专利名称：突变aox1启动子的制作方法
突变A0X1启动子本申请是申请日为2006年02月23日、申请号为200680005888. 1(国际申请号为 PCT/AT2006/000079)、发明名称为“突变AOXl启动子”的发明申请的分案申请。本发明涉及突变巴斯德毕赤酵母AOXl启动子。酿酒酵母(S. cerevisiae)作为真核模式生物和产生体系一直以来在科学和生物 技术使用上占据重要地位(并且目前仍然占据重要地位)。上世纪另一种酵母获得了很大 的关注裂殖酵母(fission yeast)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。由于 其只依靠裂殖的繁殖特性，粟酒裂殖酵母作为模式生物获得了极大的关注，并且时至今日 在分子遗传学和细胞生物学方面，它连同酿酒酵母一起是最彻底研究的酵母菌种。在目前 已知的超过700种不同的酵母菌种里，上述两种酵母仅能够为技术和科学应用提供有限的 感兴趣的特性。自二十世纪七十年代或八十年代以来，将越来越多具有突出特性的酵母菌 种研究用于生物技术和研究。这些所谓的非常规酵母(non-conventional yeast ；NCY)或 非酵母属酵母(non-Saccharomyces yeast)(在这种情况下术语酵母属包括酵母粟酒裂殖 酵母)的开发出于几种理由它们拥有医学重要性如白念珠菌(Candida albicans)或技术 相关性(technologicalrelevance)如具有在特殊底物(例如n_烷烃、乳糖)上的生长能 力的Yarrowialipolytica和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。例如大量地研究 最普遍的人真菌病原体白念珠菌以揭示涉及病理的毒力因子的本质，因此白念珠菌成为致 病酵母的模式生物。另一组良好建立的NCY是甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵 母(Hansenula polymorpha) (Pichia angusta)，其在重组蛋白产生和过氧化物酶体生物发 生的研究方面优于酿酒酵母。这些仅是仍然具有技术或学术吸引力的非常规酵母中最突出 的成员。到目前为止几个其它的菌种也是特别感兴趣的，而这个组将在今后几年迅速地成 长。糖，自然界中种类最丰富的分子，为所有已知的酵母利用。尽管种与种之间的底物 接受度(acceptance)存在巨大差异(参见表1)，葡糖_6_磷酸或果糖_6_磷酸到丙酮酸 的转化是它们新陈代谢中共同的主题。总之，用于糖酵解途径的酶设备在不同的酵母之间 存在巨大的变化。虽然酿酒酵母中大多数酶是，至少是部分地已知并表征的，而在NCY中仅 描述了少数酶。在一些酵母中糖酵解所需的一些功能通过几种基因/酶介导，特别是那些 在新陈代谢控制或调节中扮演额外角色和/或处于分支点的基因/酶，如葡糖激酶/己糖 激酶、磷酸果糖激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。通常，差别调节的同工酶说明在变化的环境 先决条件下的不同的功能。一些编码糖酵解酶的基因是组成性和高表达的，例如酿酒酵母 PGKl (磷酸甘油酸激酶)或巴斯德毕赤酵母GAP基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，而其它酶 是严格调节的如酿酒酵母的ENOl (烯醇化酶)基因。表1 选择的引起生物技术方面兴趣的具有葡萄糖和果糖以外相关商业底物的酵 母
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权利要求
野生型巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1(AOX1)启动子(SEQ ID No.1)的突变巴斯德毕赤酵母AOX1启动子，其包含Seq ID No.1的核苷酸694至723( 260至 231)中的至少一个突变用于在去阻抑条件下高表达。
2.根据权利要求1的启动子，其特征在于所述启动子还包含SeqID No. 1的核苷酸170 至239 (-784至-719)和/或核苷酸729至763 (-225至-191)的突变和/或转录因子结合 位点(TFBS)的突变和/或选自下组的至少一个突变核苷酸170至191 (-784至-763)、核 苷酸 192 至 213 (-762 至-741)、核苷酸 192 至 210 (-762 至-744)、核苷酸 207 至 209 (-747 至-745)、核苷酸214至235 (-740至-719)、核苷酸304至350 (-650至-604)、核苷酸364至 393 (-590 至-561)、核苷酸 434 至 508 (-520 至-446)、核苷酸 509 至 551 (-445 至-403)、核 苷酸 552 至 560 (-402 至-394)、核苷酸 585 至 617 (-369 至-337)、核苷酸 621 至 660 (-333 至-294)、核苷酸 625 至 683 (-329 至-271)、核苷酸 736 至 741 (-218 至-213)、核苷酸 737 至 738 (-217 至-216)、核苷酸 726 至 755 (-228 至-199)、核苷酸 784 至 800 (-170 至-154 或核苷酸823至861 (-131至-93)。
3.根据权利要求1或2的启动子，其特征在于所述突变是缺失、取代、插入和/或倒位。
4.根据权利要求2或3的启动子，其特征在于所述转录因子结合位点(TFBS)选自下 组Hapl、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rapl、Adrl、MatIMC、Gcrl 和 QA-1F，其中所述转录因子 结合位点(TFBS)Hapl优选包含Seq ID No. 1的核苷酸54至58，Hsf包含Seq ID No. 1的 核苷酸142至149和517至524，Hap234包含Seq ID No. 1的核苷酸196至200、206至210 和 668 至 672，abaA 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 219 至 224，Stre 包含 Seq ID No. 1 的核 苷酸 281 至 285，Rapl 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 335 至 339，Adrl 包含 Seq ID No. 1 的 核苷酸 371 至 377，Mat IMC 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 683 至 687，Gcrl 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸702至706和QA-IF包含Seq ID No. 1的核苷酸747至761。
5.核酸分子，包含至少一个根据权利要求1至4任一项的突变巴斯德毕赤酵母醇氧化 酶I(AOXl)启动子和编码蛋白质(肽)或功能性核酸的至少一个核酸，其特征在于所述启 动子和所述核酸可操作地连接在一起形成单或多拷贝表达盒。
6.载体，其包含根据权利要求1至4任一项的突变巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1(AOXl) 启动子或根据权利要求5的核酸分子。
7.细胞，其包含至少一个根据权利要求1至4任一项的突变巴斯德毕赤酵母醇氧化酶 1 (AOXl)启动子、至少一个根据权利要求5的核酸分子或至少一个根据权利要求6的载体。
8.根据权利要求7的细胞，其特征在于所述细胞是真核细胞，特别是酵母细胞，优选甲 基营养酵母细胞，优选选自下组念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属，特别是 巴斯德毕赤酵母细胞。
9.用于表达所选蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含i)根据权利要求6的载体，和 )能够在根据权利要求1至4任一项的启动子控制下表达所述蛋白的细胞。
10.根据权利要求9的试剂盒，其特征在于所述细胞是酵母细胞，优选甲基营养酵母细 胞，优选选自下组念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属，特别是巴斯德毕赤酵 母细胞。
11.用于在细胞中表达重组蛋白、肽或功能性核酸的方法，所述方法包括以下步骤-提供根据权利要求5的核酸分子或根据权利要求6的载体，所述核酸分子和载体包含 根据权利要求1至4任一项的醇氧化酶1启动子和编码蛋白质、肽或功能性核酸的核酸，将 所述启动子与所述核酸可操作地连接，-将所述细胞用所述载体或所述核酸分子转化，-在合适的培养基中培养转化的细胞，-任选地诱导所述蛋白质、肽或功能性核酸的表达和-分离所述表达的蛋白质、肽或功能性核酸。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于所述细胞是酵母细胞，优选甲基营养酵母细 胞，优选选自下组念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属，特别是巴斯德毕赤酵 母细胞。
13.根据权利要求5的核酸分子、根据权利要求6的载体或根据权利要求7或8任一项 的细胞用于表达蛋白质、肽或功能性核酸的用途。
14.用于分离超表达克隆的方法，所述方法包括以下步骤a)将包含至少一个根据权利要求1至4中任一项的突变巴斯德毕赤酵母醇氧化酶 1 (AOXl)启动子和至少一个编码蛋白质(肽)或功能性核酸的核酸和标记抗性基因的核酸 分子或包含所述核酸分子的载体引入细胞，其中所述启动子和所述核酸可操作地连接在一 起形成单或多拷贝表达盒，b)将步骤a)的细胞转移至培养基，所述培养基包含合适的选择标记、无甲醇的非阻抑 碳源，用于在去阻抑条件下超表达克隆的选择性生长，c)在所述培养基上培育来自步骤b)的细胞，d)分离获得自步骤c)的细胞的菌落，和e)通过测定所述细胞的表达率检测超表达克隆。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于选择标记是抗生素，优选Zeocin或遗传霉素。
16.根据权利要求14或15的方法，其特征在于选择标记是Zeocin，并且标记抗性基因 是sh ble基因。
17.根据权利要求14至16中任一项的方法，其特征在于所述细胞是酵母细胞，优选甲 基营养酵母细胞，优选选自下组念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属，特别是 巴斯德毕赤酵母细胞。
18.根据权利要求11至17中任一项的方法，其特征在于所述非阻抑碳源选自下组丙 氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、乳糖和它们的组合。
19.根据权利要求11至18任一项的方法，其特征在于将核酸分子或载体通过转化，优 选电穿孔或化学转化，或通过原生质体融合，或通过粒子轰击来引入细胞。
全文摘要
本发明涉及突变AOX1启动子，具体地，本发明涉及野生型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)醇氧化酶1(AOX1)启动子(SEQ ID No.1)的突变巴斯德毕赤酵母AOX1启动子包含选自下组的至少一种突变a)转录因子结合位点(TFBS)，b)Seq ID No.1的核苷酸170至235(-784至-719)、核苷酸170至191(-784至-763)、核苷酸192至213(-762至-741)、核苷酸192至210(-762至-744)、核苷酸207至209(-747至-745)、核苷酸214至235(-740至-719)、核苷酸304至350(-650至-604)、核苷酸364至393(-590至-561)、核苷酸434至508(-520至-446)、核苷酸509至551(-445至-403)、核苷酸552至560(-402至-394)、核苷酸585至617(-369至-337)、核苷酸621至660(-333至-294)、核苷酸625至683(-329至-271)、核苷酸736至741(-218至-213)、核苷酸737至738(-217至-216)、核苷酸726至755(-228至-199)、核苷酸784至800(-170至-154)或核苷酸823至861(-131至-93)，和它们的组合。
文档编号C12N1/19GK101935657SQ201010173878
公开日2011年1月5日 申请日期2006年2月23日 优先权日2005年2月23日
发明者安东·格利德, 弗朗兹·哈特纳 申请人:格拉茨科技大学;Vtu控股有限责任公司