专利名称：：来自葡萄酒发酵醪液的具有免疫调节作用的乳酸菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有免疫调节作用的乳杆菌属菌、含有该菌的组合物及具有免疫调节作用的乳酸菌的高效分离方法。
背景技术：
：已知乳酸菌具有整肠作用、免疫赋活作用等有益的生理活性，且是具有健康功能的原材料，所以一般消费者对其的认知度也很高。此种具有有益生理活性的乳酸菌的大多数是从发酵乳制品、肠道分离的来自动物原材料的乳酸菌。另外，在以植物原材料为分离源的植物性乳酸菌中也发现了具有免疫赋活作用的菌株。例如，日本特开平10-167972号公报(公开日平成10年6月23日)中记载了具有免疫赋活作用的乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarnm)L-137株。且已知从京都传统的腌菜类"酸萝卜咸菜"(日语原名「t〈"务」)中分离的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)Labre株，从"紫苏淹"(日语原名「^tf漬tt」)中分离的戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)DA74N株等也具有免疫赋活作用[参照(l)日本特公平7-55908号公报(公开日平成6年7月26日)，(2)PaskenJournal15.21-26，2002，岸惇子、小久保A0I(日语原名Afcl0、赤谷薰、扇谷ERI子(日语原名i。子)、藤田哲也、岸田纲太郎用于有用乳酸菌选定的筛选1)(日语原名有用乳酸菌選定O&&o^夕V—二>夕"l))人体末梢血液中植物性乳酸菌的体外(invitro)免疫赋活作用，(3)第6次肠内细菌学会(2002.05.30-31)要旨，赤谷薰、岸惇子、扇谷ERI子(日语原名AQ子)、小久保A0I(日语原名A於^)、藤田哲也、岸田纲太郎)]。已知以植物原材料为分离源的植物性乳酸菌与腌菜类、酒类的酿造有密切的关系，可从酿造工序中分离大量的菌。除上述以外，还存在具有免疫赋活作用等有价值的生理活性的菌株，例如，从酒类酿造工序的葡萄酒酿造工序中分离的、分离频率高的菌株中可列举植物乳杆菌。但是，对于该种从酒类酿造工序中分离的菌，主要进行的研究是有关其在酿造过程中的作用、其对香味等所起的作用，对于菌本身对生物体所产生的作用基本未加以研究。因此，希望从酒类酿造工序中分离的乳酸菌中找到具有有价值的生理活性的菌株。此外，使用植物性乳酸菌时有时会产生独特的发酵味，所以根据制造的食品种类，有时需考虑感官方面的问题。
发明内容本发明鉴于上述现状，以提供具有免疫调节作用的乳酸菌、含有该菌的组合物及分离具有免疫调节作用的乳酸菌的方法为目的。本发明者为解决所涉及的课题，对于从酒类酿造工序的产物中分离的乳酸菌测定了其免疫调节作用，对于从其中选择的属于植物乳杆菌及短乳杆菌的乳酸菌，更加详细地测定了其免疫调节作用。其结果发现，该乳酸菌具有强免疫调节作用，且使用该乳酸菌的发酵产物呈现出良好的香味，从而完成了本发明。具体地说，对于从酒类酿造工序的产物中分离的乳酸菌来说，Thl型细胞因子白细胞介素12(以下简写为"IL-12")诱导能力的比较结果，发现可高效分离具有免疫调节作用的乳酸菌，特别是还发现了用属于植物乳杆菌及短乳杆菌的菌株对由小鼠制备的腹腔巨噬细胞进行体外处理时，可使IL-12的产生增加。且还证实了向小鼠腹腔内进行加热菌液的体内给药，也可诱导Thl型细胞因子IL-12的产生。即本发明涉及酒类制造工序中的含有微生物的成分中所含有的具有免疫调节作用的乳杆菌属菌，特别是含有微生物的成分是发酵醪液，酒类制造工序是葡萄酒的酿造工序。此外，本发明涉及具有免疫调节作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。且本发明中，具有免疫调节作用的植物乳杆菌是植物乳杆菌SAM2446株(FERMABP-10438)或短乳杆菌是短乳杆菌SAM2447株(FERMABP_10439)。本发明还涉及具有免疫调节作用的组合物，其含有酒类制造工序中的含有微生物的成分中所含有的具有免疫调节作用的乳杆菌属菌。特别是所述组合物是饮食品或医药品。本发明还进一步涉及分离具有免疫调节作用的乳酸菌的方法，其包括从酒类制造工序中的含有微生物的成分中分离微生物的工序、测定所分离的各微生物的免疫调节作用的工序及筛选免疫调节作用强的乳酸菌的工序。特别是含有微生物的成分是发酵醪液，酒类制造工序是葡萄酒的酿造工序。图1表示测定将12种乳酸菌向小鼠腹腔内给药后血清IL一12浓度的结果。图2表示经解读的SAM2446株的16SrRNA基因序列。下线部表示与植物乳杆菌JCM1149T(ATCC14917)的序列不同的部分。图3表示经解读的S旭2447株的16SrRNA基因序列。下线部表示与短乳杆菌JCM1059T(ATCC14869)的序列不同的部分。图4表示M活性的测定结果。图5表示IFN-Y浓度的测定结果。具体实施例方式<乳杆菌属菌>乳杆菌属菌是乳酸菌的一种，本发明涉及酒类制造工序中的含有微生物的成分中所含有的具有免疫调节作用的乳杆菌属菌。乳杆菌属菌优选属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或短孚L杆菌(Lactobacillusbrevis)的孚L杆菌属菌。乳杆菌属菌的菌学性质如《伯杰氏系统细菌学手册》(BERGEY'SMANUALofSystematicBacteriology)(第1巻1984年、第2巻1986年、第3巻1989年、第4巻1989年)中所记载。本发明涉及的乳酸菌的代表菌可为植物乳杆菌S細2446株及短乳杆菌SAM2447株。本菌保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，其保藏号为FERMABP-10438及FERMABP-10439。植物乳杆菌SAM2446株(FERMABP-10438)的菌学性质如表1所示，短乳杆菌SAM2447株(FERMABP-10439)的菌学性质如表2所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明的乳杆菌属菌，可通过从酒类制造工序中的含有微生物的成分中分离微生物、测定所分离的各微生物的免疫调节作用、筛选免疫调节作用强的菌来获得。本发明中，"酒类制造工序"是指与酒类制造有关的一系列工序。在此，"酒类"中也包括葡萄酒等的果实酒，啤酒、发泡酒等的麦芽发酵饮料，清酒、威士忌等的蒸馏酒等。含有微生物的成分是指在酒类制造工序中存在有微生物的成分，例如，下料的原料、发酵醪等。<组合物>本发明涉及的乳杆菌属菌，可作为含有该乳杆菌属菌的组合物利用。特别是优选作为具有免疫调节作用的药学组合物利用。上述组合物中所含有的乳杆菌属菌，可为乳杆菌属菌(活菌及死菌)、乳杆菌属菌含有物、乳杆菌属菌发酵物、乳杆菌属菌处理物等。活菌可从该乳杆菌属菌培养液等的乳杆菌属菌含有物中获得。死菌，例如可通过对活菌进行加热、紫外线照射、福尔马林处理等获得。可通过将所得到的活菌、死菌进一步磨碎、破碎等制成处理物。即本发明中利用乳杆菌属菌的含有乳杆菌属菌的组合物，可含有本发明涉及的乳杆菌属菌、该乳杆菌属菌含有物、该乳杆菌属菌发酵物、该乳杆菌属菌处理物中的至少任意一种。所述乳杆菌属菌含有物，例如可为乳杆菌属菌悬浮液、乳杆菌属菌培养物(包括菌体、培养上清、培养基成分)、乳杆菌属菌培养液(从菌培养物中除去固体成分后的产物)、乳杆菌属菌发酵乳(乳杆菌属菌饮料、酸乳、酸奶等)。用于培养属于乳杆菌属的微生物的培养基，只要是属于乳杆菌属的微生物可生长发育的培养基，无特别限制，均可使用。且乳杆菌属菌处理物，例如可为磨碎物、破碎物、液状物(提取液等)、浓缩物、糊状物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等)、稀释物等。此外，因本发明涉及的植物乳杆菌SAM2446株及短乳杆菌SAM2447株是从葡萄酒酿造工序中分离的，所以，例如含有通过本发明涉及的乳杆菌属菌使果菜类、谷类发酵的发酵产物的物质，也作为本发明中利用乳杆菌属菌的含有乳酸菌的组合物的一种优选方式。且如上所述，本发明涉及的乳杆菌属菌原本就是从食品中分离的，所以安全性高。本发明中利用乳杆菌属菌的含有乳杆菌属菌的组合物，优选作为具有免疫调节作用的药学组合物使用。例如可为饮食品、医药品、词料等。用于饮食品时，可优选作为具有免疫调节作用的健康食品实施。且可混合公知的甜味剂、酸味剂、维生素等的各种成分制成适合用户嗜好的产品。例如，可以片剂、胶囊剂、保健营养液、含片、口香糖、酸奶等的乳制品、冰淇淋、饮料、酒精饮料、调味料、加工食品、甜点类、点心等的形态提供。用于医药品时，可在主药中使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、包衣材料等医药制剂
技术领域：
中通常使用的公知辅助剂进行制剂化。剂型可为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等，无特别限定。本医药品的给药途径，例如可为经口给药、直肠给药、经肠给药等，但无特别限定。用于饲料时，例如可于宠物食品或家畜用饲料等原料中混合菌体，或也可添加于市售的动物用饲料中。其中，可优选用于狗、猫或鸡等禽类等的食佴中。<具有免疫调节作用的乳酸菌的分离方法〉免疫调节作用的测定可使用本领域技术人员周知的方法中的任一种方法。例如，Thl型细胞因子白细胞介素12(以下简写为"IL-12")诱导能力试验中，对由小鼠制备的腹腔巨噬细胞通过体外处理测定IL-12的产生量。免疫调节作用强的乳酸菌的筛选，可通过上述免疫调节作用的测定，通过筛选免疫调节作用强的菌株来进行。筛选的标准，可进行与具有公知免疫调节作用的乳酸菌比较、与对照比较或与平均值比较等适当设定。此外，除免疫调节作用外，还可将在一般的乳酸菌用培养基中是否显示良好增殖添加到筛选标准中。本发明中，"酒类制造工序"是指与酒类制造有关的一系列工序。在此，"酒类"中也包括葡萄酒等的果实酒，啤酒、发泡酒等的麦芽发酵饮料，清酒威士忌等的蒸馏酒等。含有微生物的成分是指在酒类制造工序中存在有微生物的成分，例如为下料原料、发酵醪等。作为分离源，通过使用上述葡萄酒酿造工序中的发酵醪液等，可极高效地分离具有免疫调节作用的乳酸菌。通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于上述各实施方式，在权利要求所示范围内可进行种种变更，对于根据不同的实施方式适当组合分别公开的技术手段后所得到的实施方式，也包含于本发明的技术范围。实施例实施例1〔使用乳酸菌株〕为选择Thl型免疫赋活能力强的菌株，将从葡萄酒酿造醪中分离的104株乳酸菌用于白细胞介素12(IL-12)诱导能力的比较实验中。〔体外剌激的IL-12诱导〕对BALB/c小鼠(7周龄.雄性)，将4.05%硫乙醇酸钠进行腹腔内给药，4天后使用PBS回收腹腔内巨噬细胞，使用含有10%FBS的RPMI培养基调整到2X106cells/mL后，在24孔(well)板中按每孔0.5mL加入。在各孔中添加各菌株的加热死菌(lug/mL)，测定培养24小时后的培养上清中的IL-12浓度。对照中不添加死菌。因IL-12的活性型是p35和p40的亚单位结合后的p70，所以测定IL-12(p70)。且IL-12的测定中使用OptEIAmouseIL-12测定试剂盒(BDPharmingen公司制)评价分离的104株乳酸菌的体外IL-12产生能力的结果，发现大量含有具有IL-12产生能力的菌株。其中一些菌株的IL-12产生能力即使与已知具有免疫调节作用的乳酸菌相比也具有非常高的活性。其中，具有超出对照10倍的IL-12产生能力菌株有12株，所以可作为具有高IL-12产生能力的菌株进行选择。考虑到超出对照10倍的这种极高的标准，认为这种概率为相当高的值，所以，认为葡萄酒酿造醪作为免疫调节乳酸菌的分离源非常有利用价值。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*1:相对于对照的各样品的IL-12产生量*2:后述的SAM2446株(FERMABP-10438)承3:后述的SAM2447株(FERMABP-10439)实施例2(使用乳酸菌株〕将实施例1中选择的乳酸菌12株用于体内刺激IL-12诱导能力的比较实验。〔体内刺激的IL-12诱导〕对BALB/c小鼠(7周龄，雄性)，将上述各菌株的加热死菌(500ug/0.2mL/mouse)悬浮液(溶剂生理食盐水)进行腹腔内给药，6小时后颈椎脱臼后，从心脏采血。对于对照的小鼠等量投给生理食盐水。采血后，通过离心分离采取血清，使用OptEIAmouseIL-12测定试剂盒(BDPharmingen公司制)测定血清中的IL-12浓度。结果如图l所示。血清IL-12浓度在A株和L株中特别高。因此，将其分别命名为SAM2446株、SAM2447株。实施例3SAM2446株、SAM2447株的鉴定SAM2446株的菌学性质的研究结果如表1所示，SAM2447株的菌学性质的研究结果如表2所示。通过这些研究结果，推测出SAM2446株是植物乳杆菌，SAM2447株是短乳杆菌。已知植物乳杆菌有具有山梨醇同化性和不具有山梨醇同化性的两种，如表1所示，SAM2446株是具有山梨醇同化性的乳酸菌种。且已知短乳杆菌有具有D-木糖同化性和不具有D-木糖同化性的两种，如表2所示，SAM2447株是不具有D-木糖同化性的乳酸菌种。从SAM2446株及SAM2447株中提取DNA后，对16SrRNA基因区域进行解读。因经解读的S雄2446株的16Sr頭A基因序列(序列号1)具有与植物乳杆菌JCM1149T(ATCC14917)的16SrRNA基因序列99%的同源性，所以鉴定为植物乳杆菌(图2)。且SAM2447株的16SrRNA基因序列(序列号2)具有与短乳杆菌JCM1059T(ATCC14869)的16SrRNA基因序列97%的同源性，所以鉴定为短乳杆菌(图3)。实施例4经口摄取的免疫赋活及免疫调节作用对C57BL/6小鼠[日本CharlesRiver株式会社(日语原名日本f"^一》又''J"'一株式会社)、7周龄"雄性、1组4只]，使其以饮水(相当于0.2mg/day)的方式自由摄取1周SAM2446株、S細2447株(死菌体)。并设置不摄取SAM2446株、SAM2447株的对照组。l周后摘出脾脏。根据通常方法，用摘出的脾脏制备脾细胞，测定M活性和细胞因子产生能力。NK活性的测定，是将脾细胞和靶细胞Yac-l以200:1或100:1的比例共培养4小时，再使用流式细胞仪用PINK法测定脾细胞的细胞毒活性。且使刀豆素A(NacalaiTesque)2.5mg/mL与脾细胞(5X106个/mL)作用24小时，用ELISA法[OptEIA(BDBioScience)]测定培养上清中产生的IFN-y浓度。NK活性的测定结果如图4所示。图4中，NK活性(%)表示对小鼠脾细胞Yac-l的细胞毒性，E:T比表示反应的脾细胞数:Yac-l数。从图4可说明，与对照组(control)相比，由经口摄取了SAM2446株、SAM2447株的小鼠制备的脾细胞的NK活性显著提高。IFN-y浓度的测定结果如图5所示。从图5可说明，与对照组(control)相比，由经口摄取了SAM2446株、SAM2447株的小鼠制备的脾细胞的IFN-y浓度显著增加。如上所述，在经口摄取了SAM2446株、SAM2447株的小鼠中NK活性增加，促进了Thl型细胞因子IFN-Y的产生。因此，证明SAM2446株、SAM2447株具有免疫赋活作用及具有免疫调节作用。实施例5豆乳发酵物的制造将SAM2446株发酵菌液以不受其他微生物污染为条件添加于市售的豆乳中，3(TC静置24小时获得豆乳发酵物。发酵迅速进行，可发现酸度提高及pH值降低。所得到的发酵物与以往的植物发酵品相比未呈现不愉快的发酵味等，而呈现出感官上优异的香味。实施例6添加乳酸菌末的豆乳的制造将SAM2447株发酵菌液加热杀菌后，通过离心分离(3000rpm、IO分钟)回收菌体，所得到的菌体进行冷冻干燥。将该乳酸菌菌体末在市售的豆乳中添力口-搅拌，使其悬浮溶解于豆乳中，所得到添加乳酸菌末的豆乳与以往的含有乳酸菌的发酵食品相比，未呈现不愉快发酵味等，而呈现出感官上优异的香味。实施例7含有乳酸菌的组合物的制造制造例l:含有乳酸菌的医药品片剂通过以下所示方法，制造含有乳酸菌的医药品(片剂)。将50gSAM2446株菌体末与250g乳糖及2g硬脂酸镁一同混合，通过用单冲式压片机压片，制造直径10mm、重量300mg的片剂。颗粒剂在100gSAM2447株菌体末中加入0.5g硬脂酸镁，经压縮、粉碎、整粒、过筛后，得到2050目的颗粒剂。制造例2:含有乳酸菌的各种饮食品用以下所示的组成，制造加入了乳酸菌的各种饮食品。被糖(组成)(重量:份)山梨醇粉末99.7香料0.2SAM2446株菌体末0.05山梨醇晶种(sorbitolseed)0,05，/100.00果冻(咖啡果冻)(组成)(重量份)精制白砂糖15.0明胶1.0咖啡提取物5.0水78.93SAM2447株菌体末_0.07总量100.00果汁:(组成)(重量:份)冷冻浓縮温州蜜桔果汁5.0果糖葡萄糖液糖11.0柠檬酸0,2L-抗坏血酸0.02SAM2446株菌体末0,05香料0.2色素0.1水83.43总量100.00碳酸饮料(组成)(重蓍t份)精制白砂糖8,0浓縮柠檬果汁1.0L-抗坏血酸0.10柠檬酸0.09柠檬酸钠0.05着色料0.05香料0-15碳酸水90.55SAM2447株菌体末0.01，/旦'W、塌100.00表8<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表12发泡酒(组成)发泡酒SAM2447株菌体末总"S(重量份)99.980.02100.0制造例3:含有乳酸菌的词料用如下所示的组成，制造加入了乳酸菌的伺料。表13饲料(组成)(重量份)市售宠物食品99.98SAM2446株菌体末_0，P2总量100.0如摄取本发明的乳杆菌属菌等，则可通过赋活免疫功能来抑制免疫功能下降。且通过调节免疫功能的平衡，可抑制对生物体产生不良影响的免疫功能的过度亢进和由此派生的给生物体带来的各种不良症状等。根据本发明，可高效获得具有免疫调节作用的乳酸菌。权利要求1.具有免疫调节作用的乳杆菌属菌，其含有于葡萄酒酿造工序的发酵醪液中。2.权利要求l中所述的菌，其中，乳杆菌属菌是植物乳杆菌。3.权利要求l中所述的菌，其中，乳杆菌属菌是短乳杆菌。4.权利要求2中所述的菌，其中，植物乳杆菌具有山梨醇同化性。5.权利要求3中所述的菌，其中，短乳杆菌不具有D-木糖同化性。6.权利要求2中所述的菌，其中，植物乳杆菌是植物乳杆菌SAM2446株(FERMABP-10438)。7.权利要求3中所述的菌，其中，短乳杆菌是短乳杆菌SAM2447株(FERMABP-10439)。8.组合物，其含有权利要求17中任一项所述的乳杆菌属菌，具有免疫调节作用。9.权利要求8中所述的组合物，其中，所述组合物是饮食品。10.权利要求8中所述的组合物，其中，所述组合物是医药品。11.权利要求8中所述的组合物，其中，所述组合物是饲料。12.方法，其是分离具有免疫调节作用的乳酸菌的方法，所述方法包括(a)从酒类制造工序中的含有微生物的成分中分离微生物的工序，(b)测定被分离的各微生物的免疫调节作用的工序，及(c)筛选免疫调节作用强的乳酸菌的工序。13.权利要求12中所述的方法，其中，乳酸菌是乳杆菌属菌。14.权利要求12或13中所述的方法，其中，所述含有微生物的成分是发酵醪液。15.权利要求1214中任一项所述的方法，其中，所述酒类制造工序是葡萄酒酿造工序。全文摘要本发明涉及具有免疫调节作用的乳杆菌属菌、含有该菌的组合物及具有免疫调节作用的乳酸菌的高效分离方法。本发明的乳杆菌属菌具有免疫调节作用，如摄取本发明的组合物等，则可通过赋活免疫功能来抑制免疫功能下降。且根据本发明，可高效获得具有免疫调节作用的乳酸菌。文档编号C12R1/25GK101300341SQ20068004062公开日2008年11月5日申请日期2006年10月31日优先权日2005年10月31日发明者山村孝子,芦刈匡子,阿部圭一,饭野妙子申请人:三得利株式会社