专利名称：凝结芽孢杆菌的荧光定量pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)的荧光定量PCR快速检测方法。
背景技术：
引起罐头食品酸败变质而又不胖听(即产酸不产气)的微生物在罐头工业上称为平酸菌。它是需氧芽孢杆菌科中的一群高温型，具有嗜热、耐热的特点，其适宜生长温度为 45°C 60°C。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。凝结芽孢杆菌同时也是益生素，是我国农业部2004年被批准使用的微生物级饲料添加剂品种之一。因其具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平、能够避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点，一直受世人瞩目。当前，凝结芽孢杆菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定，该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长，而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高，对食品安全的需求越来越高，同时，凝结芽孢杆菌微生态制剂的研制，生产规模的扩大，传统检测方法的低效率已经不能满足当前批量化的检测任务。因而，研究的凝结芽孢杆菌快速检测方法很有必要。荧光定量 PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，具有高灵敏性、特异性和精确性的特点。荧光定量PCR技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃，有效解决了 PCR污染和对模板定量不准确的问题。目前，该技术已广泛应用于食源性微生物检测领域。然而，迄今国内还未见有利于荧光定量PCR方法快速检测凝结芽孢杆菌的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR方法。本发明的技术解决方案是一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于有如下步骤首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用。然后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25 μ 1，包括提取的基因组 DNA，2y 1 ； 10 X PCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+ 1. 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；凝结芽孢杆菌特异性引物、探针各IOpmol ；最后加(MH2O至25 μ 1 ；设置荧光定量PCR仪的程序参数为37°C 2min ；95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火40s，同时收集 FAM荧光，40个循环；4°C保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为B. coagF-1 :5，-CGAACTCGAAGAATATGATGACA-3，；B. coagF-2 :5，-TCATCTTTCGACATGATTTGG-3，。特异性探针为
B. coagF-3 5’ -FAM-TCACAAGCTCTTGATAAGCATTCCGG-3 ’。荧光定量PCR反应结束后，凝结芽孢杆菌能形成典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 < 35。本发明提供了扩增凝结芽孢杆菌的特异引物B. CoagF-I、B. coagF-2和探针 B. coagF-3，从而提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，同现有技术相比具有如下优点1.检测速度快，直接利用增菌液的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，而分离纯化和生化鉴定一般需要48 72h。2.成本低，由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用，降低了检测成本。3.灵敏度高，由于该技术在PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，提高了检测的灵敏度。
具体实施例方式首先无菌操作取Ig待测样品，加入盛有9ml酸性肉汤(酸性罐头食品)或溴甲酚紫葡萄糖肉汤(低酸性罐头食品及其它待测样品)的灭菌容器内，55°C 士 1°C，需氧条件下培养48h。取培养的菌液加入离心管中，以12000rpm离心lmin，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。然后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25 μ 1，包括提取的基因组 DNA，2y 1 ； 10 X PCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+ 1. 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；凝结芽孢杆菌特异性引物、探针各IOpmol ；最后加(MH2O至25 μ 1 ；设置荧光定量PCR仪的程序参数为37°C 2min ；95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火40s，同时收集 FAM荧光，40个循环；4°C保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为L. fermenF-1 :5，-CGTCGTTGACGAATACATCC-3，；
L. fermenR-2 5’ -TCGATACGACCAGAAGCAAC-3 ’。特异性探针为L. fermenF-3 :5’ -FAM-CAAGCCATTCATGATGCCTGTCG-3’荧光定量PCR反应结束后，凝结芽孢杆菌能形成典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 < 35。
权利要求
1.一种快速检测凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物和探针；然后使用该引物和探针对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和检测，其中所述的凝结芽孢杆菌特异性引物为B. coagF-1 :5’ -CGAACTCGAAGAATATGATGACA-3’ ；B. coagF-2 :5，-TCATCTTTCGACATGATTTGG-3，。特异性探针为B. coagF-3 :5’ -FAM-TCACAAGCTCTTGATAAGCATTCCGG-3，。
2.根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其加样参数为每个荧光定量PCR反应总体积为25 μ 1，包括提取的基因组DNA，2 μ 1 ； 10XPCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+L 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；凝结芽孢杆菌特异性引物、 探针各IOpmol ；最后加ddH20至25 μ 1 ；设置荧光定量PCR仪的程序参数为37°C ^iin ；95°C 预变性30s，95°C变性5s，60°C退火40s，同时收集FAM荧光，40个循环；4°C保存。
全文摘要
一种快速检测凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR方法。首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和检测。其加样参数为每个荧光定量PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；UNG酶1u；dNTP 0.1mmol/L 凝结芽孢杆菌特异性引物、探针各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置荧光定量PCR仪的程序参数为37℃2min；95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火40s，同时收集FAM荧光，40个循环；4℃保存。具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点。
文档编号C12R1/07GK102304559SQ20101011020
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者刘云国, 唐静, 孙涛, 张健, 王英超, 祝素珍, 马云, 马维兴 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心