专利名称：产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用。所得到的功 能性工程乳酸菌菌株可用于生产类黄酮物质，而且该菌株在食品业具有巨大的潜在市场、 经济效益和社会效益。
背景技术：
类黄酮(Flavonoids)是一组广泛存在于植物中的多酚类物质，属于次级代谢产 物，是存在于植物的叶、花、果中的天然色素，因多呈黄色而被称为类黄酮。类黄酮物质由于 其重要的生理功能，尤其是清除自由基及抗癌防癌等作用，而在医药、食品等领域具有广阔 的应用前景。然而，类黄酮在植物中的含量很低，其提取成本高，得率低；利用化学方法人 工合成的类黄酮是两种异构体的混合物，然而只有(2S)-类黄酮才具有生物活性；通过植 物细胞培养或植物基因工程合成类黄酮也受产量低、成本高、不易大规模培养等限制。近年 来，利用微生物发酵的方法合成类黄酮化合物迅速兴起。微生物生长快、易培养，基因工程 技术的便捷有效等等都是无与伦比的优势。在微生物中构建类黄酮生物合成途径并进行发 酵，有望实现类黄酮的大规模、工业化生产。目前构建类黄酮生物合成途径的主要宿主是大 肠杆菌和酿酒酵母，而乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)作为一种生物发酵细菌，也是一种 重要的益生菌(Probiotics)，其生物技术修饰是未来研究的重点之一，通过基因工程改造 可以赋予乳酸菌更多的生理功能。将植物类黄酮合成途径关键基因重组到乳酸菌中，构建类黄酮合成的基因工 程乳酸菌，把类黄酮的生理功能特性和乳酸菌的益生功效结合起来，促进乳酸菌在功 能性食品研究和开发中的应用。植物类黄酮合成途径关键酶主要包括苯丙氨酸解氨 酶(Phenylalanine aminolyase, PAL)、4_ 香豆酸-辅酶 A 连接酶(p-coumarinic acid CoA ligase，4CL)、查耳酮合成酶(Chalcone synthetase, CHS)、查耳酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)等，国外学者一般将来源于微生物的PAL和4CL基因，来源于植物CHS和 CHI基因通过合适的酶切位点连接成多顺反子结构，通过载体构建组装到大肠杆菌、酿酒酵 母以及委内瑞拉链霉菌等微生物中。尚未见将完全来源于植物的类黄酮合成途径关键酶基 因重组到乳酸菌中的报道。乳酸菌作为一种重要的益生菌，其基因工程改造可以赋予乳酸 菌更多的生理功能。本发明所得到的基因工程乳酸菌可以携带类黄酮功能因子，其制品复 合了类黄酮功能因子和乳酸菌本生的益生功效，增强乳酸菌的利用价值。本发明的乳酸菌 给食品工业和乳品工业提供全新的功能菌株，拓宽功能食品因子的摄取渠道。本产品的主 要受益人群是老人、癌症易发人群、高血压高血脂人群等。产品形式为强化活性菌株、强化 酸乳和发酵乳制品，以及纯化的生物合成大豆异黄酮纯品。在食品业具有巨大的潜在市场、 经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌。所得到的功
4能性工程乳酸菌菌株可用于生产类黄酮物质，此外，乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)也是 一种重要的益生菌(Probiotics)，通过基因工程改造的工程乳酸菌具有更多的生理功能。本发明的第二个目的在于提供上述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的构 建方法。本发明的第三个目的在于提供上述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的应用。本发明所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，是将来源于植物的合成类黄 酮相关酶的编码基因导入到乳酸菌中而获得的重组菌，所述合成类黄酮相关酶为苯丙氨酸 转氨酶(Phenylalanine aminolyase, PAL)、4_ 香豆酸辅酶 A 连接酶(p-coumarinic acid CoA ligase，4CL)、查耳酮合成酶(Chalcone synthetase,CHS)和查耳酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)。所述工程乳酸菌的原始乳酸菌株为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus Iactis subsp. Cremoris)MG1363。所述合成类黄酮相关酶的编码基因组成多顺反子，四种结构基因的顺序为 PAL-4CL-CHS-CHI。携带合成类黄酮相关酶编码基因的表达载体为pMG26e。所述苯丙氨酸转氨酶的编码基因如SEQ ID No. 1所示；所述4_香豆酸辅酶A连接 酶的编码基因如SEQ ID No. 2所示；所述查耳酮合成酶的编码基因如SEQ ID No. 3所示；所 述查耳酮异构酶的编码基因如SEQ ID No. 4所示。所述工程乳酸菌优选为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. CremoriS)MG1363-4GS，已于2010年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 4086。其基本形态为球状，菌落呈乳白色，表面湿 润。该菌株可利用MRS或M17培养基培养，pH为6. 8-7. 0，生长温度为30°C -37°C。上述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的构建方法，以预处理的大豆幼叶为 材料，通过RT-PCR方法获得目标基因PAL、4CL、CHS和CHI，再通过合适的酶切位点将目标 基因有序地连接成多顺反子结构，整合到乳酸菌表达载体上，通过电击转化方法将重组质 粒载体导入到乳酸菌受体细胞，得到本发明的工程乳酸菌。具体包括如下操作步骤(1)以紫外线诱导过的大豆幼叶为原料提取总RNA，然后利用反转录酶将其反转 录成cDNA文库；(2)根据GeneBank公布的大豆苯丙氨酸转氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮 合成酶和查耳酮异构酶的编码基因序列分别设计特异引物，再以大豆的cDNA文库为模板， 采用PCR方法分别扩增大豆的苯丙氨酸转氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成酶和查 耳酮异构酶的编码基因；(3)用SacI和HindIII双酶切表达载体pMG36e，然后将酶切产物与如SEQID No. 5 所示核苷酸序列在T4连接酶的作用下相连接，连接产物称为表达载体pMG26e ；SEQ ID No. 5如下，5’和3’端为粘性末端CaatcRatactRCaRRCRRCCRCtctaRaRtcRacRcatRCRRatcctCRaRaCRCRtatcRaRttaRctatRacRtccRCCRRCRaRatctcaRctRCRtacRcctaRRaRctctRCRcattcRaSac I Cla INot I Xba IXho IHind III
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(4)采用限制性内切酶切割表达载体pMG26e以及步骤(2)扩增得到的苯丙氨酸转 氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成酶和查耳酮异构酶的编码基因，然后将四种目的 基因插入到表达载体pMG26e中，从而得到重组载体pMG26e-4GS ；(5)利用电击转化方法将重组载体pMG26e_4GS导入到受体细胞乳酸乳球菌乳脂 亚种(Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363中，将重组菌置于高渗培养基中复苏 培养2h后均勻涂布于红霉素抗性的MRS平板上，37°C培养2-3天，然后通过菌落PCR和提 取质粒的方法筛选和鉴定重组菌株，从而得到产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌；所 述高渗培养基为含有0. 3M蔗糖和0. I^gCl2的MRS培养基。所述大豆幼叶的预处理为在紫外照射下间歇生长一周。步骤(2)中用于扩增编码苯丙氨酸转氨酶基因的上下游引物的核苷酸序列分别 如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；用于扩增编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因的上下游 引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；用于扩增编码查耳酮合成酶 基因的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 10和SEQ ID No. 11所示；用于扩增编 码查耳酮异构酶基因的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13所
7J\ ο步骤(4)中编码合成类黄酮相关酶的四种目的基因插入到表达载体pMG26e上的 具体方法如下(a)用BamHI和XhoI双酶切重组载体pMD19_CHS和pMD19_CHI，经连接、转化、筛 选和酶切鉴定得到重组载体pMD 19-CHS-CHI ；用BamHI和NotI双酶切重组载体pMD19_PAL 和pMD19-4CL，经连接、转化、筛选和酶切鉴定得到重组载体pMD19-PAL-4CL ；(b)用XbaI和XhoI双酶切重组载体pMD19-CHS_CHI和表达载体pMG26e，经连接、 转化、筛选和酶切鉴定得到重组载体pMG26e-CHS-CHI ；(c)用 ClaI 和 NotI 双酶切重组载体pMD19_PAL_4CL和重组载体 pMG26e-CHS_CHI， 经连接、转化、筛选和酶切鉴定得到重组载体pMG26e-4GS。上述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌在生产类黄酮上的应用。该重组菌能 够以苯丙氨酸、酪氨酸等为底物发酵合成柚皮素、甘草素、松属素等类黄酮物质。具体发酵 方法为将工程乳酸菌按Iwt %的接种量接种于50mlMRS液体培养基(含5 μ g/ml红霉素) 中，然后向培养基中添加苯丙氨酸和/或酪氨酸，使其终浓度为500mg/L，37°C生长48h， 离心取培养基上清，以等体积乙酸乙酯萃取，取有机相，以旋转蒸发仪干燥，残留物溶解于 2. Oml无水甲醇，所得到的即为类黄酮粗品溶液。柚皮素、甘草素和松属素的结构如下柚皮素(Naringenin)的化学名称为4'，5，7_三羟基黄酮；英文名4 ‘，5， 7-Trihydroxyflavanone,别名4, 5, 7-TrihydroxyfIavone ；Naringenin ；分子式C15H1205, 分子量272. 25 ；CAS号:480_41_1，其结构式为
权利要求
产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，是将来源于植物的合成类黄酮相关酶的编码基因导入到乳酸菌中而获得的重组菌，所述合成类黄酮相关酶为苯丙氨酸转氨酶、4 香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成酶和查耳酮异构酶。
2.根据权利要求1所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述工 程乳酸菌的原始乳酸菌株为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. Cremoris) MG1363。
3.根据权利要求1所述重组植物类黄酮合成酶编码基因的工程乳酸菌，其特征在于， 所述合成类黄酮相关酶的编码基因组成多顺反子。
4.根据权利要求1所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，其特征在于，携带合 成类黄酮相关酶编码基因的表达载体为pMG26e。
5.根据权利要求1所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述苯 丙氨酸转氨酶的编码基因如SEQ ID No. 1所示；所述4-香豆酸辅酶A连接酶的编码基因如 SEQ ID No. 2所示；所述查耳酮合成酶的编码基因如SEQ IDNo. 3所示；所述查耳酮异构酶 的编码基因如SEQ ID No. 4所示。
6.根据权利要求1所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述工 程乳酸菌为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363-4GS，其 保藏编号为CGMCC No. 4086。
7.权利要求1所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的构建方法，其特征在于， 包括如下操作步骤(1)以紫外线诱导过的大豆幼芽为原料提取总RNA，然后利用反转录酶将其反转录成 cDNA文库；(2)根据GeneBank公布的大豆苯丙氨酸转氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成 酶和查耳酮异构酶的编码基因序列分别设计特异引物，再以大豆的cDNA文库为模板，采用 PCR方法分别扩增大豆的苯丙氨酸转氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成酶和查耳酮 异构酶的编码基因；(3)用SacI和HindIII双酶切表达载体pMG36e，然后将酶切产物与如SEQIDNo. 5所 示核苷酸序列在T4连接酶的作用下相连接，连接产物称为表达载体pMG26e ；(4)采用限制性内切酶切割表达载体pMG26e以及步骤(2)扩增得到的苯丙氨酸转氨 酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、查耳酮合成酶和查耳酮异构酶的编码基因，然后将四种目的基 因插入到表达载体pMG26e中，从而得到重组载体pMG26e-4GS ；(5)利用电击转化方法将重组载体pMG26e-4GS导入到受体细胞乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363中，将重组菌置于高渗培养基中复苏培养 2h后均勻涂布于红霉素抗性的MRS平板上，37°C培养2-3天，然后通过菌落PCR和提取质粒 的方法筛选和鉴定重组菌株，从而得到产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌；所述高渗 培养基为含有0. 3M蔗糖和0. I^gCl2的MRS培养基。
8.根据权利要求7所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的构建方法，其特征在 于，步骤(2)中用于扩增编码苯丙氨酸转氨酶基因的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；用于扩增编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因的上下游引物的 核苷酸序列分别如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；用于扩增编码查耳酮合成酶基因的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No. 10和SEQ ID No. 11所示；用于扩增编码查耳酮 异构酶基因的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13所示。
9.根据权利要求7所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌的构建方法，其特征在 于，步骤(4)中编码合成类黄酮相关酶的四种目的基因插入到表达载体pMG26e上的具体方 法如下(a)用BamHI和XhoI双酶切重组载体pMD19_CHS和pMD19_CHI，经连接、转化、筛选和 酶切鉴定得到重组载体PMD19-CHS-CHI ；用BamHI和NotI双酶切重组载体pMD19_PAL和 PMD19-4CL，经连接、转化、筛选和酶切鉴定得到重组载体pMD19-PAL-4CL ；(b)用XbaI和XhoI双酶切重组载体pMD19-CHS-CHI和表达载体pMG26e，经连接、转化、 筛选和酶切鉴定得到重组载体pMG26e-CHS-CHI ；(c)用ClaI和NotI双酶切重组载体pMD19-PAL-4CL和重组载体pMG26e-CHS_CHI，经 连接、转化、筛选和酶切鉴定得到重组载体pMG26e-4GS。
10.权利要求1-6任一所述产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌在生产类黄酮中的 应用。
全文摘要
本发明公开了属于基因工程改造乳酸菌领域的产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用。该工程乳酸菌是将完全来自于我国本土栽培大豆(Glycine max(L.)Merr.)的类黄酮合成途径相关酶基因PAL、4CL、CHS和CHI连接成多顺反子结构PAL-4CL-CHS-CHI，构建到经改造的乳酸菌表达载体pMG26e上，形成重组载体pMG26e-4GS，再将pMG26e-4GS电击转化到乳酸菌中，得到产植物类黄酮合成相关酶的基因工程乳酸菌。该重组菌保藏号为CGMCC No.4086，较原始乳酸菌具有更加丰富的生理功能，可直接应用于食品领域，本发明所得到的重组菌株经发酵，类黄酮产量在mg/l水平，高于同类重组大肠杆菌和重组酵母菌发酵的水平。
文档编号C12N15/63GK101948794SQ20101027299
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者卢晓明, 左芳雷, 李平兰, 赵建云, 郑超, 郝彦玲, 陈尚武, 马会勤 申请人:中国农业大学