专利名称：一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法
技术领域：
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技术背景发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物遗传转化及转基因 研究的一种重要工具，它属根瘤菌科(Rhizobiaceae)，农杆菌属(Agrobacterium)的一种 革兰氏阴性土壤细菌。茶树(Camellia sinensis)是一种富含儿茶素等多酚类物质的多 年生木本植物，大量研究表明茶树中的这类多酚类物质具有明显的杀菌或抑菌作用[杜 晓，李宁，周茹娟，等.植物中分离的儿茶素类及其聚合物的抑菌作用[J].四川农业大学 学报.2005,23(3) :374-378.;王静，戚向阳，朱学良，等.表没食子儿茶素没食子酸酯及其 不同氧化级分的抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发.2008 ]，这种抑菌作用将直接 阻碍发根农杆菌对茶树的遗传转化，这也就是国内外发根农杆菌介导茶树遗传转化率极低 [张广辉，梁月荣，陆建良.发根农杆菌介导的茶树发根高频诱导与遗传转化[J].茶叶科 学.2006,26(1) :1-10.;奚彪，刘祖生，梁月荣，等.发根农杆菌介导的茶树遗传转化[J]. 茶叶禾斗学.1997， 17(增刊)155-156. ;Zebra M，Banerjee S，Mathur A K，et al. Induction of hairy roots in tea(C咖ellia sinensis L ) [J]. Current Science. 1996， 70 (1): 84-86.]及茶树转基因育种难以成功的主要原因。 发明内容本发明的目的是提供一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法，通过该方 法获得抗酚性较强的菌株，使之在介导茶树等富含多酚类的植物时仍具有相当高的活性， 应用该方法获得的抗酚性强的菌株可提高茶树的发根诱导频率及发根密度，为发根农杆菌 介导的遗传转化应用于茶树研究解决一大难题。 本发明提供的技术方案是一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法，将发根农杆菌 菌株(Agrobacterium rhizogenes)转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然 后将此活化菌液100 1涂布在含有茶多酚浓度为25-800 g/ml以及含卡那霉素的AB固 体培养基上进行抑菌培养24-48小时，挑取在200 g/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落， 再转接到含200 g/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活 化的菌液100 y 1分别涂布到含200、400、800和1000 y g/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的 AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行2-3次抗酚筛选直至获得在 800-1000g/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。
所述含卡那霉素的YEB液体培养基由下法得到将lg酵母提取物，5g牛肉浸膏， 5g蛋白胨，0. 5gMgS04 7H^，5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，再用1NnaOH调节pH值至 7. 2，然后用蒸馏水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养基温度降至60°C以下加入经0. 22 y微 孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。 所述含卡那霉素AB固体培养基由下法得到将3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、 0. 5gMgS04 7H20、lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 7H20、5g蔗糖和15g琼脂溶解到900ml 的蒸馏水中，用IN NaOH调节pH值至7. 2，蒸汽灭菌，待培养基温度降至60°C以下加入 经0. 22 微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml ;所述含卡那霉素AB液体培 养基由下法得到将3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、0. 5gMgS04 7H20、 lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mgFeS04 7H20和5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，用IN NaOH调节pH值至7. 2，然后 用蒸馏水定容至lOOOml，蒸汽灭菌，待培养基温度降至60°C以下加入经0. 22 y微孔滤膜过 滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。
所述茶多酚中儿茶素的含量>80%。 所述茶多酚含有咖啡因0. 26%，表没食子儿茶素2. 66%， dl_儿茶素0. 71 %，表 儿茶素2. 15%，表没食子儿茶素没食子酯62. 83%，没食子儿茶素没食子酯3. 03%，表儿茶 素没食子酯16. 79%。 本发明通过抗酚筛选获得了抗酚性强的菌株，使之在介导茶树等富含多酚类的植 物时仍具有相当高的活性，应用该方法获得的抗酚性强的菌株可提高茶树的发根诱导频率 及发根密度2-3倍，为发根农杆菌介导的遗传转化应用于茶树研究解决了一大难题，也为 其他富含多酚类植物的遗传转化研究以及利用发根培养生物合成儿茶素等次生代谢产物 提供了一条有效途径。
具体实施方式
用接种环挑取储存的原始发根农杆菌菌株(如R1000)转接到 含卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km)的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌 液100 ii 1涂布到在含有茶多酚(TC80)浓度为25-800 y g/ml和含Km的AB固体培养基上 进行抑菌培养，待大部分培养皿有菌落长出时(约培养24-48小时)挑取在较高浓度下仍 能生长的单菌落，转接到含相应浓度TC80的液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液 100 ill涂布到分别含200-1000 g/ml不同浓度的茶多酚的平板进行再次抗酚筛选和活化 培养，依此进行两三次抗酚筛选直至获得在800-1000 g/ml仍能生长的抗酚性强的发根 农杆菌。注含Km的YEB液体培养基由下法得到将lg酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白 胨，O. 5gMgS04 7H^，5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，再用1NnaOH调节pH值至7. 2，然 后用蒸馏水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(15bf/ir^，20min)，待培养基温度降至60°C以下 (手感不烫)加入经0.22ii过滤灭菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km) 100mg/L。
含Km AB培养基由下法得到将3gK2HP04， lgNaH2P04， 0. 15gKCl， 0. 5gMgS04 7H20， lgNH4Cl，0. 01CaCl2，2. 5mg FeS04 *7H20， 5g蔗糖用IN NaOH调节pH值至7. 2 (配固体培养基 时加15g琼脂)，然后用蒸馏水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(15bf/in2，20min)待培养基温 度降至60。C以下(手感不烫)加入经0.22ii过滤灭菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km) 100mg/L。茶多酚制品(由长沙金农天然植物制品实业有限公司提供)，其中儿茶素组成 为:咖啡因O. 26%，表没食子儿茶素2.66%， (11-儿茶素0.71%，表儿茶素2. 15%，表没食 子儿茶素没食子酯62. 83%，没食子儿茶素没食子酯3. 03%，表儿茶素没食子酯16. 79%， 其余为杂质；儿茶素总量88. 17%。 实施例用接种环挑取储存的原始发根农杆菌菌株R1000转接到含Km的YEB液 体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌液100 iU涂布到在含有茶多酚(TC80)浓度为 100 i！ g/ml和含Km的AB固体培养基上进行抑菌培养，待大部分培养皿有菌落长出时(约 培养24-48小时)，挑取在200 g/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，转接到含相应浓度 TC80的液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液100 1涂布到分别含200、400、800和 1000 g/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化 培养，依此进行两次抗酚筛选，获得在900 g/ml茶多酚浓度的培养基仍能生长的抗酚性 强的发根农杆菌。获得的抗酚性强的菌株可提高茶树的发根诱导频率2倍及发根密度3倍。
权利要求
一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法，将发根农杆菌菌株(Agrobacterium rhizogenes)转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌液100μl涂布在含有茶多酚浓度为25-800μg/ml以及含卡那霉素的AB固体培养基上进行抑菌培养24-48小时，挑取在200μg/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转接到含200μg/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液100μl分别涂布到含200、400、800和1000μg/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行2-3次抗酚筛选直至获得在800-1000μg/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含卡那霉素的YEB液体培养基由下 法得到将lg酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白胨，0. 5gMgS04 7H20， 5g蔗糖溶解到900ml 的蒸馏水中，再用INnaOH调节pH值至7. 2，然后用蒸馏水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养 基温度降至60°C以下加入经0. 22 ii微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述含卡那霉素AB固体培养基由 下法得到:将3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、0. 5gMgS04 7H20、 lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 *7H20、5g蔗糖和15g琼脂溶解到900ml的蒸馏水中，用IN NaOH调节pH值至7. 2，蒸 汽灭菌，待培养基温度降至60°C以下加入经0. 22 ii微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡 那霉素1ml ;所述含卡那霉素AB液体培养基由下法得到^3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、 0. 5gMgS04 7H20、lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 7H20和5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水 中，用IN NaOH调节pH值至7.2，然后用蒸馏水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养基温度降 至60°C以下加入经0. 22 ii微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述茶多酚中儿茶素的含量》80% 。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述茶多酚含有咖啡因0. 26%，表没食 子儿茶素2. 66% ， dl-儿茶素0. 71 % ，表儿茶素2. 15% ，表没食子儿茶素没食子酯62. 83% ， 没食子儿茶素没食子酯3. 03%，表儿茶素没食子酯16. 79%。
全文摘要
一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法。将发根农杆菌菌株转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将活化菌液涂布在含有茶多酚和卡那霉素的AB固体培养基上进行抑菌培养，挑取在200μg/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转接到含200μg/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液分别涂布到含不同浓度的茶多酚的培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，直至获得在800-1000μg/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。本发明通过抗酚筛选获得抗酚性强的菌株，使之在介导茶树等富含多酚类的植物时仍具有相当高的活性，获得的抗酚性强的菌株可提高茶树的发根诱导频率及发根密度2-3倍。
文档编号C12Q1/04GK101768623SQ20101011996
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者刘仲华, 施兆鹏, 朱旗, 李玲, 杨新河, 毛清黎 申请人:孝感学院