血清或血浆中微小rna的提取方法

专利名称：血清或血浆中微小rna的提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及血清或血浆中微小RNA的提取方法。
背景技术：
微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类全长为19 25个核糖核苷酸的非编码 调控单链小分子RNA，由一段具有发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成，通过与目标 mRNA (messenger RNAjfHRNA)分子的3-端非编码区域(3-UTR)互补配对使目标mRNA分 子的翻译受到抑制，从而在转录后对靶基因的表达水平进行调控。根据miRBase数据库(the microRNA database)的记载，现已发现的miRNAs达 9500多个，研究证实很多miRNAs与疾病的发生发展有关，尤其值得的关注的是与肿瘤发生 发展密切相关。近来，一些研究发现，miRNAs可以在血清或血浆中稳定存在，并且许多疾病 患者的血清或血浆中的一些miRNAs的表达明显与正常人不同，可以作为一种特异的疾病 标志物进行测定。Mitchell等发现miRNA-141在25例前列腺癌患者血清中均高表达，可 以达到60%的敏感性、100%的特异性，并且与前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平有一定 的关系。近来Resnick等对卵巢上皮癌患者血清中的miRNAs也进行了测定28例患者的 血清均在治疗前收集，以正常未婚者作对照，结果显示miR-21、miR-92、miR-93、miR-126、 miR-29b在患者中明显高表达，而miR-155、miR-127、miR-99b则低表达，并且发现miR-21、 miR-92,miR-93在患者CA-125 (癌抗原-125)升高以前出现，所以预示着这3种miRNAs可 以作为癌基因治疗靶点及卵巢上皮癌早期发现的标志物。各种肿瘤的临床用药均存在不 同程度的损伤肝功能的副作用，Wang等在小鼠肝损伤模型中发现一些在肝组织中高表达的 miRNAs，如miR-122、miR-192可以在小鼠血清中持续高表达，这些血清中的miRNAs在肝损 伤早期就可以检测出来，所以他们提出miR-122、miR-192可以作为药物性肝损伤的早期诊 断指标。由于血清或血浆中miRNAs比较稳定，且其具有潜在的疾病标志物的巨大价值。对 于肿瘤患者诊断具有较好的敏感性及特异性，加上取材的相对无创性，显示出了其作为肿 瘤标志物的优势，但距临床应用还有一定距离。首先血清或血浆中miRNAs提取是关键的一 个步骤，现有一些miRNAs提取试剂盒可以用于血清或血浆中miRNAs提取，如美国Qiagen 公司的miRNeasy mini kit，但由于其价格比较贵而限制了其大规模应用。

发明内容
本发明提供了一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，能有效富集血清或血浆中 微小RNA，提取效率与现有大公司的试剂盒相当，而价格仅是它们的1/3以下，有利于血清 或血浆中微小RNA在临床的验证和推广应用。一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，依次包括以下步骤(1)将血清或血浆样本与RNA抽提试剂以体积比为1 1. 5 2. 5在第一离心管 内震荡混合后静置，再向第一离心管中加入氯仿震荡混合，并在4 6°C温度下离心分离得
3到上层液体，为预分离样品；由于所述的血清或血浆样本通常是预先保存在-70°C以下的，因此在使用前需要 在冰上预先融解，然后分装到第一离心管中，再与RNA抽提试剂混合；离心分离在4 6°C 温度下进行，可有效保持预分离样品中微小RNA的稳定性；为了去除预分离样品中杂质，重复所述的加入氯仿震荡混合并在4 6°C温度下 离心分离的操作至少一次；(2)将步骤(1)得到的预分离样品收集在第二离心管中，并向第二离心管中加入 标记有-Si-OH功能基团的磁珠，混合均勻后静置，使得所述的磁珠充分捕获预分离样品中 的微小RNA ；再将第二离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，这样在第二离心管中 得到(仅剩下)捕获有微小RNA的磁珠；(3)向经步骤(2)分离后得到的装有捕获有微小RNA的磁珠的第二离心管中，加入 高盐缓冲液混合均勻，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体；再向第二离心管中 加入体积百分比为70 75%的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体，得 到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；由于经过步骤(2)分离得到的磁珠不仅捕获了大量微小RNA，还吸附了一些杂质， 经过高盐缓冲液的洗涤和分离，有效除去这些杂质，再采用无毒易挥发的乙醇进一步洗涤 和分离，除去了高盐缓冲液可能引入的杂质；为了达到更好的洗涤效果，重复所述的加入高盐缓冲液混合均勻，并置于所述的 磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次；同样，为了达到更好的洗涤效果，重复所述的加入体积百分比为70 75%的乙 醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次；(4)干燥步骤(3)得到的第二离心管中的磁珠，再向第二离心管中加入洗脱液，在 60 70°C的水浴下静置，从磁珠上洗脱捕获的微小RNA ；在60 70°C的水浴下洗脱，既可保证洗脱效率和效果，尽可能获得大量的微小 RNA ；又可保证不破坏微小RNA的结构，避免微小RNA变性，保证提取样品的质量。(5)将步骤(4)得到的第二离心管先在室温离心，再置于所述的磁性处理器上分 离，吸取离心管内液体进行收集，即为含有微小RNA的提取样品。通常，将收集的含有微小 RNA的提取样品保存在-70°C以下待用。本发明中，所述的RNA抽提试剂优选为trizol试剂，所述的trizol试剂方便易 得，可以从各种商业途径购买获得，如可从美国irwitrogen公司购得；同时，本发明中所述 的trizol试剂可高效富集血清或血浆中的微小RNA。本发明中，步骤(1)中血清或血浆样本与RNA抽提试剂的体积比优选为1 2，此 时富集微小RNA的效果最好。本发明中，所述的标记有-Si-OH功能基团的磁珠可以通过商业途径购买得到，比 如美国Chemicell公司的SiMAG/MP-DNA或者geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的磁珠。本发明 中，优选采用直径为Ium 2um的磁珠，与微小RNA结合具有最佳的结合效果，能更有效地 捕获微小RNA。本发明中，所述的磁性处理器为内部设有磁铁的装置，可设有各种形状的支架，其 具有磁力并可分离磁珠。当含有磁珠的反应体系放置在磁性处理器上时，在磁力的作用下，溶液中本来相对均勻分布的磁珠集中在磁极方向，从而达到分离磁珠的目的。本发明中，所述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍，也可以直接使用美国 Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的Wash-Buffer I。从成本方面考虑，优选所 述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍。本发明中，所述的洗脱液优选为无RNA酶的双蒸灭菌水，或经过DEPC处理的双蒸 灭菌水，保持提取样品中微小RNA的完整。所述的无RNA酶的双蒸灭菌水可以从各种商业途径购买到，如北京百泰克生物技 术有限公司；所述的经DEPC处理的双蒸灭菌水的制备方法如下去离子水经0. 焦碳酸 二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)过夜处理后，再经高温高压灭菌制备而成。经DEPC 处理的双蒸灭菌水中RNA酶失活。本发明中，用Trizol试剂和氯仿提取血清或血浆样本中总RNA，得到预分离样品； 然后采用标记有-Si-OH功能基团的磁珠来捕获预分离样品中的微小RNA，并用磁性分离器 从预分离样品中分离得到捕获有微小RNA的磁珠；对捕获有微小RNA的磁珠进行简单的洗 涤除去杂质后，干燥捕获有微小RNA的磁珠，并采用洗脱液加热洗脱捕获在磁珠上的微小 RNA，最后通过磁性分离器分离，得到富集微小RNA的提取样品。采用本发明方法提取血清或血浆中微小RNA，提取效率与现有大公司的试剂盒相 当，而价格仅是它们的1/3以下(如Qiagen公司的miRNeasymini kit价格为人民币2864 元，可以提取50份样品，即每个样品提取需要57. 28元；而本发明提取每个样品只需要人民 币15元左右)，有利于血清或血浆中微小RNA在临床的验证和推广应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明可有效富集血清或血浆中微小RNA，因此，采取本发明方法，可以快速、有 效、低成本地提取血清或血浆中微小RNA。用本发明方法从每200 μ 1血清或血浆提取的微 小RNA就足够用于检测6个以上微小RNA，因此，本发明方法提取成本比较低，有利于候选疾 病标志物微小RNA的大规模临床验证和后续的临床应用。
具体实施例方式下面结合实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1血清中微小RNA的提取一种血清中微小RNA的提取方法，其具体步骤如下将预先保存于-70°C冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血清样本 到标记好的1. 5ml的①号离心管中，然后加400 μ 1的trizol试剂，震荡混合后静置8 10 分钟；然后再向①号离心管加入100μ 1氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4°C条 件下离心15分钟；从离心机里拿出①号离心管，吸取上层白色液体到1.5ml的③号离心管 中；向③号离心管中加入100μ 1氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4°C条件下离 心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸取上层白色液体，为预分离样品；将预分离样品收集在1. 5ml的②号离心管中，并向②号离心管中加入50 μ 1美国 Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的磁珠，磁珠的直径为2um，混合均勻后室温 静置8 10分钟；将②号离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，在②号离心管中得 到捕获有微小RNA的磁珠；
将上述得到的②号离心管从磁性处理器中取出，向②号离心管中加入500μ 1 geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的Wash-BufferI，混合均勻后室温静置2 3分钟，再将②号离 心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，重复Wash-Buffer I洗涤操作一次；将②号离 心管从所述的磁性处理器中取出，向②号离心管中加入500μ 1体积百分比为70%的乙醇， 混合均勻后室温静置2 3分钟，再将②号离心管置于所述的磁性处理器上分离，移除管内 液体，重复乙醇洗涤操作一次，得到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；将②号离心管放入真空离心机抽滤，等②号离心管内磁珠干燥后，向②号离心管 中加入40 μ 1无RNA酶的双蒸灭菌水，放到水浴箱，60°C静置10分钟，从磁珠上洗脱捕获的 微小RNA ；将②号离心管从所述的水浴箱中取出放到离心机，室温8000g/min离心1分钟； 将②号离心管从离心机取出置于磁性处理器上，吸取管内液体，即为含有微小RNA的提取 样品。将得到的含有微小RNA的提取样品收集在新的离心管，作好标记保存于-70°C冰箱中 待用。实施例2本发明与其它方法提取血清中微小RNA的效果对比对比例1将预先保存于-70°C冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1到标记好 的1. 5ml①号离心管中，然后加400 μ 1 trizol，震荡混合后静置8 10分钟；然后再加入 100 μ 1氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4°C条件下离心15分钟；从离心机里拿 出①号离心管，吸取上层白色液体到③号离心管中，加入100 μ 1氯仿，震荡混合后放入离 心机，12000g/min，4°C条件下离心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸取上层白色液 体到②号离心管中，加入2倍上层液体体积异丙醇，混合均勻后放在-20°C冰箱过夜(大概 16-18小时)；然后12000g/min，4°C条件下离心10分钟；倒掉液体，加入1毫升预冷的75% 乙醇，12000g/min, 4°C条件下离心10分钟；倒掉液体，等自然干燥后重溶于10 μ 1无RNA酶 水，作好标记保存于-70°C冰箱中待用。对比例2采用美国Qiagen公司的miRNeasy mini kit试剂盒。操作步骤如下将预先保存 于_70°C冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血清样本到标记好的1. 5ml① 号离心管中，然后向①号离心管中加400 μ 1试剂盒中的裂解液，震荡混合后静置8 10分 钟；然后再加入100μ 1氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4°C条件下离心15分钟； 从离心机里拿出①号离心管，吸取上层白色液体到③号离心管中，加入100 μ 1氯仿，震荡 混合后放入离心机，12000g/min，4°C条件下离心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸 取上层白色液体到②号离心管中，加入1. 5倍体积的纯乙醇混合均勻；吸取700μ 1到试剂 盒自配的柱子上，8000g/min，15°C条件下离心15秒；倒掉底部液体，再加剩余样品，在同样 条件下离心；倒掉底部液体，加700 μ 1 RffT到柱子，8000g/min，15°C条件下离心15秒；倒 掉底部液体，加500 μ 1 RPE到柱子，8000g/min，15°C条件下离心15秒；倒掉底部液体，加 500 μ 1 RPE到柱子，8000g/min，15°C条件下离心2分钟；柱子转移到④号离心管，12000g/ min，15°C条件下离心1分钟；加无RNA酶水40 μ 1，把柱子转移到⑤号离心管中，8000g/ min, 15°C条件下离心1分钟，作好标记保存于_70°C冰箱中待用。荧光定量PCR检测将采用实施例1与对比例1和2的方法得到的含微小RNA的提取样品分别经过荧光定量PCR(PCR为Polymerase Chain Reaction的简写，即为聚合酶链式反应)检测进行比 较。荧光定量PCR采用美国ABKAppliedbiosystems)公司用于检测miR-191的成套试剂 盒，包括TaqMan MicroRNA Assays,TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 和TaqMan Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG，采用 TAGMAG 探针法。具体步骤如下A :miR-191 反转录反应试剂及用量IOOmmol/L dNTPs 0.15ulMultiscribe 反转录酶(RT enzyme) :lul10X 反转录缓冲液(10氺RT buffer) :1· 5ulRNA 抑制剂(RNase Inhibitor) :0· 19ul反转录引物(RTprimers) :2ul含微小RNA的提取样品(sample) :2ul无核酸酶的水(Nuclease-free water) 8. 2ul反应体系15ul/管。反应程序:16°C · 30分钟；420C · 30分钟；85°C · 5分钟；4°C保存。B :miR-191荧光定量PCR检测TaqMan 2*Universal PCR Master Mix :10ul.Nuclease-free water :7ulPrimer+probe Iul反转录产物2ul反应体系20ul/管，2次重复。反应程序50°C· 2 分钟，95°C · 10 分钟-----95°C · 15 秒；60°C · 60 秒循环 40次。PCR检测结果见表l，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域 值(threshold)时所经历的循环数。荧光域值(threshold)采用30000。即Ct值越低说明 起始miR-191含量越高。表 1 从表1可见，本发明方法的提取效果与世界上最公认的美国Qiagen公司的试剂盒 (对比例2)效果接近，而明显优于其它方法(对比例1)。实施例3血清中微小RNA的提取的重复性实验将预先保存于_70°C冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1到标记好 的1. 5ml离心管中，采用与实施例1相同的方法提取微小RNA。重复三次，得到的含微小RNA的提取样品分别记为样本1，样本2，样本3。对三次重复实验提取得到的样本1，样本2和 样本3进行荧光定量PCR分析，结果如表1所示。其中，荧光定量PCR检测条件和步骤同实施例2相同，重复检测三次，检测结果如 表2所示。荧光域值(threshold)采用30000。表 2 从表2中可见，采取本发明方法提取血清中微小RNA具有非常好的重复性。实施例4血浆中微小RNA的提取将预先保存于-70°C冰箱的血浆样本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血浆样本 到标记好的1. 5ml的①号离心管中，接下来的实验步骤同实施例1。另外，荧光定量PCR检测条件和步骤同实施例2相同，重复检测二次，检测结果如 表3所示。荧光域值(threshold)采用30000。表3
实施例4 (Ct值)miR-19127.7527.94从表3中可见，采取本发明方法提取血浆中微小RNA也具有非常好的效果。实施例5血清中微小RNA的提取本实施例中除了把Wash-BufferI换成5mol/L硫氰酸胍，其它实验步骤同实施例 1。另外，荧光定量PCR检测条件和步骤与实施例2相同，重复检测二次，检测结果如 表4所示。荧光域值(threshold)采用30000。表 4 从表4中可见，采取5mol/L硫氰酸胍为洗涤液提取血清中微小RNA也具有非常好 的效果。
权利要求
一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，其特征在于，依次包括以下步骤(1)将血清或血浆样本与RNA抽提试剂以体积比为1∶1.5～2.5在第一离心管内震荡混合后静置，再向第一离心管中加入氯仿震荡混合，并在4～6℃温度下离心分离得到上层液体，为预分离样品；(2)将步骤(1)得到的预分离样品收集在第二离心管中，并向第二离心管中加入标记有 Si OH功能基团的磁珠，混合均匀后静置；再将第二离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，在第二离心管中得到捕获有微小RNA的磁珠；(3)向经步骤(2)分离后得到的装有捕获有微小RNA的磁珠的第二离心管中，加入高盐缓冲液混合均匀，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体；再向第二离心管中加入体积百分比为70～75％的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体，得到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；(4)干燥步骤(3)得到的第二离心管中的磁珠，再向第二离心管中加入洗脱液，在60～70℃的水浴下静置，从磁珠上洗脱捕获的微小RNA；(5)将步骤(4)得到的第二离心管先在室温离心，再置于所述的磁性处理器上分离，吸取离心管内液体进行收集，即为含有微小RNA的提取样品。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的RNA抽提试剂为trizol试剂。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，第一离心管内震荡混合的 血清或血浆样本与RNA抽提试剂的体积比为1 2。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的磁珠的直径为1 2μπι。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的洗脱液为无RNA酶的双蒸灭菌 水，或经过DEPC处理的双蒸灭菌水。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，重复所述的加入氯仿震荡 混合并在4 6°C温度下离心分离的操作至少一次。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，重复所述的加入高盐缓冲 液混合均勻，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次。
9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，重复所述的加入体积百分 比为70 75%的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次。
全文摘要
本发明公开了一种有效富集血清或血浆中微小RNA的提取方法，用Trizol和氯仿预分离样品中微小RNA，然后通过标记有-Si-OH功能基团的磁珠的方法捕获预分离样品中的微小RNA，用磁性分离器分离磁珠及样品；经过简单的洗涤干燥后，加无RNA酶水后通过水浴箱加热洗脱，进一步通过磁性分离器分离即可。本发明的方法可用于候选疾病标志物微小RNA的大规模验证和临床应用时的微小RNA的提取。本发明方法能高效富集血清或血浆中微小RNA，不仅方便快捷，且价格低廉。
文档编号C12N15/10GK101914526SQ20101025390
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者凌志强, 毛伟敏, 牟瀚舟, 郑智国 申请人:浙江省肿瘤医院