专利名称：细胞培养混合物的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品的分离纯化的方法，特别涉及用以获得目的生物制品的细胞培养混合物的分离纯化方法。
背景技术：
目的生物制品的培养混合物的分离纯化是生物制品生产中最关键步骤之一，它是收获目的培养混合物与进一步下游加工之间的枢纽步骤，对生物制品的产量、质量、可重复性有着直接的影响，也决定了生物制品整体生产工艺的效率和成本耗费。现有生物制品生产工艺中常用的目的培养混合物分离纯化方法多为如离心、凝胶层析、过滤等几种方法的联合使用，多存在着许多问题，首先培养混合物在设备之间的转移容易造成产品的污染，其次，所使用的设备单批次处理量较少，不易进行生产规模扩大，再次，所用设备重复使用需进行反复清洗，增加了劳动力与生产成本的耗费。另外，现有工艺常常不能完全分离纯化目的培养混合物，造成最终的生物制品异源物质比较多。目前，人类、家禽、家畜的常规和非常规免疫是保障人类生命、健康的重要手段，所以各种病毒疫苗的需求量也在不断地增加。而大多数病毒疫苗都是通过细胞培养后分离纯化获得的，所以对于高效率、高品质地分离纯化细胞培养混合物的需求越来越受到人们的关注。
发明内容
使用现有的技术手段来分离纯化细胞培养混合物，由于存在上述问题，分离纯化过程复杂，不能大量、快速且高纯度地分离纯化细胞培养混合物，造成分离纯化的成本较高，生产时间长等缺陷，另外，最终的生物制品异源物质比较多，使用时副反应比较大。可见，现有的分离纯化方法已无法满足现实生产、生活的需要。因此，本发明特别针对细胞培养混合物的分离提纯进行了潜心研究，发现细胞培养混合物具有组分包含复杂、目的产物的含量普遍较低、起始用量较大、不同病毒颗粒大小具有一定差异等特点。对于细胞培养混合物这类生物制品，本发明人开创性地提出了对其进行分离纯化的新方法，克服了上述缺陷。本发明提供了一种细胞培养混合物的分离纯化方法，1. 一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤，该过滤器具有至少两层孔径不同的过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，最后一层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。2.根据技术方案1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，细胞培养混合物选自动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物或者分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。3.根据技术方案1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器具有三层、四层或五层过滤膜。4.根据技术方案1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，在过滤过程中， 过滤膜前后的压差约为0. 05-0. IMPa05.根据技术方案1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器是过滤膜为折叠形式的过滤器。6.根据技术方案5所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器设
置有壳体；折叠式的过滤膜将壳体内部分为中央区和边缘区。7.根据技术方案1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所以细胞培养混合物选自口蹄疫病毒培养混合物，猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，猪瘟病毒培养混合物，猪肾细胞0 细胞)及猪睾丸细胞(ST细胞)；狂犬病毒培养混合物，乙型肝炎病毒培养混合物，流行性乙型脑炎病毒培养混合物，甲型肝炎病毒培养混合物或者脊髓灰质炎病毒培养混合物。8.根据技术方案1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，待过滤液的处理量为每0. OlMpa压差下每平方米过滤膜的流量范围约为100 200L。9.根据技术方案1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述细胞培养混合物是口蹄疫病毒培养混合物，所述过滤膜是两层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。10.根据技术方案1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述细胞培养混合物是猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，所述过滤膜是三层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 2 2 μ m，第三层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。本发明的一种细胞培养混合物的分离纯化方法，具有针对性强，处理量大、分离纯化步骤简单、产品质量稳定、成本低等优点，特别适合用于分离纯化口蹄疫病毒培养混合物或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物等，得到纯度较高的病毒疫苗混合物。另外，本发明细胞培养混合物的分离纯化方法中，可达到较大的单次处理量，高至几百升，从而易于扩大生产规模；并且，本发明细胞培养混合物的分离纯化方法对目的物分离纯化较为彻底，产物中的细胞碎片及其他较大物质均被截留，从而减少了生物制品的免疫接种副反应，减少了目的培养物的转移暴露，从而减少了目的物被污染的几率。本发明细胞培养混合物的分离纯化方法过程控制简易，使用过滤元件可以为一次性使用产品，无清洗、清洗验证等过程，节省劳动力和生产成本，提高生产效率；本发明细胞培养混合物的分离纯化方法过程控制简易，可以根据不同分离纯化目的物选择不同大小过滤元件及其组合，使用灵活，应用范围广泛。
具体实施例方式本发明中的术语“动物”，指的是非人类的各种动物，特别优选的是畜类或禽类动物，比如猪、狗、牛、羊、鸡、鸭和/或鹅等。本发明中的术语“细胞培养混合物”，是指在现有的条件下培养病毒、抗体等所获得的细胞培养液混合物。具体地讲，所述细胞培养混合物，包括动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物及分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。其中所述细胞培养混合物中主要含有病毒颗粒(或抗体)，以及培养细胞、培养细胞碎片、蛋白质、核酸、多糖等杂质，如果所用的细胞培养基为含血清细胞培养基，则所得混合物中还含有残余血清。所得滤出液中要求具有较高含量的目的病毒，而所含杂质例如宿主蛋白、宿主核酸等尽量控制在较低水平，无菌类污染。病毒直径通常在20nm-200nm之间，而针对不同的病毒，采用不同的细胞进行培养，发明人仔细地研究了不同病毒及抗体的细胞培养混合物，所述动物用病毒细胞培养混合物具体如下口蹄疫病毒培养混合物，病毒直径约20-25nm，常用培养细胞为幼仓鼠肾传代细胞(BHK21细胞)；猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，病毒直径约50-60nm，常用培养细胞为Marcl45细胞；猪瘟病毒培养混合物，病毒直径约70nm，常用培养细胞为牛睾丸原代细胞(BT细胞)、猪肾细胞0 细胞)及猪睾丸细胞(ST细胞)；狂犬病毒培养混合物，病毒长约170-180nm，宽约75_80nm，常用的培养细胞为BHK21。所述人用病毒细胞培养混合物如下狂犬病毒培养混合物，病毒长约170-180nm， 宽约75-80nm，常用的培养细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)；乙型肝炎病毒培养混合物， 病毒直径约22nm，常用的培养细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)；流行性乙型脑炎病毒培养混合物，病毒直径约40nm，常用的培养细胞为Vero细胞；甲型肝炎病毒培养混合物，病毒直径约27-32nm，常用的培养细胞为人二倍体细胞KMB17或2BS ；脊髓灰质炎病毒培养混合物，病毒直径约27-30nm，常用的培养细胞为人二倍体细胞2BS。由上述可知，大多数病毒的直径约为20-100nm，个别病毒的直径约在100-200nm 之间。对细胞培养混合物进行分离得到的目标混合物要求无污染物，并且杂质的含量应尽量控制到最低水平，其中所述污染物如细胞、细菌、霉菌和/或支原体等，所述杂质如杂蛋白、核酸和/或牛血清等，不同生物制品对此有不同的要求和限制。发明人发现各种污染物的直径与病毒的直径相比，均存在相当的差异，而在细胞培养混合物中，动物细胞的直径通常约为10-100 μ m，细菌细胞直径通常约为0. 5-2. 0 μ m， 真菌细胞直径通常约为10-40 μ m,支原体直径通常约为0. 2-0. 3 μ m。因此，通过选择恰当过滤条件，可以大大地提高过滤效率，从而减少得到最终产物的步骤，提高生产效率，降低成本。本发明提供了一种细胞培养混合物的分离纯化方法，该方法包括将细胞培养混合物经双层或多层过滤膜进行过滤，得到分离纯化好的滤出液。该双层或多层过滤膜的各层膜的公称孔径在过滤方向上逐级变小，比如二层、三层、四层、五层或六层，优选为三层、四层或五层过滤膜，根据细胞培养混合物的病毒与细胞的特点，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，最后一层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m，如果第一层过滤膜的公称孔径小于2 μ m，那么较多污染物或杂质会很快堵塞各孔道，从而使过滤无法顺利进行，如果第一层过滤膜的公称孔径大于10 μ m，那么有部分细胞等污染物会通过第一层过滤膜，从而积存在第二层过滤膜上，从而使过滤效率变低；该如果最后一层过滤膜的公称孔径小于 0. Iym,会增加过滤阻力，不利于提高过滤效率，如果大于0. 2 μ m，会使最终滤出液的杂质含量太多，无法达到所要求的纯度。第一层过滤膜可以将较大直径的污染物或杂质过滤掉，最后一层是尽量将小直径的污染物与杂质过滤掉，根据细胞培养液的特点，逐层过滤，从而得到纯度较高的病毒滤出液。中间的过滤膜的公称孔径介于第一层过滤膜与最后一层过滤膜的公称孔径之间， 中间过滤膜的公称孔径可以根据细胞培养混合物的特点进行调整，比如在使用三层过滤膜时，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 2 2μπι， 第三层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m，使用多层过滤膜的结构，可以达到深层过滤的目的。公称孔径约为2 10 μ m的第一层过滤膜可以过滤大部分较粗大的杂质，比如细胞、细胞碎片；经过层层逐级过滤，最终达到除菌、去除支原体级别的有用组分滤过过滤膜， 形成质量基本达标的过滤液产物，该产物可以用于进一步后处理，比如加入佐剂、冷冻干燥、分包装等。上述过滤膜可以选用现在市场上的所有孔径合适的过滤膜。过滤膜的材料优选为纤维与无机助滤剂如珍珠碳和硅藻土以及粘接剂粘合而成，所述纤维可以选自聚丙烯纤维、玻璃纤维、醋酸纤维素、硝酸纤维素以及以上纤维的混合纤维等，各层过滤膜的材料可以相同或不同，优选使用的纤维为聚丙烯纤维。在本文中“公称孔径”指的过滤膜产品上标注的公称孔径。多层过滤膜可以是复合在一起的多层过滤膜，也可以是适当孔径的单层过滤膜叠置在一起而形成的多层过滤膜，也可以是一体制成的具有多个不同孔径过滤层的过滤膜。 只要符合相关的孔径要求即可。处理量可以根据过滤膜的选择与细胞培养混合物的特点来确定，对于以上例举的细胞培养混合物，优选处理量为约100 200L/(m2. h. 1 OOmbar)，即IOOmbar (0. OlMpa)压差下每平方米过滤膜的流量范围，优选约120 180L/(m2. h. IOOmbar)，进一步优选约140 170L/(m2· h. 1 OOmbar)。在该100 200L/ (m2. h. IOOmbar)范围内，通常可以得到质量稳定的产品。如果太高，部分不希望的杂质可能会进入过滤液，使过滤效果降低；如果太低，对于提高过滤效率不利。对于上述细胞培养混合物，优选为动物用病毒培养混合物，例如口蹄疫病毒培养混合物、猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物、猪瘟病毒培养混合物。根据动物用病毒培养混合物中所培养的病毒的不同，可以适当选择不同的过滤膜，具体地，对于为口蹄疫病毒培养混合物，由于其病毒直径约20-25nm，直径较小，所以从提高过滤效率的角度考虑，优选使用双层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第2层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。对于猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，病毒直径约50-60nm，优选使用3层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 2 2 μ m,最后一层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。上述过滤优选在过滤前加压和/或在过滤后减压的方式来提高过滤速度。比如使用加压泵(如蠕动泵)或压缩气对培养混合物进行加压，使其通过过滤膜，也可以使用在过滤后一侧设置真空泵等减压设备，促使液体通过过滤膜，为了提高过滤速度，又不影响滤出液的质量，整个过滤膜两侧(即过滤前后)的压差优选约为0.05-0. IMPa，更优选约 0. 06-0. OSMPa0当然，对于该压差，可以根据过滤膜的孔径以及过滤膜的数量进行适当调整，以在保证质量的前提下，最大可能地提高过滤效率为准。
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对于过滤膜的具体形式，可以根据需要进行设置，为了增加使单位体积的过滤膜的面积，可以使用折叠形式的过滤器，过滤器包括壳体，折叠式的过滤膜将壳体内部分为中央区和边缘区。待过滤的流体流入壳体的边缘区，经过折叠式的过滤膜流入中间区，从而得到目标产物。这样的折叠形式的过滤器的过滤面积可以约为0.6m2 1.8m2/10"，这样的过滤面积，可达到较大的单次处理量，高至上百升，从而易于扩大生产规模。为了进一步清晰地说明本发明的以上实施方式，提供了以下实施例。该实施例仅为了进一步说明本发明的方法，对本发明的保护范围不起限定作用。实施例1用深层过i虎法分离钝化BHK21细胞,、口g帝疮病毒培养、混合物从细胞工作种子液氮库中复苏BHK21细胞，先在方瓶中传代扩增，接着通过转瓶、 5L生物反应器、120L生物反应器的顺序依次扩增培养，之后用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于CLAVORUS 650L反应器(北京天和瑞生物科技公司)中进行大规模扩增培养， 生物反应器的工作体积为400L，培养5天后，在所得的BHK21细胞上接种口蹄疫病毒，将生物反应器中的细胞培养液更换为病毒培养液，培养接种后的BHK21细胞，生物反应器培养 12-24hr左右后一次性收获病毒液，将所收获的400L培养混合物4°C低温储存于储液罐中。 所得培养混合物中病毒浓度约为4. 5μ g/mL，其中含有BHK21细胞、BHK21细胞碎片、蛋白、 核酸、多糖以及牛血清等，将上述培养混合物分为等量的两份，一份用于下述实验，另一份用于对比例1。将三层不同孔径过滤膜组装至过滤器中，过滤膜各层的公称孔径分别为3μπι， 0. 2 μ m，过滤膜总面积为lm2。利用无菌压缩空气将储液罐中的200L培养上清液经连接管道通过进液口打入过滤器壳体与过滤元件之间的空间中，上清液通过滤膜逐级过滤，经20 分钟处理完所有上述200L培养混合物，得到滤出液，期间过滤膜两侧的压差从约0. 05MPa 增加到约0. 06MPao收集收集容器中的液体，可进一步用于下游反应。所得滤出液中病毒浓度约为3. 7 μ g/mL，与培养液相比具有80%的回收率，其中经鉴定无细胞，无细菌、霉菌、支原体的污染，杂蛋白去除率达到99%，残余DNA含量< 100pg/mL，内毒素含量< 10EU/ml。按照中华人民共和国兽药典二零零五年版第三部附录中无菌检验法、支原体检验法进行细菌、支原体检验，利用酶联免疫法测定杂蛋白含量，光谱法测定核酸含量，凝胶法测定内毒素含量。实施例2用深层过滤法分离纯化Marcl45细胞与猪繁殖与呼吸综合征病毒(蓝耳病病毒)培养混合物从细胞工作种子液氮库中复苏Marcl45细胞，先在方瓶中传代扩增，接着通过转瓶、5L生物反应器、120L生物反应器的顺序依次扩增培养，之后用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于CLAVORUS 650L反应器(北京天和瑞生物科技公司)中进行大规模扩增培养，生物反应器的工作体积为300L，培养4天后，在所得的Marcl45细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，将生物反应器中的细胞培养液更换为病毒培养液，培养接种后的Marcl45 细胞，病毒培养6hr后开始灌注培养，并从第一天起开始收获病毒液，将所收获的800L培养混合物4°C低温储存于储液罐中。所得培养混合物中除病毒外含有Marcl45细胞、Marcl45 细胞碎片、蛋白、核酸、多糖以及牛血清等，将上述培养混合物分为等量的两份，一份用于下述实验，另一份用于对比例2。过滤膜各层的公称孔径分别为8 μ m，0. 45 μ m，0. 1 μ m。操作压力差为0. 05-0. OSMPa0 30分钟即处理完所有培养液。可达到约83%的回收率，无细胞、无细菌、真菌、支原体的污染，杂蛋白去除率达到99%，残余DNA含量< 100pg/mL，内毒素含量< IOEU/ ml。按照中华人民共和国兽药典二零零五年版第三部附录中无菌检验法、支原体检验法进行细菌、支原体检验，利用酶联免疫法测定杂蛋白含量，光谱法测定核酸含量，凝胶法测定内毒素含量。比较例1将实施例1中得到的另外200L培养混合物通过公称孔径为0. 45 μ m的单层过滤膜直接过滤，经期间过滤膜两侧的压差从0. 05MPa增加到0. 5MPa,仅处理100L的培养混合物，无法完成全部纯化分离。收集收集容器中的液体的性质为病毒颗粒、残留DNA、蛋白质，内毒素，其中残留DNA含量500pg/mL，杂蛋白去除率仅50%，内毒素含量为30EU/ml。比较例2将实施例2中得到的另外400L Marcl45细胞与猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，通过公称孔径为0. 1 μ m的单层过滤膜直接过滤，仅20min过滤膜即堵塞，无法完成全部纯化分离。
权利要求
1.一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤， 该过滤器具有至少两层孔径不同的过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径为2 10 μ m，最后一层过滤膜的公称孔径为 0. 1 0. 2 μ Hio
2.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，细胞培养混合物选自动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物或者分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。
3.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器具有三层、四层或五层过滤膜。
4.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，在过滤过程中，过滤膜前后的压差为0. 05-0. IMPa0
5.根据权利要求1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器是过滤膜为折叠形式的过滤器。
6.根据权利要求5所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器设置有壳体；折叠式的过滤膜将壳体内部分为中央区和边缘区。
7.根据权利要求1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述细胞培养混合物选自口蹄疫病毒培养混合物，猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，猪瘟病毒培养混合物，猪肾细胞(PK细胞)及猪睾丸细胞(ST细胞)；狂犬病毒培养混合物，乙型肝炎病毒培养混合物，流行性乙型脑炎病毒培养混合物，甲型肝炎病毒培养混合物或者脊髓灰质炎病毒培养混合物。
8.根据权利要求1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，待过滤液的处理量为每0. OlMpa压差下每平方米过滤膜的流量范围为100 200L。
9.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述细胞培养混合物是口蹄疫病毒培养混合物，所述过滤膜是两层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径为2 10 μ m,第二层过滤膜的公称孔径为0. 1 0. 2 μ m。
10.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述细胞培养混合物是猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，所述过滤膜是三层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径为0. 2 2 μ m，第三层过滤膜的公称孔径为 0. 1 0. 2 μ Hio
全文摘要
本发明公开了一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤，该过滤器具有至少两层过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径约为2～10μm，最后一层过滤膜的公称孔径约为0.1～0.2μm。本发明的细胞培养混合物的分离纯化方法，具有针对性强，处理量大、分离纯化步骤简单、产品质量稳定、成本低等优点。
文档编号C12N7/02GK102191226SQ201010119980
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月8日 优先权日2010年3月8日
发明者刘俊生, 王建超, 陈文庆 申请人:北京清大天一科技有限公司