专利名称：系列镇痛活性肽dkk及其类似物的获得方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及系列镇痛活性肽DKK及其类似物的获得方法 和作为镇痛药物在医药领域中的应用，具体地说，本发明涉及系列镇痛活性肽DKK及其衍 生物或类似物或活性片段结构及其获得方法和作为镇痛药物在医药领域中的应用。
背景技术：
疼痛是人类共有而又有较大个体差异性的一种不愉快的主观感觉，它在躯体受到 威胁时提供警报信号，是生命不可缺少的一种保护机制。专利名称为蝎抗神经兴奋肽(发 明专利号ZL 00112016.6)的发明提供了一种蝎抗神经兴奋肽及其基因序列和作用为预 防、治疗神经兴奋性疾病(如癫痫、惊厥等)的药物。Ch皿-Guang Wang等在文章中报道 了抗癫痫肽结构(Chun_Guang Wang， Xiao_Lin He， Feng Shao， Wei Liu， Min-Hua Ling， Da-Cheng W肌g and Cheng-WuChi. Molecular characterization of 肌肌ti一印il印sy peptide from thescorpion Buthus martensi Karsch. Eur. J. Biochem. 268，2480—2485， 2001)。上述专利和论文所涉及的多肽是否具有镇痛生物活性并没有报道，因此，有必要针 对其镇痛生物活性进行系统研究。
发明内容
本发明的一个目的是利用基因工程技术表达系列镇痛活性肽DKK，针对纯化的系 列镇痛活性肽DKK，进行其体内镇痛生物活性研究。 本发明的第二个目的是在证明系列镇痛活性肽DKK具有镇痛生物活性的基础上， 利用基因工程技术获得系列镇痛活性肽DKK的衍生物或类似物或活性片段，所获得的系列 镇痛活性肽DKK的衍生物或类似物或活性片段仍具有镇痛生物活性。 本发明的第三个目的是提供获得系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活 性片段的方法，该方法包括 1.分别构建系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段所编码DNA的重 组表达载体； 2.用步骤1的重组载体分别转化适当的宿主细胞； 3.在适合于表达系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的条件下 培养步骤2的被转化的宿主细胞； 4.收获并纯化所得到的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段。 本发明的第四个目的是提供含有如上限定的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或
类似物或活性片段和一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。 本发明的另一个目的是提供如上限定的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似
物或活性片段在生产镇痛药物中的应用。 本发明提供了一种上述载体转化的宿主细胞。 本发明提供的上述表达产物分离纯化可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法，从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达 产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测产物的存在及相 应分子大小。 本发明还提供了系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段在生物制 药领域的应用，具体地说包括镇痛生物活性的应用。 本发明首次进行系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的小鼠体 内镇痛生物学活性实验。 本发明进一步涉及含有上述系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片 段和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已 知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington' s Pharmaceutical Science, 15th. ，Mack PublishingCompany， 1980)。可通过各禾中给药途径， 特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药 物组合物。 可使用本发明的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段或含有该 系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的药物组合物作为治疗剂，用于治疗 特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病 的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体 化原则来确定。 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞等。 本发明的系列镇痛活性肽及DKK及其衍生物或类似物或活性片段获得方法简单， 获得的产物具有较好的镇痛活性。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限
制本发明特批权利要求的范围。
实施例1 : 镇痛活性肽DKK-1的获得 1.镇痛活性肽DKK-1表达质粒的构建 本实施例列举描述用于表达本发明镇痛活性肽DKK-1的重组表达质粒的构建策 略和基本方法。 根据镇痛活性肽DKK-1 ( —级结构DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWG LACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK)的氨基酸序列，设计相应寡核苷酸引物1和引物2，同时在上 述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上限制性核酸内切酶Nde I和BamHI水解位点序列。 以已经构建含有DKK-1基因的质粒为模板，利用上述引物1和引物2进行PCR扩增，琼脂糖 凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收，经过限制性核酸内切酶Nde I和BamHI双 酶切后，与同样进行双酶切的表达质粒在T4 DNA ligase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5a ，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化 子后进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法构建获得镇痛活性肽DKK-1 表达质粒。 2.镇痛活性肽DKK-1的获得 将上述镇痛活性肽DKK-1表达质粒热转化大肠杆菌BL21 ( A DE3)，然后从该LB固 体平板上挑取单菌落后接种至3ml LB (含卡那抗生素，50 y g/ml)，于37°C ， 200r/min振荡 过夜培养。按照1%接种量将过夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三 角瓶中，于37°C ， 200r/min振荡培养至0D6。。为0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 166mmol/L的诱导 物异丙基P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4h。结束发酵，3000g，4。C离心20min，收集菌 体。用40ml裂解缓冲液(0. 1M PBS，O. 15M NaCl，50mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超 声结束后于12， OOOg， 4t:离心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合 并两次上清液，上样于O. 1M PBS(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不 同阶段的pH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)进行洗脱并收 获洗脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE验证纯度。该重组表达质粒编码表达产物的结构
KK;、上、述获得的表达产物，利用化学法在M处断裂肽链，从而获得镇痛活性肽DKK-1，结构特 实施例2 : 镇痛活性肽DKK-2的获得 本实施例获得镇痛活性肽DKK-2的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本 方法。镇痛活性肽DKK-2的结构特征为DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGL
ACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。 实施例3 : 镇痛活性肽DKK-3的获得 本实施例获得镇痛活性肽DKK-3的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本 方法。镇痛活性肽DKK-3的结构特征为DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGL
ACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。 实施例4 : 镇痛活性肽DKK-4的获得 本实施例获得镇痛活性肽DKK-4的策略和基本方法，类同实施例1的策略和基本 方法。镇痛活性肽DKK-4的结构特征为DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCWTWKL ACWCQGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。
实施例5 : 系列镇痛活性肽DKK类似物的获得 本实施例获得系列镇痛活性肽DKK类似物的策略和基本方法，类同实施例1的策 略和基本方法。系列镇痛活性肽DKK的类似物结构包括DKK-1 :
DKK-2 :
DKK-3 :
DKK-4 :KK。 实施例6 : 系列镇痛活性肽DKK及其类似物体内镇痛活性检测一小鼠醋酸扭体法 本实施例通过小鼠体内镇痛模型旨在验证系列镇痛活性肽DKK及其类似物的镇
痛活性。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。 小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学剌激物注入昆明种小鼠腹腔内，继 而引起深部的、大面积而较持久的疼痛剌激，致使小鼠产生"扭体"反应(腹部内凹、躯干与 后腿伸张、臀部高起)。 18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组IO只，样品实验组分别腹腔注射系 列镇痛活性肽DKK及其类似物样品1. 23mg/kg体重，20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0. 6% (v/V)醋酸引起内脏痛，5min后记录小鼠10min内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐
水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。
镇痛生物活性实验结果表明 生理盐水空白组实验动物扭体次数(Mean士SEM)为45. 80 ±2. 99 ; 阳性对照组(吗啡，1. OOmg/kg体重)实验动物扭体次数(Mean士SEM)为
28. 95±1. 85，扭体抑制率为36. 79% ; 镇痛活性肽DKK-1组(1. 23mg/kg体重)的实验动物扭体抑制率为37. 16% ;镇痛 活性肽DKK-2组(1. 23mg/kg体重)的实验动物扭体抑制率为36. 23% ;镇痛活性肽DKK-3 组(1. 23mg/kg体重)的实验动物扭体抑制率为38. 06% ;镇痛活性肽DKK-4组(1. 23mg/kg 体重)的实验动物扭体抑制率为36. 86% ; 系列镇痛活性肽DKK类似物各组(1. 23mg/kg体重)的实验动物扭体抑制率均在 33. 25%以上。
抑制率
空白组扭体次数-给药组扭体次数 空白组扭体次数 ~
xl00o/o
权利要求
系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段在制备镇痛药物中的应用。
2. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的镇痛活性肽DKK分别含有如下氨基 酸序列
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的镇痛活性肽DKK的类似物是通过 镇痛活性肽DKK的N末端前加一个甲硫氨酸残基而获得，其包括如下氨基酸序列
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的系列镇痛活性肽DKK的衍生物或活 性片段，包含权利要求2或3所述的氨基酸序列全序或片段。
5. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或 类似物或活性片段，可利用基因工程技术表达获得，其表达宿主细胞为原核细胞或真核细 胞，其方法包括(1) 分别构建系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段所编码DNA的重组 表达载体；(2) 用步骤1的重组载体分别转化适当的宿主细胞；(3) 在适合于表达系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段的条件下培养 步骤2的被转化的宿主细胞；(4) 收获并纯化所得到的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段。
6. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或 类似物或活性片段，可以利用化学合成技术获得，化学合成为人工合成或合成仪合成。
7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的系列镇痛活性肽DKK及其衍生物 或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制 剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及系列镇痛活性肽DKK及其类似物与其获得方法和作为镇痛药物在医药领域中的应用。所述镇痛活性肽分别含有如下氨基酸序列DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCWTWKLACWCQGLPDDKTWKSESNTCGGKK。所述系列镇痛活性肽DKK及其衍生物或类似物或活性片段，可利用基因工程技术表达获得，获得方法简单，获得的产物具有很好的镇痛活性。
文档编号C12N15/79GK101766808SQ201010120159
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者吴春福, 宋永波, 张景海 申请人:沈阳药科大学