，优选为2万道尔顿。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述超滤膜带孔；和所述超滤膜的孔分布均勻；和所述超滤膜的孔径大小均一；和所述将含目的酶的澄清液直接依次通过 超滤柱组1和超滤柱组2，在外界压力下进行；和外界压力大小恒定，外界压力大小为IMpa。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述微孔膜过滤 前，包括将所述含目的酶的发酵液用压滤机进行过滤的步骤；和所述步骤1)中的微孔膜过 滤为循环错流过滤；和所述微孔膜为孔径为0. lum-0. 5um的陶瓷膜；所述压滤机为充气压 滤机或板框压滤机；和所述助剂为奶粉、麦芽糊精或可溶性淀粉；和所述干燥为喷雾干燥。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的酶为3-D-半乳糖苷 半乳糖水解酶；所述含目的酶的发酵液是按照包括如下步骤的方法得到的诱导发酵巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，得到 0 _D_ 半乳糖苷半乳糖水解酶；所述诱导发酵的方法包括如下步骤1)向发酵培养基中添加复合微量元素，再接种巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris) LACO Y12 CGMCC NO. 3630，培养 16 小时；2)向步骤1)的发酵体系中流加葡萄糖和复合微量元素的混合溶液，继续培养5小时；3)向步骤2)的发酵体系中流加甲醇，进行诱导培养，得到0-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；所述步骤2)中，所流加的葡萄糖的总量占所述发酵培养基体积的20% (体积百分含 量)；所述葡萄糖在所述葡萄糖和复合微量元素的混合溶液中的浓度为450g/L ；所述复合 微量元素在所述葡萄糖与复合微量元素的混合溶液中的浓度为7. 5ml/L ；所述葡萄糖和复 合微量元素的混合溶液的流加速度为16ml/hr/L ；所述培养的过程中，所述发酵体系的溶 氧量为25% (体积百分含量)；所述步骤3)中，所流加的甲醇总量占所述发酵培养基体积的75% (体积百分含量)； 流加过程中，使添加的甲醇在所述发酵培养基体积中的浓度保持在0.3% (体积百分含 量)；所述诱导培养的过程中，发酵体系的溶氧量为25% (体积百分含量)；所述诱导培养 的时间为96小时或100小时；所述发酵培养基为如下培养基由磷酸二氢铵、硫酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸钙、 氢氧化钾、葡萄糖和水组成；磷酸二氢铵在发酵培养基中的浓度为60g/l，硫酸钾在发酵培 养基中的浓度为17. 2g/l，硫酸镁在发酵培养基中的浓度为15. 85g/l，磷酸二氢钾在发酵 培养基中的浓度为5g/l，硫酸钙在发酵培养基中的浓度为0. 93g/l，氢氧化钾在发酵培养 基中的浓度为1. 6g/l，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为50g/l ；所述复合微量元素由七水硫酸亚铁、氯化锌、五水硫酸铜、一水硫酸锰、氯化钴、生物素 和水组成；七水硫酸亚铁在所述复合微量元素中的浓度为70g/l，氯化锌在所述复合微量 元素中的浓度为25g/l，五水硫酸铜在所述复合微量元素中的浓度为8g/l，一水硫酸锰在 所述复合微量元素中的浓度为2. 5g/l，氯化钴在所述复合微量元素中的浓度为0. 7g/l，生 物素在所述复合微量元素中的浓度为0. 3g/l ；所述诱导发酵是在50L发酵罐中进行的。
全文摘要
本发明公开了一种制备β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制剂的方法。该方法，包括如下步骤1)将含目的酶的发酵液进行微孔膜过滤，得到含目的酶的澄清液；2)将所述含目的酶的澄清液依次通过超滤柱组1和超滤柱组2，收集目的酶液；3)向所述目的酶液中加入助剂，干燥，得到目的酶制剂；所述步骤1)和步骤2)在密闭条件下进行。本发明方法中，经过微孔膜过滤后的无菌含酶澄清液在超滤的过程中，只需一次流经超滤膜通道即可，无需循环的步骤，与现有技术相比，避免了料液与环境的接触，从而保证产品在提取过程中不遭受污染，还省去了再除菌的步骤。实验证明，本发明方法得到的酶制剂成品中菌的数量少于100个/g，而现有技术生产的酶制剂中菌的数量一般为1000个/g。
文档编号C12R1/84GK101845424SQ20101011021
公开日2010年9月29日 申请日期2010年2月20日 优先权日2010年2月20日
发明者张伟, 毕建成, 许建立, 谷海先 申请人:中诺生物科技发展江苏有限公司