专利名称：细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列及其融合表达载体和该表达载体的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是用于抑制胶质瘤细胞浸润和扩散的细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列及其融合表达载体和该表达载体的医药用途。
背景技术：
转录后的基因沉默是进化过程中一种抵御转录子和RNA病毒的防御机制，在植物和动物分化之前就已经出现。1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA (double-stranded RNA)注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默。将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用(RNA interference RNAi)。RNA干扰是由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默，是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制、转录子沉默以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA (Small interferenceRNA, siRNA)与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。 RNA干扰技术为人们迅速、准确的剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路，例如研究信号传导通路和基因功能RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间，控制基因表达的部位，以开展基因治疗的新途径。恶性胶质瘤是一类恶性程度极高的恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的40%和中枢神经系统恶性肿瘤78%。恶性胶质瘤向周围正常脑组织侵袭浸润是其致死的主要原因，尽管现代的诊断和治疗技术已经有了长足的发展，其中位生存时间仍然不超过15个月。迄今为止恶性胶质瘤侵袭浸润的分子机制，尚未完全明确。Girdin是由日本学者在2005年首次发现的一种新的细胞肌动蛋白结合蛋白。Girdin是一个由1870个氨基酸残基构成的大分子蛋白质，又被命名为 APE (Akt-phosphorylation enhancer)。研究发现Girdin在哺乳动物组织及多种细胞系
中普遍表达。
发明内容
本发明是为了解决恶性胶质瘤病人肿瘤细胞浸润和扩散问题，提供一种细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列及其融合表达载体和该表达载体的医药用途。本发明采用的技术方案是设计针对Girdin的siRNA片段，通过siRNA基因敲除技术靶向抑制Girdin的表达，在连接酶作用下连入pGPTO/GFP/Neo载体中，转染感受态大肠杆菌DH5 α，制备Girdin-siRNA融合表达载体，将其转染到恶性胶质瘤细胞株LN-2^中， 用免疫印记等方法检测到细胞中的Girdin的表达水平降低，转染后的细胞株进行一系列细胞功能学实验，确定Girdin-siRNA融合表达能够降低肿瘤细胞的浸润和扩散能力。应用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒提取纯化Girdin-siRNA融合表达载体质粒，确保无内毒素污染，用无RNA酶水溶解载体，终浓度为10yg/ml，-8(TC冻存，备用。因此，本发明设计并合成一段细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列，该序列两端分别带有BamH I和Kds I酶切位点，该序列的碱基序列及siRNA作用位点如下5’_GGCTGGCT TGGAGGAGAATTA-3’。一种细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列的融合表达载体，该融合表达载体转染到恶性胶质瘤细胞株LN-229中，特异的降解与其互补的细胞骨架结合蛋白mRNA，降低恶性胶质瘤细胞株LN-2^中细胞骨架结合蛋白mRNA的表达，有效的抑制人胶质瘤细胞的迁移，粘附以及侵袭能力，该融合表达载体的碱基序列见序列表。一种细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列的表达载体在制备肿瘤基因治疗制剂中的应用a.细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体有效的抑制人胶质瘤细胞的体外迁移能力，趋化能力；b.细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列的融合表达载体有效的抑制人胶质瘤细胞的体外粘附能力，侵袭能力；c.细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列的融合表达载体抑制人胶质瘤细胞扩散和侵袭浸润.本发明的有益效果1. Girdin-siRNA融合表达载体能够抑制恶性胶质瘤细胞的体外迁移能力，趋化能力。2. Girdin-siRNA融合表达载体能够抑制恶性胶质瘤细胞的体外粘附能力，侵袭能力。3.综上所述，本发明提供了 Girdin-siRNA融合表达载体在抑制人恶性胶质瘤细胞迁移侵袭方面的药物用途，可用于肿瘤病人的基因治疗，抑制肿瘤扩散和侵袭浸润。
图1本发明融合表达载体的图谱示意图；图2是人恶性胶质瘤细胞转染Girdin-siRNA融合表达载体质粒后Girdin蛋白水平图；图3a是划痕实验中转染组与对照组细胞在不同时间点细胞迁移情况；图北是转染组Girdin蛋白表达降低的细胞的迁移能力与对照组比对图；图4是转染组Girdin蛋白表达降低的细胞的趋化运动能力与对照组比对图；图5是转染组Girdin蛋白表达降低的细胞的粘附能力与对照组比对图；图6是转染组Girdin蛋白表达降低的细胞的侵袭能力与对照组比对图。
具体实施例方式一 .实验材料来源人恶性胶质瘤细胞LN-2^细胞株由美国德克萨斯大学MD Anderson癌症中心提供，趋化小室购自Neuro Probe公司，EGF购自P印rotech公司，intersectinl抗体来自于 Abcam 公司,G418 购自 Invitrogen 公司。二 . Girdin-siRNA 的设计与合成依据Ambion公司在网上提供的siRNA设计软件设计特异的intersectinl-siRNA， 并由上海吉玛制药技术有限公司合成以下模版，两端分别带有BamH I和Kds I酶切位点， siRNA作用位点5， -GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3，。三.Girdin-siRNA融合表达载体的制备表达载体pGPTO/GFP/Neo载体其结构为线性，两端分别为BamH I和Kds I酶切位点的粘性末端。将合成的Girdin-siRNA退火，连接酶作用下连入pGPTO/GFP/Neo载体中， 转染感受态大肠杆菌DH5 α，铺平板过夜培养。挑取转化菌扩增培养提取质粒。酶切测序验证插入序列。应用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒提取纯化Girdin-siRNA融合表达载体质粒，确保无内毒素污染，用无RNA酶水溶解载体，终浓度为10yg/ml，-80° C冻存，备用， 该融合表达载体的碱基序列见序列表。阴性对照control-siRNA载体由上海吉玛制药技术有限公司提供，含有一段与人类已知基因均不同的siRNA，在实验中我们称其为scr。四.融合表达载体转染恶性胶质瘤细胞先将细胞用无血清培养液进行饥饿处理，2小时后将4μ g融合表达载体与IXlO5 细胞混合，采用脂质体2000 (Invitrogen)进行转染，6小时后换为完全培养液，3天后添加 G418抗生素进行筛选，转染不成功的细胞由于没有携带抗生素的抗性基因则逐渐死亡，剩余存活的细胞为转染成功的细胞。针对这些存活细胞进行单克隆筛选，那些能够使Girdin 的表达显著降低的克隆为下面实验所用。五.检测转染后的细胞中Girdin的表达水平免疫印迹方法检测Girdin的表达水平将对照细胞和Girdin-siRNA转染的细胞用细胞裂解液进行细胞裂解，并应用超声破碎仪辅助裂解，然后置于沸水中静置10分钟。 处理后的样本进行离心以取出沉淀。随后应用蛋白定量检测试剂盒对样本进行蛋白定量检测，然后进行蛋白电泳，并将样本蛋白传递至硝酸纤维素薄膜上，用5%炼乳溶液进行室温封闭1小时，然后加入Girdin抗体，在4°C冰箱中静置过夜，第二天用二抗进行室温孵育1 小时，然后应用ECL方法进行X光片曝光处理，以得到蛋白条带。根据曝光条带的深浅判断蛋白的表达量。通过此方法检测结果，表明经过Girdin-siRNA融合表达载体转染后调选出的细胞克隆，其Girdin的表达量由显著降低，见图2。六.检测转染后胶质瘤细胞的运动能力采用划痕实验进行检测转染后的胶质瘤细胞的自主运动能力。划痕实验是指在单层生长的细胞中间用ΙΟμΙ的微量枪头划出粗细均勻的一条痕迹，然后在不同时间点观察细胞向划痕中间迁移的距离，这是检测细胞运动能力的一种重要的技术手段。根据实验照片，我们发现转染后的胶质瘤细胞在M小时迁移的距离比对照组有明显降低，进一步在不同时间点采集的数据进行分析发现转染后的细胞的运动能力比对照有明显降低(P < 0. 05)，见图3a，b。表明该融合表达载体制备成药物可以抑制胶质瘤细胞的运动能力。七.检测转染后的恶性胶质瘤细胞的趋化能力
趋化运动是指细胞在趋化因子的作用下，向趋化因子的方向进行迁移的运动现象，它是一种检测细胞定向运动的重要指标和方法。在本实验中，应用肿瘤细胞的一种趋化因子表皮生长因子EGF作为诱导因子，观察转染后的细胞的趋化能力。实验中EGF的使用浓度为0，1，10，100，lOOOng/mL·采用Neuroprobe公司的48孔趋化小室进行趋化实验。对照组和实验组细胞分别在实验前用无血清培养液饥饿3小时，然后在37°C培养箱中趋化3 小时。趋化实验中用到的薄膜购自Neuroprobe公司，并且在使用前预先用10 μ g/ml的纤维粘连蛋白进行包被，以使细胞能够很好的粘附与薄膜。趋化实验完毕后，薄膜进行固定和染色，然后在400倍显微镜下观察穿过薄膜的细胞数，镜下随机取3个视野，进行细胞计数并取平均值。对照组细胞在最佳浓度的趋化因子存在下，其趋化细胞数约为150，而实验组则约为50，两者有显著的差异(P<0. 05)，见图4。表明该融合表达载体制备成药物可以抑制胶质瘤细胞的趋化能力。八.检测转染后胶质瘤细胞的粘附能力粘附能力是肿瘤细胞侵袭浸润的一个先决条件，粘附能力的高低在一定程度上决定着侵袭浸润能力的强弱。取相同细胞数目的培养的对照组和实验组细胞，分别用IOng/ ml的EGF作为刺激因子加入到细胞悬液中，然后把细胞种入细胞培养皿(内置有预先用纤维粘连蛋白包被过的玻片)，再分别在5分钟，15分钟，30分钟，45分钟的时间点进行洗涤， 只有粘附在玻片上的细胞存留在培养皿中，没有粘附的细胞全部被清洗掉，然后对细胞进行固定并进行封片，最后用显微镜观察粘附细胞的数量。200倍镜下随机取3个视野，进行细胞计数并取平均值。结果表明，转染后的胶质瘤细胞由于Girdin表达的降低，在5分钟和15分钟时的粘附能力比对照组有显著降低，见图5。表明该融合表达载体制备成药物可以抑制胶质瘤细胞的粘附能力。九.检测转染后胶质瘤细胞的侵袭能力在研究胶质瘤细胞的体外侵袭能力的研究中，Matrigel基质胶侵袭实验通常被用来检测肿瘤细胞的侵袭能力。实验中采用M孔insert板，内置有8微米的薄膜，购自于 Costar公司。将从sigma公司购买的Matrigel基质胶预先均勻涂布在薄膜上，然后将相同数目的对照组和实验组细胞种于M孔insert板内，至于37°C细胞培养箱中静置3小时，实验完毕后，取出薄膜进行固定和染色，计数方法与趋化实验相同。结果表明，转染后的胶质瘤细胞的侵袭能力与对照组有显著降低，见图6。表明该融合表达载体制备成药物可以抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。
权利要求
1.一段细胞骨架结合蛋白SiRNA干扰序列，其特征在于该序列两端分别带有BamHI和^sI酶切位点，该序列的碱基序列及siRNA作用位点如下 5’ -GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3’。
2.一种细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体，其特征在于该融合表达载体转染到恶性胶质瘤细胞株LN-229中，特异的降解与其互补的细胞骨架结合蛋白mRNA， 降低恶性胶质瘤细胞株LN-229中细胞骨架结合蛋白mRNA的表达，有效的抑制人胶质瘤细胞的迁移，粘附以及侵袭能力，该融合表达载体的碱基序列见序列表。
3.细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的表达载体在制备肿瘤基因治疗制剂中的应用a.细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体有效的抑制人胶质瘤细胞的体外迁移能力，趋化能力；b.细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体有效的抑制人胶质瘤细胞的体外粘附能力，侵袭能力；c.细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体抑制人胶质瘤细胞扩散和侵袭浸润。
全文摘要
本发明公开了细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列及其融合表达载体和该表达载体的医药用途，属于生物制药领域。本发明设计一段细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列，并合成细胞骨架结合蛋白siRNA干扰序列的融合表达载体，该融合表达载体转染人胶质瘤细胞系后，能够特异的降解与其互补的细胞骨架结合蛋白mRNA，降低人胶质瘤细胞中的细胞骨架结合蛋白的表达，而且可以有效的抑制人胶质瘤细胞的迁移，粘附以及侵袭能力，具有抑制人胶质瘤细胞浸润和扩散的作用，为肿瘤病人的基因治疗提供一种可行的技术手段。
文档编号C12N15/85GK102242116SQ20101017032
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者王静, 谷峰, 马勇杰 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院