专利名称：一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法
技术领域：
本发明属生物化学中的微生物酶解制糖技术领域，具体涉及一种纤维质原料经生 物酶降解后，制备功能性食品或饲料添加剂一纤维低聚糖的技术。
背景技术：
低聚糖或称寡糖，是由2 10个单糖通过糖苷键连接而成的低聚合度糖类。低聚 糖分普通低聚糖和功能性低聚糖两类。功能性低聚糖是指具有特殊的生物学功能，尤其能 够显著促进人或动物肠道内双歧杆菌增殖，有益于人或动物健康的一类低聚糖，即所谓的 双歧因子。除了能够促进肠道内双歧杆菌等有益菌增殖外，功能性低聚糖另一个重要的生 物学功能是刺激人或动物体内的免疫系统，从而提高免疫力。功能性低聚糖主要作为添加 剂用于食品或饲料领域，近年来，随着人们对自身健康和动物食品安全的关注，功能性低聚 糖类食品或饲料添加剂的开发和应用越来越受到重视。功能性低聚糖的种类很多，目前进 入商业化的品种主要包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低 聚木糖等。纤维低聚糖是由2 10个葡萄糖通过β -1，4-糖苷键结合而成的低聚合度糖类， 是功能性低聚糖的一种，纤维低聚糖主要是由纤维素经过化学或生物酶的方法制备。纤维素酶是水解纤维素成葡萄糖的一组酶的总称，它是一个多组分的复合酶系， 主要有三种组分即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素可在 这三种酶组分的协同作用下彻底水解成葡萄糖。在纤维素酶水解过程中，内切葡聚糖酶以 随机形式切断纤维素链中的β-1，4-糖苷键，生成短链纤维素和纤维低聚糖；随后外切葡 聚糖酶主要作用于短链纤维素和纤维低聚糖的非还原末端，生成聚合度为2的纤维低聚糖 纤维二糖；最后，纤维低聚糖、尤其是纤维二糖，在葡萄糖苷酶的作用下彻底降解成葡 萄糖。从纤维素水解协同机理不难看出，如果纤维素酶系中葡萄糖苷酶的量越低， 则纤维素水解过程中中间产物纤维低聚糖进一步水解成葡萄糖的量则越少，纤维素水解成 纤维低聚糖的得率就越高，产品中无生理活性的单糖葡萄糖的比例就越少。在中国专利申 请200910035998. 8《一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺》中，提供了一种将纤维质原料 中的纤维素选择性降解成功能性纤维低聚糖的方法，其特征是采用“底物原位吸附_固液 分离”的方法拆分纤维素酶系中的β "葡萄糖苷酶，严格控制底物与纤维素酶吸附的条件， 并通过固液分离法除去大量葡萄糖苷酶，用该拆分后的低葡萄糖苷酶活力纤维素 酶水解纤维质原料，可制得葡萄糖含量较低的纤维低聚糖。与未拆分处理的纤维素酶降解 法相比，纤维低聚糖得率提高，纤维低聚糖比例可达总糖的57. 63%。
发明内容
本发明的目的是针对CN 200910035998. 8提供的方法中，低β -葡萄糖苷酶活力 纤维素酶在选择性降解纤维质原料制备纤维低聚糖时，纤维低聚糖得率仍然较低的不足，提出一种更为高效的纤维低聚糖制备工艺方法。纤维素酶是一种受反馈抑制的水解酶类，纤维素酶在水解纤维素过程中各酶组分 受到纤维素水解产物及其中间产物的反馈抑制。低葡萄糖苷酶活力纤维素酶在水解纤 维素制备纤维低聚糖过程中，由于水解体系中葡萄糖苷酶活力低而导致纤维素水解产 物中纤维低聚糖和纤维二糖的累积，有利于纤维低聚糖的制备。但累积的纤维低聚糖将对 内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活力产生反馈抑制作用，从而降低了水解效率和纤维低聚 糖的得率。如果在水解过程中采用某种方法将反应产生的纤维低聚糖及时移走，解除纤维 低聚糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反馈抑制，就可以提高这两种酶的催化效率，从 而提高纤维低聚糖的得率。本发明的技术解决方案为一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，以底物 原位吸附-固液分离法拆分纤维素酶系中的葡萄糖苷酶，通过固液分离法除去大量 β “葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料，其特征是水解进行一段时间以后，将水解物固液分 离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体 积、PH值为4 6的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。可以采用两段水解的工艺，第一次水解6 18小时，第二次水解18 6小时，最 好采用10h+14h的水解分段法；也可以采用三段水解的工艺，第一、二次分别水解6小时，第三次水解12小时。适当增加水解的分段次数，理论上还可以提高纤维低聚糖的得率，但生产成本将 会增加。所述的方法中，纤维质原料可为木聚糖生产废渣、低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠 醛渣，或经过适当预处理的纤维质原料，即以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及 度所采用的物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的方法。吸附和水解过程小规模在摇 瓶或往复式振荡器上进行，大规模在生物反应器、机械搅拌条件下进行；固液分离则可采用 离心固液分离法或板框过滤固液分离法。所用的纤维素酶，可由里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉 (Aspergillusniger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶中的一种或多种提供。本发明的有益效果采用低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶选择性水解纤维质原料制备纤维低聚糖，将 水解过程分为若干个阶段，可以及时移除水解生成的产物纤维低聚糖，有效解除酶解产物 对纤维素酶的反馈抑制作用，从而有利于纤维低聚糖得率的提高。与低葡萄糖苷酶活 力纤维素酶选择性水解纤维质原料制备纤维低聚糖的不分段水解相比，采用两段水解法， 纤维低聚糖得率提高10%左右；采用三段水解法，纤维低聚糖得率提高20%左右。
具体实施例方式以下一 三中所提及的方法，属本领域技术人员公知和已公开的技术。一、用里氏木霉制备纤维素酶1.里氏木霉(T. reesei)菌丝体培养基成分(g/L):葡萄糖10. 0 ；蛋白胨1. 0 ；硫酸 铵1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氢钾2. 0 ；无水氯化钙0. 3 ；七水硫酸镁0. 3 ；七水硫酸亚铁0. 005 ；七水硫酸锰0. 0016 ；七水硫酸锌0. 0014 ；氯化钴0. 002。培养基用0. 05mol/L的柠檬酸钠 缓冲液调节PH值4. 8。2.里氏木霉纤维素酶合成培养基成分(g/L):葡萄糖1. 0 ；纸浆10. 0 ；蛋白胨1. 0 ； 硫酸铵1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氢钾2. 0 ；无水氯化钙0. 3 ；七水硫酸镁0. 3 ；七水硫酸亚铁 0. 005 ；七水硫酸锰0. 0016 ；七水硫酸锌0. 0014 ；氯化钴0. 002。培养基用0. 05mol/L的柠 檬酸钠缓冲液调节PH值4. 8。3.里氏木霉菌丝体的培养50ml菌丝体培养基置于250ml三角瓶中，于121°C下 灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的里氏木霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中 于30 士 1°C、170转/分条件下培养36h后备用。4.里氏木霉纤维素酶的制备培养基于121°C下灭菌30min，冷却至室温，接入上 述培养36h的里氏木霉菌丝体，置于恒温摇床中于170转/分条件下培养，培养温度第一天 控制在30 士 1 °C，以后控制在28 士 1 °C。5.培养4天，用离心机在3000转/分条件下离心IOmin将培养液中的固体物质 (菌体和未被利用的纸浆纤维)分离除去，即得纤维素酶液。滤纸酶活力的测定采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测 定。实验条件底物Whatman滤纸50mg，加入适当稀释倍数的酶液和缓冲液，使反应体系pH 值为4. 8，于50°C、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡器中反应60min，测定反应生成的 葡萄糖量。一个滤纸酶活力的单位(FPIU)定义为标准反应条件下每分钟生成Iymol葡萄 糖的酶量。内切葡聚糖酶活力的测定内切葡聚糖酶活力通常用羧甲基纤维素酶活力表示。 实验条件底物(w/v)的羧甲基纤维素悬浮液，加入适当稀释倍数的酶液和缓冲液，使 反应体系pH值为4. 8，于50°C、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡器中反应30min，测定 反应生成的葡萄糖量。一个羧甲基纤维素酶活力的单位(IU)定义为标准反应条件下每分 钟生成Ιμπιο 葡萄糖的酶量。β -葡萄糖苷酶活力的测定采用对硝基苯基-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测 定。0. Iml适当稀释的酶液与0. 9ml 5mmol/L的pNPG溶液(由0. 05mol/L、pH值为4. 8的 柠檬酸_磷酸氢二钠缓冲液配制)混合后，于50°C、振荡频率80次/分的往复式恒温振荡 器中反应IOmin后立即加入2ml lmol/L的Na2CO3溶液终止反应，再加入IOml蒸馏水，摇 勻。于400nm下测定吸光度。以0. Iml蒸馏水代替酶液作空白对照。每个样品做2 3个 平行样，取平均值。一个葡萄糖苷酶活力单位(IU)定义为标准反应条件下每分钟生成 1 μ mol对硝基苯酚所需的酶量。结果表明，里氏木霉以纸浆为碳源合成纤维素酶，培养4天，滤纸酶活力为 L72FPIU/ml，羧甲基纤维素酶活力为2. 15IU/ml, β -葡萄糖苷酶活力为0. 68IU/ml。二、纤维质原料的获取玉米芯提取木聚糖后的残渣，主要成分为纤维素，其含量为79. 21 % (干基)，水分 含量为59. 92%，是一种很好的纤维素资源。同时，玉米芯碱抽提木聚糖的过程实际上也是 一个纤维质原料碱预处理的过程。因此，玉米芯经碱抽提后，无需再预处理就可以作为纤维 低聚糖生产的原料，直接进行纤维素酶的水解。其原料的获取过程如下1.称取50g NaOH充分溶解于702ml蒸馏水中，加入粉碎粒度为0. 5 Icm的风干
5玉米芯112g (绝干100g)，于90°C下反应3h。2.上述反应物真空抽滤除去木聚糖抽提液，用500ml蒸馏水抽滤洗涤，弃去洗涤液。3.上述滤渣中加入300ml蒸馏水，用40% (w/v)的硫酸中和至pH值6 7，真空 抽滤，并用900ml蒸馏水分3次洗涤、抽滤，得到木聚糖生产废渣。该木聚糖生产废渣就是本技术所需要的纤维低聚糖生产原料；也可以用其他低聚 木糖生产废渣、木糖渣、糠醛渣，或经过适当预处理的其他纤维质原料；预处理的目的是提 高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度，可以采用物理、化学、生物或以上几种方法联 合应用的预处理方法。三、底物原位吸附_固液分离一步酶解法即CN 200910035998. 8《一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺》中所公开的方 法，以经过预处理的纤维质为原料、真菌纤维素酶为初始酶制剂，处理过程如下a.底物原位吸附——将纤维质原料与真菌纤维素酶混合，加入水，PH缓冲液或酸、 碱，混合至固液重量比为1 7 50，pH值为6 8，每克纤维素的纤维素酶用量为5 25FPIU/g，于5 25°C条件下摇或机械搅拌10 60min ；b.固液分离拆分，弃去上清液；c.定向水解——在上述固液分离得到的渣中补加水，pH缓冲液或酸、碱，控制固液 重量比为1 7 50，pH值为4 6，在45 55°C的条件下摇或机械搅拌12 36h;获得 水解糖液。比较例低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶不分段水解木聚糖生产废渣制备纤维低 聚糖采用上述三中所提供的方法进行酶解，测定定向水解后纤维低聚糖和葡萄糖含 量。纤维低聚糖得率及产品中纤维低聚糖占总糖百分数的对比数据见表1和表2。实施例1 低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶二段法水解木聚糖生产废渣制备纤维 低聚糖两段法水解分段时间分别为6+18、10+14、12+12、14+10、18+6h。具体实施步骤如 下分别取上述“三、底物原位吸附_固液分离一步酶解法”中，经“底物原位吸附_固 液分离”拆分除去大量β "葡萄糖苷酶后的固体渣、补充水分和调节PH值得到的水解体系 5个，置于50°C、150转/分的摇床中分别水解6、10、12、14、18h ；固液分离分别得到上清液 纤维低聚糖液146、145、149、149、149ml，在固液分离的沉淀物中分别加入用40%稀硫酸调 节PH值为4 6的水146、145、149、149、149ml，搅拌均勻后置于50°C、150转/分的摇床中 继续分别水解18、14、12、10、6h。测定上述一段固液分离上清液中和二段水解物中的葡萄糖 和纤维低聚糖含量。两段法水解纤维低聚糖总得率及产品中纤维低聚糖占总糖百分数如表 1。糖液中萄萄糖浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下色谱仪 AgilentllOO 高效液相色谱仪；色谱柱Bio_Rad Aminex HPX-87H ；流动相0. 005mol/L 硫 酸，流速0. 6ml/min ；柱温:55°C ；检测器示差折光检测器；进样量=IOyL0外标法测定。糖液中纤维低聚糖浓度测定方法用4% (w/v)的硫酸于121°C条件下水解糖液
660min，使溶液中的纤维低聚糖水解成葡萄糖，用HPLC法测定经稀硫酸水解后的葡萄糖浓 度；用糖液经稀硫酸水解后的葡萄糖浓度减去糖液中起始葡萄糖浓度之差除以1. 1(纤维 低聚糖与单糖葡萄糖之间的转换系数)即可得到纤维低聚糖的含量。纤维低聚糖总得率指两次水解所得的纤维低聚糖量与底物中纤维素量的比值。纤维低聚糖占总糖百分数指产物中纤维低聚糖量除以纤维低聚糖和葡萄糖量之 和。表1 二段水解与不分段水解技术制备纤维低聚糖的比较 结果表明，低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶两段法水解木聚糖生产废渣制备纤维 低聚糖，与不分段水解相比，酶对纤维低聚糖的选择性基本不变，而纤维低聚糖得率有较大 幅度的提高。产物中纤维低聚糖占总糖的百分数在65%左右，而纤维低聚糖得率比不分段 水解时的纤维低聚糖得率提高9 12%，其中以10+14h两段水解的效果为最佳。实施例2 低β _葡萄糖苷酶活力纤维素酶三段法水解木聚糖生产废渣制备纤维 低聚糖三段法水解的分段水解时间分别为6+6+12、6+8+10、6+12+6，具体实施步骤如 下分别取上述“三、底物原位吸附_固液分离一步酶解法”中，经底物原位吸附_固 液分离拆分除去大量β "葡萄糖苷酶后的固体渣、补充水分和调节PH值得到的水解体系3 个，置于50°C、150转/分的摇床中分别水解6、6、6h ；固液分离分别得到上清液纤维低聚糖 液150、150、150ml，在固液分离沉淀物中分别加入用40%稀硫酸调节pH值为4 6的水 150、150、150ml，搅拌均勻后置于50°C、150转/分的摇床中继续分别水解6、8、12h ；固液分 离分别得到上清液纤维低聚糖液150、150、158ml，在固液分离沉淀物中分别加入用40%稀 硫酸调节PH值为4 6的水150、150、158ml，搅拌均勻后置于50°C、150转/分的摇床中继 续分别水解12、10、6h。测定上述一段、二段固液分离上清液中和三段水解物中的葡萄糖和 纤维低聚糖含量。三段法水解纤维低聚糖总得率及产品中葡萄糖占总糖的比例如表2。表2三段水解与不分段水解技术制备纤维低聚糖的比较
结果表明，低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶三段法水解木聚糖生产废渣制备纤维 低聚糖，与不分段水解相比，酶对纤维低聚糖的选择性基本不变，而纤维低聚糖得率有较大 幅度的提高。产物中纤维低聚糖占总糖的百分数在65%左右，而纤维低聚糖得率比不分段 水解时的纤维低聚糖得率提高20 23%，其中以6+6+12h三段法水解为最佳。适当增加水解的分段次数，理论上还可以提高纤维低聚糖的得率，但生产成本将 会增加。
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权利要求
一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，以底物原位吸附 固液分离法拆分纤维素酶系中的β 葡萄糖苷酶，通过固液分离除去大量β 葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料制备纤维低聚糖，其特征是水解进行一段时间以后，将水解物固液分离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体积、pH值为4～6的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。
2.如权利要求1所述的提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，其特征是采用两段水解 的工艺，第一次水解6 18小时，第二次水解18 6小时。
3.如权利要求1所述的提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，其特征是采用三段水解 的工艺，第一、二次分别水解6小时，第三次水解12小时。
全文摘要
一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，以底物原位吸附-固液分离法拆分纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶，通过固液分离除去大量β-葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料制备纤维低聚糖，其特征是采用分段水解的方法，在某一优选的分段时间点将水解物固液分离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体积、pH值为4～6的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。
文档编号C12P19/14GK101914596SQ20101010975
公开日2010年12月15日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者余世袁, 勇强, 徐勇, 王瑱瑱 申请人:南京林业大学