专利名称：在轻度低温下能促进基因表达的序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及在轻度低温下促进基因转录或翻译的轻度低温应答元件。
背景技术：
利用生物技术已经生产出许多种药物和分析用试剂，例如单克隆抗体、生长因子 和凝血因子。一般来说，在10_15°C的低温下，促进了异源重组蛋白正确折叠并抑制了蛋白酶 P華角军蛋白(Baneyx, F. , In vitro folding of recombinantproteins in Escherichia coli.In Manual of industrial microbiology andbiotechnology,第 2 版，(Demain, A. L. Davis, J. E.，Altas, R. M.，等,编辑)ASM Press, ffashingtonn D. C.，pp. 551-1999)。 因此，当利用细菌生产重组蛋白时，在低于20°C的低温而非37°C下进行培养。在该情况 下，由于在低温下蛋白合成通常减少，可能出现期望蛋白产量降低。通过在期望蛋白的表 达载体中使用冷激蛋白CspA基因启动子和CspA mRNA的5、非翻译区(UTR)解决了该难 题(Baneyx, F.禾口 Mujacic, M. , Cold-inducible promoters for heterologous protein expression, Methods in Molecular Biology,205,1-18,2001)。但是，细菌与哺乳动物细胞中的翻译后修饰明显不同。特别是对于药物而言，糖 基化状态对治疗效果是很重要的。因此，哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠细胞系，被用于 制备蛋白质药物。为降低细胞培养生产成本，必须要增加蛋白产量。通常在37°C下进行 培养，但是其缺点在于，因为细胞在快速生长后死亡，则细胞存活并产生期望蛋白所持续 的时间就短。因此，通过添加细胞生长抑制剂、表达细胞周期抑制基因P27、在轻度低温 (30-32°C )下培养等以实现抑制细胞生长并使细胞存活更长时间的尝试(参见Schatz SM 等，Biotechnol. Bioeng, 2003，Nov. 433—438)。其中，在轻度低温下培养具有如下特征1)较在37°C下培养，细胞存活及产生重组蛋白的时间更长；2)蛋白水解酶活性降低以减少期望蛋白降解；3)糖基化和同工蛋白质谱(isoprotein pattern)类似于在37°C下培养的那些， 且唾液酸化较在37°C下培养的更好；4)可能改善如细菌中的期望蛋白的正确折叠(Kaufmann H，MazurX，Marone R， Bailey JE, Fussengger M.，Biotech Bioeng.，2001-3—20，72(6) :592_602 ；Yoon SK, Song JY, Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003-5—5，82(3) :289_98)。就重要的重组蛋白产量而论，由于细胞存活时间延长，总产量通常增加。但是，每 单位时间每细胞蛋白的单位生产率由于未知的原因而改变，可能取决于细胞类型、期望蛋 白类型等等。许多情况下单位生产率较在37°C下更低，难以解决(Kaufmann H, Mazur X，Marone R, Bailey JE, Fussenegger M.，Biotech Bioeng. ,2001Mar. 20,72(6) :592_602 ； Yoon SK, Song JY, Lee GM. , Biotech Bioeng. , 2003May. 5,82(3) :289_98)。因为基因表达 调控机制不同于细菌，所以细菌的冷激蛋白CspA启动子和CspA mRNA的5、非翻译区(UTR) 不能用于哺乳动物细胞。本发明的目的是提供一种在低温下增加每单位时间每细胞的蛋白生产和总产量 的方法。
发明内容
本申请发明人之前发现并报道了冷激蛋白Cirp (冷诱导的RNA结合蛋白质)，其 基因组DNA序列如SEQ ID No 1所示，以及Rbm3 (RNA结合基序蛋白3) (Fujita J.，Cold shock response in mammalian cells, J. Mol Microbiol. Biotechnol. ,1999 年 11 月， 1(2) 243-55)。现在，本发明是在这些蛋白基因启动子的5、端发现能促进转录的基因表达调控 序列的基础上做出的。也就是说，本发明涉及一种轻度低温转录调控元件，包含核苷酸序列XiCcccXgX^g其中，X:是t，g或a ;X6是g，a或c ;X7是c，a，或t ；以及X8是c，a和t，或与该序 列互补的核苷酸序列。在此术语“轻度低温”指15_36°C的温度，优选30_34°C的温度以及最优选32°C的 温度。术语“轻度低温转录调控元件”指在轻度低温下能特异性促进基因转录的核苷酸序 列。本发明的轻度低温转录调控元件在基因转录中起轻度低温特异性增强子的作用。本发明的轻度低温转录调控元件在单独使用时能起作用。但是，优选使用连接的 2-50个，优选2-10个相同或不同的元件。当元件连接使用时，相同或不同的元件可直接连 接，或通过任何数量和类型的核苷酸连接。在本说明书中连接的轻度低温转录调控元件称 为“轻度低温转录调控增强子”。本发明的轻度低温转录调控元件和轻度低温转录调控增强 子并不涉及与启动子的距离。本发明涉及一种包含上述轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增强子的 载体。本发明涉及上述载体所转化的哺乳动物细胞。本发明涉及一种筛选轻度低温转录调控元件的方法，包括1)提供在轻度低温下，特别优选在32°C的培养温度下，能促进转录的基因；2)克隆基因的一部分，从该基因转录起始位点5’的1. 5kb到第一外显子3、末端；3)将所克隆的核苷酸序列和合适的启动子插入表达报道基因的载体中；4)用所述载体转化哺乳动物细胞；5)在轻度低温或37°C下培养细胞以表达报道基因，来鉴定能在轻度低温下促进 报道基因转录的核苷酸序列；和6)对于能促进报道基因转录的核苷酸序列，截短要被插入载体的核苷酸序列，以 鉴定对于在轻度低温下促进报道基因转录必需的核苷酸序列。本发明涉及一种改良轻度低温转录调控元件的方法，包括
1)合成突变的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代轻度低温转录调控元件中的一 个或两个核苷酸；2)将突变的核苷酸序列与合适的启动子整合入表达报道基因的载体中；3)用所述载体转化哺乳动物细胞；4)在轻度低温或37°C下培养细胞以表达报道基因，来鉴定在轻度低温下能促进 报道基因转录的核苷酸序列。发明人在Cirp基因mRNA的非翻译区(UTR)中还发现了能在轻度低温下促进 翻译的基因表达调控序列。更确切地说，本发明涉及一种轻度低温翻译调控元件，包含核苷酸序列actcg cgcct tagga agctt gggtg tgtgt ggcgc gctgt cttcc cgctcgcgtc aggga cctgc ccgac tcagc ggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于编码序列的5、端和启动子的3、端。在此术语“轻度低温翻译调控元件”指在轻度低温下特异性促进转录的mRNA翻译 的元件。当轻度低温翻译调控元件转录时，其形成mRNA的5、非翻译区(UTR)。在此术语“轻度低温应答元件”指的是轻度低温转录调控元件和/或轻度低温翻 译调控元件。发明效果本发明在轻度低温下可促进基因转录和翻译。
图1是pCAT3基础载体示意图。MCS是多克隆位点。CAT是氯霉素乙酰转移酶的 编码序列。PA是来自SV40病毒的多腺苷酸化信号。Amp1^是氨苄青霉素抗性基因。图2是pCAT3启动子载体示意图。MCS是多克隆位点。SV40启动子是来自SV40 病毒的启动子。CAT是氯霉素乙酰转移酶的编码序列。PA是来自SV40病毒的多腺苷酸化 信号。Amf是氨苄青霉素抗性基因。图3是pcDNA 3. 1⑴载体(Invitrogen)示意图。MCS是多克隆位点。荧火虫荧 光素酶编码序列被插入到多克隆位点的EcoRV和Xbal之间。Cirp mRNA的5、非翻译区 (UTR)的互补DNA(cDNA)被插入到多克隆位点的Kpnl和BamHI之间。
具体实施例方式本发明的轻度低温转录调控元件的例子包括，但不限于，tcccc gcc (SEQ ID NO: 2)，gcccc gcc (SEQ ID NO 9),acccc gcc (SEQ IDN0 10),tcccc gtc(SEQ ID NO 11),tcccc get(SEQ ID NO: 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，ggegg gga(SEQ ID NO :22)，和 ggggg gga(SEQ ID NO 7)(i)制备轻度低温应答元件可制备本发明的轻度低温转录调控元件、轻度低温转录调控增强子和轻度 低温翻译调控元件，例如，通过氨基磷酸盐(phosphoroamidide)法的固相合成法或 膦酸氢盐法的固相合成法，使用四种带有保护基团的脱氧核糖核苷酸(参见，例如， OligonucleotideSynthesis :A practical Approach, IRL Press,35-81,83-115 (1984)； J. Org. Chem. ,49,2139(1984) ；Tetrahedron Lett.，27，469(1986) ；TetrahedronLett. ,22,1859-1862 ；Tetrahedron Lett.，21，719—722 J.Am. Chem. Soc.，103,3185—3191(1981)。) 现今可容易地用可商购的DNA合成仪(例如，Applied Biosystem制造的)合成它们。(ii)要使用的启动子原核启动子、真核启动子和病毒启动子可用作为启动子。优选哺乳动物启动子和 病毒启动子。优选的启动子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)启动子，巨细胞病 毒(CMV)启动子和SV40启动子。(iii)编码序列要表达的基因没有限制，编码任何蛋白的核苷酸序列都可使用。(iv)要使用的载体将本发明的轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增强子，启动子和编码所 要表达的蛋白的编码序列连接在一起并插入载体中。可以使用原核细胞和真核细胞表达载 体。优选的载体的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)、pCAT3启动子载体(Promega) 和pSV2-neo载体。(v)要使用的宿主细胞用载体转染宿主细胞。优选使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。优选的哺乳动物细 胞的例子是人细胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela细胞；猴细胞系，例如C0S-7和 Vero细胞；小鼠细胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中国仓鼠细胞系，例如 CH0。转染的方法包括磷酸钙法，脂质转染法和电穿孔法。例如，在磷酸钙法中，将含有 DNA (载体)的氯化钙溶液逐滴加到搅拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸钙的精制沉淀 物。当该溶液添加到宿主细胞时，DNA-磷酸钙沉淀物通过吞噬作用进入宿主细胞使得DNA 转染入细胞。(vi)培养条件宿主细胞在轻度低温下培养。无需使用专用培养基作为培养基。可使用哺乳动物 细胞培养的常用培养基。培养基的代表例子是补充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基(D-MEM)。本发明涉及一种筛选轻度低温转录调控元件的方法，包括1)提供在轻度低温下，特别是优选在32°C的培养温度下，能促进转录的基因；2)克隆基因的一部分，从距该基因转录起始位点5’的1. 5kb到第一外显子3、末 端；3)将所克隆的核苷酸序列和合适的启动子插入表达报道基因的载体中；4)用所述载体转化哺乳动物细胞；5)在轻度低温或37°C下培养细胞以表达报道基因，来鉴定能在轻度低温下促进 报道基因转录的核苷酸序列；和6)对于能促进报道基因转录的核苷酸序列，截短要被插入载体的核苷酸序列以鉴 定对于在轻度低温下促进报道基因转录必需的核苷酸序列。通过在37 °C和轻度低温下，优选在32°C下，培养哺乳动物细胞并应用DNA芯片 (微阵列)或cDNA扣除法(参见，例如，Moody，D. E.，Genomic techniques :An overview of methods for study of geneexpression, J. Anim. Sci. ,79(E. Suppl.) :E128_E135. 2001)于从其中抽提的RNA，可获得在轻度低温下能促进转录的基因。原核启动子、真核启动子和病毒启动子可用作为启动子。优选哺乳动物启动子和 病毒启动子。优选的启动子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)启动 子，巨细胞病毒(CMV)启动子和SV40启动子。报道基因是编码能容易地被检测的蛋白的基因，包括但不限于，荧光素酶基因和 氯霉素乙酰转移酶基因。可使用原核细胞和真核细胞载体。优选的载体的例子包括，但不 限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3 启动子载体(Promega)和 pSV2_neo 载体。用载体转染宿主细胞。优选使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。优选的哺乳动物细 胞的例子是人细胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela细胞；猴细胞系，例如C0S-7和 Vero细胞；小鼠细胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中国仓鼠细胞系，例如 CH0。转染的方法包括磷酸钙法，脂质转染法和电穿孔法。例如，在磷酸钙法中，将含有 DNA (载体)的氯化钙溶液逐滴加到搅拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸钙的精制沉淀 物。当该溶液添加到宿主细胞时，DNA-磷酸钙沉淀物通过吞噬作用进入宿主细胞使得DNA 转染入细胞。无需使用专用培养基作为培养基。可使用哺乳动物细胞培养的常用培养基。培养 基的代表例子是补充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养 基(D-MEM)。如果报道基因产物在轻度低温下，优选在32°C下的表达量，与37°C下的表达量的 比率大于1，则核苷酸序列可以是在轻度低温下能特异性促进基因转录的增强子。截短在轻 度低温下能促进基因转录的核苷酸序列以获得本发明的轻度低温转录调控元件。可通过确 认与该轻度低温转录调控元件互补的核苷酸序列在轻度低温下也可促进基因转录来确认 它是增强子。本发明涉及一种改良轻度低温转录调控元件的方法，包括1)合成突变的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代轻度低温转录调控元件中的一 个或两个核苷酸；2)将突变的核苷酸序列与合适的启动子整合入表达报道基因的载体中；3)用所述载体转化哺乳动物细胞；4)在轻度低温或37°C下培养细胞以表达报道基因，来鉴定在轻度低温下能促进 报道基因转录的核苷酸序列。轻度低温转录调控元件中的一个或两个核苷酸为其他核苷酸所取代的突变的核 苷酸可通过上述方法合成。原核启动子、真核启动子和病毒启动子可用作为启动子。优选哺乳动物启动子和 病毒启动子。优选的启动子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)启动 子，巨细胞病毒(CMV)启动子和SV40启动子。报道基因是编码能容易地被检测的蛋白的基因，包括荧光素酶基因和氯霉素乙 酰转移酶基因。可使用原核细胞和真核细胞载体。优选的载体的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 启动子载体(Promega)和 pSV2_neo 载体。用载体转染宿主细胞。优选使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。优选的哺乳动物细胞的例子是人细胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela细胞；猴细胞系，例如C0S-7和 Vero细胞；小鼠细胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中国仓鼠细胞系，例如 CH0。转染的方法包括磷酸钙法，脂质转染法和电穿孔法。例如，在磷酸钙法中，将含有 DNA (载体)的氯化钙溶液逐滴加到搅拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸钙的精制沉淀 物。当该溶液添加到宿主细胞时，DNA-磷酸钙沉淀物通过吞噬作用进入宿主细胞使得DNA 转染入细胞。无需使用专用培养基作为培养基。可使用哺乳动物细胞培养的常用培养基。培 养基的代表例子是补充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(D-MEM) (Invitrogen)。如果报道基因产物在轻度低温下，优选在32°C下的表达量，与37°C下的表达量的 比率大于1，则该核苷酸序列可以是在轻度低温下能特异性促进基因转录的增强子。可通过 确认与该轻度低温转录调控元件互补的核苷酸序列在轻度低温下也可促进基因转录来确 认它是增强子。本发明也涉及一种轻度低温翻译调控元件，包含核苷酸序列aCtCgCgCCt taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于编码序列的5、端和启动子的3、端。原核启动子，真核启动子和病毒启动子可用作为启动子。优选哺乳动物启动子和 病毒启动子。优选的启动子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)启动子，巨细胞病 毒(CMV)启动子和SV40启动子。本发明的轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增 强子，以及启动子可与本发明的轻度低温翻译调控元件一起使用。可使用原核细胞和真核细胞载体。优选的载体的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 启动子载体(Promega)和 pSV2_neo 载体。用载体转染宿主细胞。优选使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。优选的哺乳动物细 胞的例子是人细胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela细胞；猴细胞系，例如C0S-7和 Vero细胞；小鼠细胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中国仓鼠细胞系，例如 CH0。转染的方法包括磷酸钙法，脂质转染法和电穿孔法。例如，在磷酸钙法中，将含有 DNA (载体)的氯化钙溶液逐滴加到搅拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸钙的精制沉淀 物。当该溶液添加到宿主细胞时，DNA-磷酸钙沉淀物通过吞噬作用进入宿主细胞使得DNA 转染入细胞。无需使用专用培养基作为培养基。可使用哺乳动物细胞培养的常用培养基。培 养基的代表例子是补充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(D-MEM) (Invitrogen)。实施例实施例1假定Cirp基因转录起始位点的“actcgc... ”的“a”为+1，跨越了核苷酸-970 (转 录起始位点5’的970个核苷酸)至+56(在第一外显子内)的Cirp基因，及其5、端缺失 的片段(见表1)被插入PCAT3-基础载体(Promega)的多克隆位点中。该载体带有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因作为报道基因。接着将2. 5-5. 0 u g/35-mm培养皿的质粒与0. 5-1. 0 u g/35-mm培养皿的 CDM8-LacZ (其为0 -半乳糖苷酶表达载体并用于校正转染效率)共转染入人细胞系293。将转染的细胞分成两组。一组在32°C下培养，另外一组在37°C下培养。培养基是 补充有10% FCS的D-MEM。36小时后，离心回收细胞并制备全细胞裂解物。使用CAT ELISA试剂盒(Roche Diagnostic)测定每一温度下所产生的氯霉素乙酰转移酶(CAT)蛋白的量，使用半乳糖 苷酶分析试剂盒(Stratagene)测定半乳糖苷酶活性。每一片段的转录促进活性如表 1所示。将CAT蛋白质量除以半乳糖苷酶活性计算转录促进活性。表1Cirp基因组5、端片段的转录促进活性 转染后24小时的数据类似于该结果。从这些数据中，可以看到基因转录的基础启动子可能存在于基因组基因的-220 到0，响应于32°C促进转录的增强子可能存在于-340到-220。实施例2除使用人细胞系293T，U-20S或Huh-7，猴细胞系C0S-7或小鼠细胞系NIH/3T3， Balb/3T3,B-6或Ifepal-6代替人细胞系293作为宿主细胞外，重复实施例1，获得类似的结果.实施例3制备多种来自Cirp基因-340到-240核苷酸的缺失突变体并插入到pCAT3启动 子载体(Promega)的多克隆位点中(图2)。该载体带有SV40启动子。如实施例1所述，在 用磷酸钙法使用人293细胞转染DNA的基因转移后，在32°C下测定转录促进活性。不含有 插入片段的PCAT 3启动子载体作为阴性对照(模拟物)。所示的是转染后36个小时的数据。将CAT蛋白质量除以半乳糖苷酶活性计 算转录促进活性(表2)。MJlCirp基因组5、端片段的转录促进活性 从这些结果中可以看到在2个基因组片段-310到-290和-260到-220中存在增 强子，其在32°C应答中促进转录。比较了这两个片段中的核苷酸序列，发现tcccc gcc(SEQ ID NO 2)的共有序列。实施例4将含有上述发现的tcccc gcc的10个核苷酸的三个分子串联形成序列ttccc cgccg ttccc cgccg ttccc cgccg(SEQ ID NO :3)。如实施例 3 所述，将该序列插入pCAT3 启 动子载体的多克隆位点中。作为阴性对照，使用不含有插入片段的PCAT 3启动子载体(模 拟物)。作为阳性对照，使用含有Cirp基因组的-340到-220位作为增强子的pCAT3启动 子载体和含有SV40增强子的pCAT3启动子载体。转染入293细胞后24小时获得的结果示 于表3中。表3 实施例5如果一个序列是增强子，则反向序列也应当是有效的。将含有cggcg gggaa(SEQ ID NO 4)的10个核苷酸的三个分子串联形成序列cggcg gggaa cggcg gggaa cggcg gggaa(SEQ ID NO :5)，所述cggcggggaa序列是包含tcccc gcc的序列的反向序列。将该序 列插入到PCAT3启动子载体的多克隆位点中，进行与实施例4类似的试验。在这种情况下，32°C /37°C的比是3. 83，证实了该序列为轻度低温转录调控增强 子。实施例6
通过将在小鼠Cirp基因组中发现的8个核苷酸tcccc gcc (SEQ IDN0 2)的两个 分子串联所获得的序列tcccc gcctc cccgc c(SEQ IDNO 6)插入到pCAT3启动子载体的多 克隆位点中，进行与实施例4类似的试验。在这种情况下，32°C /37°C的比是2. 51，证实了 该序列为轻度低温转录调控增强子。实施例7将发现位于人RBM基因组(GenBank NT_011568)转录起始位点5、端约260核苷 处的8个核苷酸ggggg gga(SEQ ID NO 7)的三个分子串联形成序列ggggg ggagg ggggg agggg ggga(SEQ ID NO :8)。将该序列插入到pCAT3启动子载体的多克隆位点中，进行与实 施例4类似的试验。在这种情况下，32°C /37°C的比是2. 52，证实了该序列为轻度低温转录调控增强子。实施例8将含有在上述发现的序列tcccc gcc (SEQ ID NO :2)中的一个或两个碱基取代 (见下表)的10个核苷酸的3个分子串联形成序列。将该序列插入到与实施例4相同的载 体中，并用该载体转染293细胞。24小时后，测定CAT/LacZ，各突变体的轻度低温转录促进 (增强)活性示于下表中，当使用不含有插入片段的PCAT3启动子载体时，规定32°C /37°C 的比为1。M4带有一个碱基取代的突变体的低温转录促进(增强)活性 魁带有2个碱基取代的突变体的低温转录促进(增强)活性 第一位碱基被G或A取代的，第七位碱基被T取代的，以及第八位碱基被T取代的 突变体与野生型序列相比具有类似的转录促进活性。尽管与野生型序列相比，第六位碱基 被A或C取代降低了活性，但它们也显示了明显的活性。第七和第八位碱基被AA取代的突 变体78具有与野生型相同程度的转录促进活性。因此，序列tcccc gcc是显示转录促进活性的序列，且序列t (或g或a)CCCCg(或 a或c) c (或a或t) c (或a或t)可具有转录促进活性。因为它们是增强子，所以与它们互补的序列，例如与tcccc gcc(SEQID NO 2)互补 的 ggcgg gga(SEQ ID NO 22)也可以使用。实施例9将从pGL3_基础质粒(Promega)上切除下的萤火虫荧光素酶cDNA插入到带有巨 细胞病毒(CMV)启动子的pcDNA3. 1(+)载体(Invitrogen)的多克隆位点(EcoR和Xbal 之间)中。然后，将相应于Cirp mRNA+1到+82核苷酸的cDNA片段(小鼠Cirp转录产物 (mRNA) "act…，，的"a，，假定为+1), actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)插入到 pcDNA3. 1 (+) 载体(Invitrogen)的多克隆位点(Kpnl和BamHI之间)中。在Kpnl和BamHI之间无插入 片段的质粒作为对照。接着将2. 5-5. 0 u g/35-mm培养皿的这些质粒与0. 5-1. 0 y g/35-mm培养皿的 pRLTK质粒(其为renila荧光素酶表达载体，用于修正每一转染的效率)共转染入已培养 一天的人细胞系293。将转染的细胞分成两组。一组在32°C下培养，另外一组在37°C下培 养。培养基为补充有10% FCS的D-MEM。36小时后，离心回收细胞，制备全细胞裂解物。使用双重荧光素酶报告试剂盒 (Promega)测定萤火虫和renila荧光素酶活性。每一片段的翻译促进活性示于表6中。将萤火虫荧光素酶活性除以renila荧光素酶活性来计算翻译促进活性。戲Cirp mRNA的5、非翻译区(UTR)的翻译促进活性 上述结果表明当Cirp mRNA的5—UTR存在于载体中时，与不存在其的载体相比， 在32°C下所产生的蛋白的量增加到1. 7倍，该量与在37°C下用不含Cirp mRNA的5—UTR的 质粒转染的细胞所产生的量相当。
权利要求
一种轻度低温转录调控元件，由选自以下的核苷酸序列组成gcccc gcc(SEQ ID NO9)，acccc gcc(SEQ ID NO10)，tcccc gtc(SEQ ID NO11)，tcccc gct(SEQ ID NO12)，tcccc gaa(SEQ ID NO21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO14)，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述轻度低温是30-34℃的温度。
2.一种轻度低温转录调控增强子，其中相同或不同的权利要求1的轻度低温转录调控 元件被连接。
3.一种轻度低温转录调控增强子，其中相同或不同的权利要求1的轻度低温转录调控 元件通过其他核苷酸被连接。
4.一种载体，包含权利要求1的轻度低温转录调控元件或权利要求2或3的轻度低温 转录调控增强子。
5.一种用权利要求4的载体转化的哺乳动物细胞。
6.一种筛选权利要求1所示的轻度低温转录调控元件的方法，包括1)提供在轻度低温下，能促进转录的基因；2)克隆从位于该基因转录起始位点5、上游的1.5kb到该基因第一外显子的范围；3)将所克隆的核苷酸序列和合适的启动子插入表达氯霉素乙酰转移酶(CAT)作为报 道基因的载体中；4)用所述载体转化哺乳动物细胞；5)在轻度低温和37°C下分别培养细胞以表达报道基因，来获得能在轻度低温下促进 报道基因转录的核苷酸序列；和6)截短要被整合入载体的该核苷酸序列以鉴定对于在轻度低温下促进报道基因转录 必需的核苷酸序列；其中所述轻度低温是30-34°C的温度。
7.权利要求6的方法，其中步骤1)中所述的轻度低温为32°C的培养温度。
8.一种改良权利要求1所示的轻度低温转录调控元件的方法，包括1)合成突变的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代轻度低温转录调控元件中的一个或 两个核苷酸；2)将突变的核苷酸序列与合适的启动子整合入表达氯霉素乙酰转移酶(CAT)作为报 道基因的载体中；3)用所述载体转化哺乳动物细胞；4)在轻度低温和37°C下分别培养细胞以表达报道基因，来鉴定在轻度低温下促进报 道基因转录所必需的核苷酸序列；其中所述轻度低温是30-34°C的温度。
9.一种在哺乳动物细胞中促进靶基因的转录和翻译的方法，包括下述步骤用包含轻度低温转录调控元件或轻度低温转录调控增强子的载体转化哺乳动物细胞;和培养转化的哺乳动物细胞，其中所述轻度低温转录调控元件由选自以下的核苷酸序列组成gcccc gcc(SEQ ID NO 9)，acccc gcc(SEQ ID NO 10)，tcccc gtc (SEQ ID NO :11)，tcccc get(SEQ ID NO 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO 14)，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述轻度低温是30-34°C的温度，且其中相同或不同的所述轻度低温转录调控元件在所述轻度低温转录调控增强子中 直接或通过其他核苷酸被连接。
全文摘要
本发明的一个目的是提供一种在使用哺乳动物细胞的重组DNA方法中增加蛋白产量的方法。当轻度低温转录调控元件，其包含至少一个核苷酸序列X1ccccX6X7X8，其中，X1是t，g，或a；X6是g，a或c；X7是c，a，或t；以及X8是c，a和t，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列，用作为增强子及在轻度低温下培养哺乳动物细胞时，促进了期望蛋白的转录。当将SEQ ID NO23的轻度低温翻译调控元件置于编码序列的5`端和启动子的3`端及在轻度低温下培养哺乳动物细胞时，促进了期望蛋白的翻译。
文档编号C12N15/113GK101857864SQ201010170098
公开日2010年10月13日 申请日期2005年3月1日 优先权日2004年3月23日
发明者藤田润 申请人:藤田润