专利名称：鸡脂肪候选基因Lpin2基因及其应用方法
技术领域：
本发 明属于分子生物学检测动物脂肪性状技术领域，具体涉及一种鸡脂肪候选 基因lpin2基因及其应用方法。
背景技术：
1、Lpin2基因与脂肪沉积的关系目前，Lpin2基因的研究主要集中在人和小鼠上，关于鸡Lpin2的研究还未见相 关报道。Lpin2是在60%的氨基酸序列与Lpinl相似的基础上被鉴定出来的，它含有两个 高度保守区域N-LIP (约125个氨基酸)和C-LIP (约200个氨基酸)域，这两个区域对它 的功能来说是很关键的。Jimmy Donkor (2007)的研究确定哺乳动物的lipin2是磷脂酸磷 酸酶l(PAPl)，它在甘油三酯、卵磷脂和脑磷脂的从头合成中起到重要作用，他(2009) 的最新研究又发现Lpin2与Lpinl—样，也具有转录辅激活因子活性，可以调节脂肪酸氧 化相关基因的表达。在动物体内中，甘油三酯、卵磷脂和脑磷脂的从头合成主要是通过甘油磷酸途 径来催化的。磷脂酸磷酸酶在甘油磷酸途径中甘油三酯、卵磷脂和脑磷脂的生物合成中 是必需的，甘油磷酸途径可以催化磷脂酸脱磷酸化产生甘油三酯和Pi。脂肪组织中不足 的和过度的甘油三酯沉积与肝脏和骨骼肌中不恰当的脂质蓄积相关，还与受损的脂肪因 子的产生有关。这些反过来又造成胰岛素抗性和血脂异常，即代谢综合征的主要组分。 从对疾病如肥胖和脂肪营养不良的研究中我们就可以清楚地看到脂肪沉积的调节对于代 谢平衡来说是很关键的。2、Lpin2基因在人上的研究在人类上，Lpin2被定位在ISpll上，一个与2型糖尿病有关的区域。 Lpin23，UTR的一个SNP rs3745012与脂肪分布和2型糖尿病显著相关。Zhou J的研究 指出，人类Lpin2基因包含20个外显子并约跨越115kb，推测Lpin2cDNA包含6245个核 苷酸。一个核定位信号靠近NH2末端，并且在Lpin蛋白质间是高度保守的。Lpin2在不 同的组织都有表达，包括骨骼肌。罕见的Lpin2突变会引起Majeed综合症，一种人类炎 症性障碍疾病，主要症状是易复发的骨髓炎、发烧、红细胞生成不良引起的贫血和皮肤 炎症，这些症状揭示了 Lpin2在体内非冗余的功能。在无亲缘关系的阿拉伯家族中鉴定 到三个不同的Lpin2突变，一个是Lpin2编码区两个核苷酸的缺失引起未成熟终止密码子 的出现，可能导致介导的无义mRNA的衰减并出现无功能的蛋白质产物；第二个突变发 生在Lpin2外显子17的供体剪接位点处，这可能会导致内含子序列的连读，在终止密码 子之前添加65个无关的氨基酸残基；这两个突变都阻碍了全长Lpin2蛋白质的生产，而 第三个突变则是点突变，它引起单个核苷酸的替换，S734L。3、Lpin2基因在鼠上的研究Matthew C (2009)在fld小鼠上的研究表明，Lpin2是一种在肝脏中富集的磷脂酸
磷酸酶，而且肝脏Lpin2蛋白质含量在Lpinl缺失、禁食和肥胖的情况下显著增加，通常不依赖于稳态mRNA水平的改变。若假设Lpinl是唯一一个在甘油三酯合成方面有重要 作用的磷脂酸磷酸酶，fld小鼠的肝脏表型有点奇怪。首先，新生的fld小鼠因甘油三酯的 过度堆积表现出严重的肝脏皮脂腺病；其次，虽然fld小鼠的其它组织严重缺乏PAPl活 性，成年fld小鼠仍保持显著的依赖Mg2+的PAP活性和甘油三酯合成的正常比率。这些研 究表明肝脏中还有其它活跃的PAPl酶。在标记的N端和C端区域序列同源性的基础上， Iipin家族的另外一个成员Lpin2被鉴定出来。重要的是，Lpin2也表现出PAPl活性，虽 然二者的相对活性和催化最大速率相比较为Lpinl >Lpin2。而这些数据又与近来在HeLa 细胞中使用Kpin2shRNA的研究形成强烈反差[32]，在那个研究中由于对IipinlmRNA 和蛋 白质的补偿性诱导，Kpin2的敲除实际上使得PAP-I活性增加了。虽然还没有关于这些 差异的明确解释，Kpinl和lipin2作为PAP-I酶的相对重要性已经很清楚的表明具有细胞 特异性。4、Lpin2基因在猪上的研究X.P.He(2008)对猪的Lpin2基因进行了分子鉴定、染色体定位及与背膘厚度的关 联分析，获得了猪Lpin2基因的一个2985bp的cDNA序列，这个序列包含一个2676bp， 两侧分别是Ilbp的5’ UTR和298bp的3’ UTR的开放阅读框。表达谱分析显示猪 Lpin2在肝脏中表达水平最高，在脾脏、肺、肾和脂肪中的表达水平也都很高，在心脏和 骨骼肌中的表达水平低。通过SCHP技术还将猪Lpin2定位在6q24-(l/2)q31上，依据猪 QTL数据库，背膘厚度的几个QTL也被定位在这个小染色体区域，这表明LPIN2可能与 猪的脂肪沉积有关，RH作图揭示了 Lpin2与猪6号染色体上的SW1059是紧密连锁的。 另外，在猪Lpin2上还鉴定到一个同义的SNP T2193C，并且通过Hin6I限制性内切酶检 测到这个SNP在编码序列的2193位置上并且没有导致氨基酸的改变，关联分析显示这个 SNP与猪第6和第7肋间的背膘厚度相关，这是揭示猪脂肪沉积能力的一个重要性状，因 此猜测Lpin2可能是猪脂肪沉积的一个候选基因。5、Lpin2 与 Lpinl 的关系Neil Grimsey (2008)的研究揭示Iipinl和2的功能从单细胞真核生物到哺乳动物 在进化上都是保守的，两个Lipins在HeLa M细胞内的位置不同，成簇的Lpin2与细胞膜 连接紧密。SiRNA介导的Lpinl的沉默导致HeLa M细胞中PAPl活性显著降低，这与表 达一个无效的Lpinl突变等位基因的fld小鼠组织中PAPl活性的丧失是一致的。然而， Lpin2的沉默则引起Lpinl水平和PAPl活性的提高。与它们在HeLa M细胞内不同的功能 一致，Lpinl和Lpin2在3T3-L1脂肪细胞的分化上表现出不同的蛋白质表达模式。Lpin2 的水平在Lpinl缺失的3T3-L1细胞中有所增加，并且没有弥补脂肪生成的缺陷，而Lpin2 的缺失则没有抑制脂肪生成。两个Lpin不同的功能可以解释它们在脂肪形成期间表达的 时序性，脂肪生成的细胞模型显示前脂肪细胞首先被定型为进行分化，随后便进行有限 的增殖，当它们获得专门的脂肪生成特性，包括脂质蓄积时，最终完成成熟过程。Lpinl 不在前脂肪细胞中表达，这表明Lpin2能够先于细胞分化提供必需的PAPl活性，Lpin2 的水平会间接影响脂肪生成。最后还指出两个Kpins的PAPl活性都可以被有丝分裂期间 的磷酸化作用所抑制，导致细胞分裂期间细胞PAPl活性的降低。因此可以说Lpinl和 Lpinl2不同的和非冗余的功能调节了整个细胞周期和脂肪细胞分化期间的脂肪生产。6、鸡Lpin2基因的初步分析
现已在NCBI数据库上搜索到鸡Lpin2CDS (ΝΜ_001006386)，经分析其位于鸡2 号染色体上，跨越全基因组序列的1938499-1966777bp这个区域。经分析和重新拼接得 到鸡Lpin2基因的完整序列，全长31516bp，包含19个外显子和18个内含子，鸡Lpin2 基因全编码序列长度为2664bp，预测编码887个氨基酸蛋白，与人、鼠、猪和爪蟾属 Lpin2的同源性分别为74.35%、74.67%, 72.94%和69.73%，与鸡Lpinl基因的同源性为 47.16%。目前，Lpin2基因的研究主要集中在人和小鼠上，关于鸡Lpin2的研究还未见相 关报道。研究Lpin2可以深入了解其与脂肪性状的关联，为筛选脂肪沉积相关的分子标 记和重要候选基因奠定基础，在培育低脂肪肉鸡新品系，调控肉鸡体内脂肪沉积方面有 重要作用。本研究拟通过寻找重要多态位点进行多态性分析，以了解鸡Lpin2基因变异 与性状的关联，为Lpin2基因在鸡上的深入研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是克隆出鸡脂肪性状的功能候选基因lpin2基因，并提供一种鸡脂 肪候选基因的应用方法，即单核苷酸多态性(SNPs)来检测鸡脂肪性状的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下本发明利用电子克隆和RT-PCR，从鸡的肝脏组织获得了鸡Lpin2基因(鼠Lpin2 基因的同源基因)的编码序列，编码序列(CDS)为2709bp。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。单核苷酸多态性(SNPs)来检测鸡脂肪性状的方法采用上述鸡脂肪候选基因 lpin2基因序列，与鸡基因组序列比对，针对存在的变异，采用PCR-RFLP法，用下述引 物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用MspI酶进行单核苷酸多态性检测，正向5'CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5'TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘。检测出鸡候选基因Lpin2的G444A是G还是A，G等位基因可被MSPI酶切产 生一个268和25碱基的片段；A等位基因不能被MSPI酶切；AA纯合子只产生一个386 的片段；GG纯合子将产生227和149碱基的片段；GA杂合子将产生386、227和149碱 基三种片段。分析显示鸡Lpin2基因不同基因型对一些屠体性状有显著效应。对体重和体尺 的效应达到显著水平中，AA基因型的体重和体尺最大，而GG基因型的体重和体尺均最 小。显示LPIN2基因对生长相关性状有重要的效应，有望用于鸡的标记辅助选择。本发明巧妙地利用创造酶切位点PCR-RFLP法检测SNPs，发现了影响鸡生长及 屠体性状的功能基因和特异性突变位点。采用标记辅助选择选择是一大发展趋势。
具体实施例方式一 .实验材料与方法1.实验材料1.1菌株和克隆载体本发明所用菌株见表
菌株名称 表型及基因型 DH5a supE44 ALacl69(Q80 LacZ ΔΜ15) hsdR17 RecA endAl gyrA98 thi-1 recAl JM109 recAl supE44 endAl hsdrl7 gryA96 relAl thiA(lac-proAB)F' (traD36 proAB+ ___IaIq LacZ AMI 5)__本发明所用的克隆载体为pGEM 3zf (+/_) vectorspGEM 7zf (+/_) vectorsPGEM-T Vectors 均来自 Promega 公司。1.2.实验动物组织样与血样 以固始鸡、安卡红肉鸡杂交产生的F2代为实验素材，其中肉鸡做父本为正交 系，固始鸡做父本为反交系，正反交各4个家系共860只鸡。13周龄宰杀，记录各项屠 体指标。13周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝，酚仿抽提之后，TE溶解_20°C保存。1.3.酶与试剂各种酶、RNA试剂盒、RACE试剂盒等试剂分别购自华美生物工程公司、Biolab 公司和Promega公司；PCR引物由上海生物工程公司和西安美联公司合成。其它常规试 剂来自中国农业大学物资供应科。1.4.DNA 分析软件同源性分析软件DANMANPCR 引物设计软件OLIG04.0，数据分析软件SAS (6.12版本)。2.实验方法2.1电子克隆方法以鼠LPIN2基因(accession Num. NM_022882)编码序列为种子序列，搜索 NCBI数据库，获得一个与鼠编码序列高度同源的基因(NM_001006386)，并以该序列为 模板进行基因的PCR验证。2.2设计引物DRT-PCR验证鸡Lpin2基因编码序列和检测编码序列多态的引物表IRT-PCR验证鸡Lpin2基因编码序列和检测编码序列多态的引物
Primers Primer sequences (5，-3，)Banding Size
number____region__(bp)
896
57CT^ATG^GTAATGGTAGCfQ3i
"F2 5' CTCGAAGGATCATTACCCATTA 3' .2047
^AGTCCA0^CTAGGTGAG"3；3) PCR-RFLP法检测变异的引物正向5'CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5'TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘
扩增片段长度为386bp。2.3缓冲液与常用试剂的配制 TE缓冲液IOmMTris · Cl, ImM EDTA, pH8.0,高压灭菌。高压灭菌条件 为 1.034 X IO5Pa, 20min。STE 缓冲液O.lMNaCl，IOmMTris · Cl, lmMEDTApH8.0,高压灭菌。50XTAE 缓冲液Tris 碱 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0) 100ml,加水
至1L。5 X TBE 缓冲液Tris 碱 54g，硼酸 27.5g，0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,力卩水至1L。质粒DNA 提取溶液 I 50mM 葡萄糖，2.5mM Tris · Cl (pH8.0)，IOmM EDTA(pH8.0)，高压灭菌10磅15min，贮存于4°C。质粒DNA提取溶液II 0.2M NaOH, 1% SDS,现配现用。质粒DNA提取溶液III: 5M乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。IPTG溶液IPTG Ig溶解于50ml双蒸水中，过滤除菌，分装贮存于_20°C。IM Tris · Cl: 121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定 容至1000ml，高压灭菌。0.5M EDTA EDTA 186.Ig 溶于 800ml 双蒸水中，用 NaOH 调 pH 值至 8.0，定 容至1000ml，高压灭菌。3M NaAc(pH7.0) NaAc · 3H20 408.Ig 溶于 800ml 双蒸水中，用冰乙酸调 pH 至7.0，定容至1000ml，高压灭菌。3M NaAc(pH5.2) NaAc · 3H20 408.Ig 溶于 800ml 双蒸水中，用冰乙酸调 pH 至5.2，定容至1000ml，高压灭菌。IM CaCl2 CaCl2 · 6H20 27g 加水至 100ml，过滤灭菌，贮存于 _20°C。10% SDS SDS IOOg溶于900ml双蒸水中，加热至68°C助溶，用HCl调pH值 至7.2，定容至IOOOmLRNaseA 溶液100mg/ml 溶于 IOmM Tris · Cl (pH7.5)，15mM NaCl 中 100°C煮 沸IOmin，室温冷却后，贮存于_20°C。血液DNA 提取液IOmM Tris · Cl (pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20 μ g/ml 胰 RNA 酶，0.5% SDS。组织DNA提取液
Stock concentrationWorking concentration
RnaselOmg/ml_20ug/ml_
"Proteinase KlOms/ml100~200ug/ml
Tissue DNAIM Tris-Cl(pH8.0)50mM
extraction0.5M EDTA(pH8.0) Μ^
solution'
2M NaClIOOmM
10% SDS1%2.4胶回收方法
1)将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入灭菌的小
离心管中，称取重量。2)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN(如果凝胶重为O.lg，其体积可视为 IOOuL,则加入300 μ L溶胶液)，55°C水浴放置10分钟，每两分钟摇动一下离心管，以 确保胶块充分溶解。4)胶块完全熔解后，将降至室温的胶溶液(吸附柱在较高温度时结 合DNA的能力较弱)移入一个吸附柱CA2 (吸附柱放入收集管中)，3000rpm离心30sec， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。如果是少而贵重的物品，可将收集 管中的液体重新吸到吸附柱中离心，以提高回收效率。3)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW(按要求使用前加入无水乙醇)，8000rpm
离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。重复步骤此步骤一次以 提高回收效率。4)将收集管中的废液倒掉，IOOOOrpm离心Imin尽量除去漂洗液。将吸附柱置 于室温彻 底晾干，以防止残留的漂洗液影响回收率和DNA的质量。5)将吸附柱放到一灭菌的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65 70°C 水浴预热的30 μ L洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。IOOOOrpm离心Imin收集DNA溶液。2.5克隆测序流程Α、连接反应1)将纯化回收产物用pGEM-T Easy(promega)载体4°C连接24h，连接体系如 下2 X快速连接反应缓冲液 5ul;pGEM-T Easy 载体(50ng/ul) 0.5ul ；回收产物3ul ；T4 连接酶0.5ul ；去离子水Iul_总体积IOulB、转化过程取5ul连接产物转化到DH5 α感受态细胞(天根公司)，具体操作如下(冰上操 作)①取一管(IOOul) DH5 α感受态细胞，冰水浴溶解后取50ul，加入1.5ml离心管 中，在加入5ul连接产物，用移液枪头轻轻吹打几下混勻，冰水浴30分钟；②将混合液42°C热激90秒(此过程需要严格操作，不要摇动离心管)，迅速冰 水浴15分钟；③再向离心管中加950ulLB液体基(不含氨苄青霉素)，混勻后转入IOml的灭 菌玻璃小试管中，于37°C摇床上培养45分钟(150转/分钟)，复苏菌液；④将培养液再转入1.5ml离心管中，8000转/分钟离心30秒；⑤弃上清，余留200ul，并用移液枪头吹打混勻菌液；⑥取IOOul菌液，用三角玻璃棒涂布于已经制好的固体培养基上(含有IOOmg/ml的氨苄青霉素钠、20mg/ml X-GAL和24mg/ml I100mg/ml PTG)，37°C培养箱中培养 12到 16小时。⑦通过蓝白斑筛选，灭菌牙签挑选白色的阳性克隆，在新的固体培养基上划 线，进行二次扩大培养，于37°C培养箱中培养8小时即可。同时挑选一个蓝斑进行培养 作对照。用灭菌牙签挑取二次培养过的白色单菌落，分别接种于装有5mlLB液体培养 基的灭菌玻璃试管中，含有60ug/ml的氨苄青霉素，37°C剧烈振荡培养过夜(12 16小 时)。C、质粒DNA的提取使用质粒小提试剂盒(天根)提取菌液的质粒DNA，具体步骤如下①将菌液离心，聚集沉淀，13000转/分钟离心30秒，②向沉淀中加入250ulPl溶液，用移液枪头轻轻吹打，使沉淀重悬于液体之 中；③再液体中加入250U1P2溶液，上下温和旋转离心管6到10次，裂解菌液；④再液体中加入350ulP3溶液，立即混勻，上下翻转离心管6到10次；⑤12000转/分钟离心1分钟，为了沉淀完全，可以进行二次离心。⑥向CB3柱子中加入500ul的平衡液BL，12000转/分钟离心1分钟，待用。⑦将(5)中上层清液转入处理好的CB3柱子中，静置2分钟，12000转/分钟离 心50秒；⑧向CB3柱子中加入700ul的PW，12000转/分钟离心50秒；⑨向CB3柱子中加入500ul的PW，12000转/分钟离心50秒；⑩向CB3柱子的底膜中央加60ulEB洗脱液，静置2分钟，12000转/分钟离心 2分钟，-20°C保存。D、质粒DNA的酶切鉴定取IOul质粒DNA进行双酶切鉴定，方法如下①酶切体系如下质粒DNA IOulIOXBuffer 2ulEcoRI IulDEPC 水 7ul_共计20ul②混合均勻，旋混几秒钟；③37°C水浴2个小时。④取5ul产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
2.6用TRIZOL试剂盒提取总RNA1)勻浆在Iml的TRIZOL试剂中加50-1 OOmg组织，样本体积不应超过TRIZOL的 10%。用勻浆机高速勻浆2分钟。2)(可选)
要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、脂肪组织，在勻浆后 2-80C 12000g离心10分钟。将上清勻转移至一新的Eppendof管。3)分相15-30°C温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。力口 0.2ml氯仿，用力摇动15秒， 15-30°C放置2-3分钟。小于12000g 2_8°C离心15分钟。4) RNA 的沉淀转移水相于一新管。加0.5ml异丙醇，混勻，室温放置10分钟。4_8°C 12000g 离心10分钟(离心前RNA通常不可见，在管壁或管底形成胶样沉淀)。5) RNA沉淀的洗涤弃上清，每Iml TRIZOL至少加Iml 75%的乙醇洗涤RNA—次。 2_8°C小于 7500g离心5分钟。6) RNA 的重溶倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥5-10分钟。加适当的DEPC处理水，吸打几 次，放于55-60°C溶解10分钟。-70°C保存。7) RNA变性电泳在一灭菌微量离心管中混合下列液体，以制备RNA样品。
权利要求
1.一种鸡脂肪候选基因Lpin2基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
2.根据权利要求1所述的鸡脂肪候选基因Lpin2基因，其特征在于该基因的氨基酸 序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述的鸡脂肪候选基因Lpin2基因的应用方法，其特征在于采用 上述鸡脂肪候选基因Lpin2基因序列，与鸡基因组序列比对，针对存在的变异，采用 PCR-RFLP法，对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用MspI酶进行单核苷酸多态性检 测。
4.根据权利要求3所述鸡脂肪候选基因Lpin2基因的应用方法，其特征在于采 用上述鸡脂肪候选基因Lpin2基因序列，与鸡基因组序列比对，针对存在的变异，采用 PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用MspI酶进行单核苷酸 多态性检测，正向5' CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5' TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘。检测出鸡候选基因Lpin2的G444A是G还是A，G等位基因可被MSPI酶切产生一 个268和25碱基的片段；A等位基因不能被MSPI酶切；AA纯合子只产生一个386的片 段；GG纯合子将产生227和149碱基的片段；GA杂合子将产生386、227和149碱基三 种片段。
全文摘要
鸡脂肪候选基因Lpin2基因及功能突变检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的鸡脂肪候选基因lpin2基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。鸡脂肪候选基因功能突变检测方法采用上述鸡脂肪候选基因lpin2基因序列，与鸡基因组序列比对，针对存在的变异，采用PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用MspI酶进行单核苷酸多态性检测，正向5′CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3′，反向5′TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3′。本发明巧妙地利用创造酶切位点PCR-RFLP法检测SNPs，发现了影响鸡生长及屠体性状的功能基因和特异性突变位点。采用标记辅助选择选择是一大发展趋势。
文档编号C12N15/12GK102021174SQ20101026482
公开日2011年4月20日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者孙桂荣, 康相涛, 王彦彬, 田亚东, 陈文 , 韩瑞丽, 黄艳群 申请人:黄艳群