专利名称：检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明属于基因芯片的海洋生物的病原检测技术领域，具体涉及一种检测多种对 虾病原的基因芯片及其检测方法。
背景技术：
近年来，运用核酸技术对海水养殖动物病原微生物进行检测的方法发展非常迅 速，除了传统的聚合酶链式反应之外，还有聚合酶链式反应与分子杂交联用技术、聚合酶链 式反应与免疫学联用技术、限制性酶切技术及环介导的等温扩增等方法。但由于养殖动物 种类多、病原种类繁杂，针对单一病原的检测和诊断不能全面反映病害发生的原因和状况， 不利于确定有效的防治措施。现有的病原检测技术局限性大、效率低、系统性差，因此急需 海水养殖动物疾病检测手段在高通量分析能力上取得突破，打破技术瓶颈。新近发展起来的基因芯片技术为这一需求提供了强有力的技术平台。这一技术达 到在同一个支持物上对多种病原同时进行检测和鉴定的目的，不但大大缩短了检测时间， 而且能够提高灵敏度和准确率，弥补了其它分子生物学检测手段的不足。国内在基因芯片 技术应用于水产动物疾病检测上也进行了尝试，但目前尚未见应用该技术同时对对虾病毒 类、真菌类、原生动物类和对虾立克次氏体等病原进行检测的相关基因芯片应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法，用于检测 白斑综合症病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、 桃拉病毒、黄头病毒、对虾杆状病毒、产卵虾死亡病毒、传染性肌肉坏死病毒、LSNV、毛利病 毒、对虾诺达病毒、NHP、镰刀菌、杀鱼丝囊霉菌、变形藻丝囊菌、拟阿脑虫和对虾立克次氏体 共18类对虾病原，以解决现有技术不能高通量检测，以及灵敏度低和准确率差的问题。本发明的技术方案包括一、基因芯片的构建1、基因芯片上的探针选择本发明共提供了两大类探针1、提供了质控体系的探针，包括表面化学质控的探 针、阴性对照质控的探针以及杂交阳性外对照质控和整个流程监控的阳性内对照质控的探 针，同时提供了和各探针对应的正向引物及反向引物引物；2、提供了白斑综合症病毒、传染 性皮下和造血器官坏死病毒、肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、桃拉病毒、黄头病毒、对 虾杆状病毒、产卵虾死亡病毒、传染性肌肉坏死病毒、LSNV、毛利病毒、对虾诺达病毒、NHP、 镰刀菌、杀鱼丝囊霉菌、变形藻丝囊菌、拟阿脑虫和对虾立克次氏体共18类对虾病原微生 物特征基因的探针，同时提供各探针对应的正向引物及反向引物。质控体系包括表面化学质控QC1、杂交阳性外对照质控QC2、整个流程监控的阳性 内对照质控QC3、阴性对照质控QC4和空白对照QC5五部分。质控体系中各个成员的特征基 因及其序列在表1中的分布如下
整个流程监控的阳性内对照质控QC3特征基因1探针序列P1、正向引物序列Fl和 反向引物序列Al分别对应于表1中序号1、2和3 ；整个流程监控的阳性内对照质控QC3特 征基因2探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表1中序号4、5和 6 ；表面化学质控QCl探针序列P、正向引物序列F和反向引物序列A分别对应于表1中序 号7、8和9 ；阴性对照质控QC4探针序列P对应于表1中序号10 ；杂交阳性外对照质控QC2 探针序列P、正向引物序列F和反向引物序列A对应于表1中序号11、12和13。表1 质控体系的探针及引物序列信息
权利要求
一种检测多种对虾病原的基因芯片，其特征在于将用于检测白斑综合症病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、桃拉病毒、黄头病毒、对虾杆状病毒、产卵死亡病毒、传染性肌肉坏死病毒、LSNV、毛利病毒、对虾诺达病毒和NHP病毒的探针；用于检测镰刀菌、杀鱼丝囊霉菌和变形藻丝囊菌的探针；用于检测拟阿脑虫和对虾立克次氏体的探针点制在基因芯片载体上，探针的序列信息如下
2.如权利要求1所述的一种检测多种对虾病原的基因芯片，其特征在于上述的基因芯 片载体上还点制有整个流程监控的阳性内对照质控QC3的探针；探针的序列信息如下
3.如权利要求2所述的一种检测多种对虾病原的基因芯片，其特征在于上述的整个流 程监控的阳性内对照质控QC3的探针有替补探针，替补探针序列信息如下
4.如权利要求1或2所述的一种检测多种鱼类病原的基因芯片，其特征在于上述的基 因芯片载体为固相载体尼龙膜。
5.权利要求书1或2所述一种检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法，包括以下 步骤(1)待检样品准备、⑵地高辛标记的PCR扩增、(3)预杂交和杂交、⑷加入碱性磷 酸酶标记的地高辛抗体、(5)显色、(6)结果判读步骤，其特征在于步骤(2)中的地高辛标记 的 PCR 扩增体系是无菌去离子水 17. 25 μ L, IOXreaction buffer 2. 5μ L,20mM 的 MgCl2·1.5yL, PCR地高辛标记混合物0.5 μ L，10 μ M的正向引物和10 μ M的反向引物各1 μ L， 5unit/ μ L的rTaq DNA聚合酶0. 25 μ L，待检样品DNA 1 μ L，该反应体系总体积25 μ L。PCR 扩增程序94°C 4min ；94°C 30s, 55. 5°C 30s, 72°C 40s，35 个循环；72°C延伸 lOmin，4°C保 温，其中各正向引物和反向引物的序列信息如下
6.如权利要求5所述的一种检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法，其特征在于 上述镰刀菌的探针对应的引物存在替补引物，替补引物的序列信息如下
全文摘要
本发明涉及一种检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法。基因芯片的构建是将质控系统的探针和18种对虾病原的探针点在同一固相载体尼龙膜上制成。18种对虾病原的探针包括用于检测15种病毒的探针，用于检测镰刀菌、杀鱼丝囊霉菌、变形藻丝囊菌的探针以及检测拟阿脑虫和对虾立克次氏体的探针。本发明的基因芯片的检测是应用地高辛杂交显色方法，根据杂交点是否出现蓝色或蓝紫色来进行信号判断。本发明基因芯片上质控体系的构建保证了检测的特异性和灵敏性，并且可在同一尼龙膜上对多种对虾病原微生物进行同时检测，具有高通量的特点，可以替代之前的对虾病原微生物相关检测方法，是现有对虾病原微生物鉴定技术的突破。
文档编号C12Q1/70GK101942527SQ201010243399
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者刘莉, 史成银, 宋晓玲, 张宝存, 张庆利, 杨冰, 王秀华, 荆晓艳, 闫丽, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所