专利名称：一种深黄被孢霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高产Y-亚麻酸的深黄被孢霉及其应用。
背景技术：
γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid 或 Gamma-Linolenic acid，简称 GLA)为全顺式 6,9,12-十八碳三烯酸，分子式C18H3tlO2,是一种ω -6系列多不饱和脂肪酸，为无色油状液 体，在空气中极易氧化。它是人体的一种必需脂肪酸，在人体内由亚油酸转化而来，继而被 转化为双高亚麻酸(Dihomo-Y-Linolenic acid，DGLA)及花生四烯酸(Arachidonic acid, ARA)，再转变成前列腺素El (PGEl)、白三烯(LT)和前列环素12 (PGI2)。、-亚麻酸具有广 泛的生理活性和明显的药理作用，它可以降血脂，抗血栓性心脑血管疾病，预防和治疗高血 压、动脉粥样硬化。同时又能够抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗HIV感染等，在美容、化妆 品方面也有应用，对月经前期综合症具有一定疗效，被高度评价为“21世纪功能性食品主 角”(单长海，赵丹.四川食品与发酵，2006，(1) :17-20)。1919 年，Hei-duschka 首次从柳叶菜科(Evening Primrose Flamily)植物月 见草中发现Y-亚麻酸(吴广礼，王喜君，李君，等.农业与技术，1994，(3) 19-22) 0目 前已知有80多种高等植物种子油脂中含有一定量的Y -亚麻酸，其中含量较高的有月见 草、玻璃苣、黑醋栗、蓝蓟、微孔草等(田歆珍，王贤磊，孙桂琳，等.生物技术，2008，18(1) 89-92)。但是从植物中提取Y-亚麻酸受到诸多因素的限制，植物的生长周期长，占地面积 大，且受到自然条件的限制，植物种子的采集比较难，油含量不稳定，难以满足人们日益增 长的需求(海华，尚德静，李庆伟.工业微生物，2002，3 (24) :46-50)。1948年Bernhard和 Albercht (Bernhard K, Albrecht H. Helv Chim Acta，1948，31 (4) :977_988)首先从布拉克 须霉(Phycomyces blakesleeanus)的菌体脂肪中鉴定出Y _亚麻酸，拉开了微生物发酵法 生产Y-亚麻酸的序幕。氏须霉属及后来发现的根霉属、毛霉属、曲霉属、犁头霉属、共头霉 属等具有较强的Y-亚麻酸合成能力。目前研究较多的菌株为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、拉曼被抱霉(Mortierella ramanniana)、矮被抱霉(Mortierella nana)、高 LlJ(Mortierella alpina)、$lji包/]、^;ΙΒ ^β (Cunninghamella echinlata)
霉(Mucor rouxii)等(李忠玲，丘淑宁，王卫卫，等.微生物学杂志，2008，28 (1) :94_97)。 虽然能够产Y "亚麻酸的菌种如此之多，但是近年来对于野生高产菌的筛选鲜有报道，大 多研究都集中在对已有菌种的改造和代谢调控方面，对Y _亚麻酸产量的提高较少，且目 前公开的有关Y-亚麻酸发明专利多为刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinlata)(申 请号为95111964. 8,95119429. 1，200610065889. 7，91106190. 8)，很少涉及其他的菌株，延 缓了 Y-亚麻酸的产业化进程，因此筛选高产Y-亚麻酸的微生物资源利于拓展研究空间， 同时还可以满足Y-亚麻酸产业化的需求，促进工业化进程，具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能发酵生产较高浓度Y-亚麻酸的深黄 被孢霉。本发明还要解决的技术问题是提供上述深黄被孢霉在发酵生产Y-亚麻酸中的 应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种深黄被孢霉是从南京工业大学茶园土壤中筛选得到，菌株代号为ME-L16，其 分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)。目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址武汉 武汉大学；邮编430072 ；登记入册的编号CCTCC NO =M 2010195 ；保藏日期2010年8月4 日。以此菌作为生产菌株。CCTCC NO =M 2010195 的筛选方案如下土壤中的微生物经过初筛，复筛，再筛，最后得到高产GLA菌种。其中初筛平板中 加入了红四氮唑(TTC)，它能被脱氢酶还原成红色，当菌体内的脱氢酶活性高时，就会在短 时间内使菌体呈现红色，红色的深浅可以反映出脱氢酶的活力，而脱氢酶活力越高，不饱和 脂肪酸的含量越高。将变红较早的菌株逐一挑出进一步筛选。复筛的平板中加入了一定浓 度的甘草酸。作为吡啶族类除草剂，甘草酸可以抑制ω-3脂肪酸的脱饱和作用。当ω-3脂 肪酸脱饱和酶受到抑制，代谢流将流向GLA，将会提高GLA的产量，通过筛选甘草酸抗性株 可以获得GLA高产菌株。最后通过发酵法检测产物中GLA的含量，筛选得到高产菌株CCTCC NO :Μ 2010195。本筛选方法中初筛的基本培养基为PDA，其中加入了红四氮唑(终浓度0. 5 2%0 g/L)。本筛选方法中复筛的基本培养基为PDA，其中加入了甘草酸(终浓度0. 5 2%0 g/L)。本筛选方法中发酵法的基本培养基为葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，KH2P043. 5g/ L，MgSO4 · 7H20 lg/L，其余为水，pH 7. 0。CCTCC NO :M 2010195菌株具有下述性质1、形态特征该菌株生长速度快，孢子量多，菌丝生长粗壮。在PDA平板上25°C培养3天，菌落 直径达5厘米，菌丛为灰色。显微镜下观察，菌丝粗壮多分枝，结成网；孢囊梗直接从基质 中分出，孢子囊顶生，球形，无明显的囊轴；包囊孢子单细胞，球形，经鉴定其为深黄被孢霉 (Mortierella isabellina)。2、营养特征培养基为能提供碳源、氮源的常规培养基。培养基中的碳源主要为糖类，其中糖 类为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、半乳糖和糖蜜中的任意 一种或多种的混合物；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为硝酸钾、硝酸 铵、硝酸钠和氯化铵中的任意一种或多种的混合物，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉 米浆、牛肉膏和麦芽浸膏中的任意一种或多种的混合物；无机盐为镁盐、钾盐和钠盐中的任 意一种或多种的混合物。上述高山被孢霉在生产Y-亚麻酸(GLA)中的应用。即将CCTCC NO =M 2010195接种于含有碳源、氮源和无机盐的培养基中，在23°C 30°C、pH5. 5 7. 5条件下，发酵培 养5 8天。其中，优选温度条件为23 °C 28 °C。其中，斜面培养基为PDA培养基，包含如下组分马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼 脂15g/L。配制方法为200g马铃薯去皮，切成块加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加20g 糖及15g琼脂，溶化后补足水至lOOOmL，121°C灭菌30min。其中，摇瓶活化培养基包含如下组分碳源20 40g/L，氮源5 10g/L，无机盐 0. 1 5g/L ；优选包含如下组分葡萄糖20 40g/L，酵母膏5 10g/L，无机盐2 4g/L， 其余为水，PH 6. 0 7. 0 ；最优选包含如下组分葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH2P043g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，其余为水，pH 7. 0o其中，发酵培养基包含下列组分碳源60 120g/L，氮源5 10g/L，无机盐3 10g/L ；优选包含如下组分葡萄糖80 120g/L，酵母膏5 10g/L，无机盐3 8g/L，其 余为水，ρΗ6· 0 7. 0 ；最优选包含如下组分葡萄糖100g/L,酵母膏10g/L, KH2P043g/L, NaN0s3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，其余为水，pH 7. 0o有益效果本发明筛选出的菌株深黄被孢霉ME-L16(CCTCC NO =M 2010195)具有较高的 Y-亚麻酸合成能力，GLA占总脂肪酸的百分比高达20%。其生长范围宽，对营养的要求简 单，可以通过发酵罐扩大培养，生产的菌油GLA含量高，且易于提取，具有很好的发展前景。 不仅为我国GLA生产增加了一个新品种，同时将对我国GLA工业化产生积极的推动作用。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中GLA的分析方法如下色谱条件Thermo Finnigan TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪，采用DB-5MS毛 细管柱(30mX 0. 25mmX0. 25 μ m)。起始柱温 50°C，以 20°C /min 升温到 250°C，保持 2min。 进样温度200°C，载气为氦气，载气流速lml/min，不分流进样。总运行时间为12min。萃取 头在进样口于200°C下脱附5min。质谱检测条件EI源70eV，离子源温度250°C，传输线温度250°C，扫描范围50 400aumo以下实施例中所用培养基的溶剂未明确标示时均采用水作为溶剂。以下实施例中接种量的百分比是指种子液与发酵培养基的体积之比。以下实施例中pH调节方式用lmol/L的硫酸和2mol/L的氢氧化钠调节pH。实施例1 高产GLA菌株的筛选方法。2009年12月24日从南京工业大学茶园地表采集土样，称取3. 0克，90°C烘烤36h， 加入到IOOmL无菌水中制成悬液，再用无菌水进行梯度稀释至10_6，取0. ImL稀释液涂布 于含有一定浓度红四氮唑培养基的平板上，25°C培养观察菌落的颜色变化，依次将变红的 菌落挑出在复筛平板(含一定浓度甘草酸)上划线分离，将能在含甘草酸培养基上生长的 单菌落划线纯化一代，最后摇瓶发酵，检测菌油中GLA的含量(如表1)，筛选得到高产菌株
5ME-L16 ο本筛选方法中初筛的基本培养基为PDA，其中加入了红四氮唑(0. 5-2%。g/L)。本筛选方法中复筛的基本培养基为PDA，其中加入了甘草酸(0. 5-2%。g/L)本筛选方法中发酵法的基本培养基为葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，KH2P043. 5g/ L, MgSO4 · 7H20 lg/Lo表1不同菌种的Y _亚麻酸生产情况
菌株编号干菌体(g/L)总油(％)GLA (%)GLA(g/L)ME-Ll15.324.65.60.211ME-L211.725.56.10.182ME-L320.514.34.20.123ME-L417.216.72.50.072ME-L510.730.25.60.181ME-L65.611.3NGNGME-L715.320.83.40.108
(续表 1)
ME-L811.233.65.30.199ME-L914.511.420.033ME-LlO10.217.98.90.162ME-Lll24.723.45.10.295ME-L1225.113.7NGNGME-L1315.633.16.80.351ME-L148.724.810.10.218ME-L1524.830.15.50.411ME-L1620.935.617.31.287ME-L1730.520.11.30.080ME-L1825.315.72.90.115ME-L1915.620.54.20.134实施例2 菌株最佳生长温度及pH范围的测定。ME-L16菌株转接到PDA固体培养基上，25 28°C培养5 7天，孢子已经生长成 熟。用接种环挑取2环孢子于50mL的液体种子培养基中25 28°C培养2天。以10%的 接种量接入发酵培养基中培养6 8天，分别对培养温度和pH进行单因子实验，其中培养 基的PH分别调为4. 5,5. 5,6. 5,7. 5,8. 5 ；培养温度分别为20，23，25，28，30°C。测干重，同 时用GC-MS检测GLA的含量。分析菌株发酵生产GLA的最适温度和pH。从表2中可以看 出该菌的最适pH为5. 5 7. 5，从表3中可以看出该菌最适生长温度为25 28°C，而积累 GLA最多则为23°C。液体种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母膏 6g/L，KH2P043g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，
6其余为水，PH 7.0。发酵基本培养基为葡萄糖80g/L，酵母膏6g/L，KH2P043g/L，其余为水。表2不同pH下γ -亚麻酸的生产情况
PH4.55.56.57.58.5干重(g/L)1530353317γ-亚麻酸 (g/L)0.62.32.72.50.7
表3不同温度下Y--亚麻酸的生产情况
温度20 °C23 0C25 "C28 °C30°C干重(g/L)1822293024γ-亚麻酸(g/L)1.22.11.71.91.1实施例3 :ME-L16菌种的实验室培养。PDA培养基马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L，加水至1L，121 V灭菌 20min。(配制方法马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化 后补足水至1000mL。)当PDA斜面冷却后接入ME-L16菌株，25°C培养5天，将成熟的孢子用 无菌水洗下，经6 8层纱布过滤，接入摇瓶活化培养。摇瓶活化培养基包含下列组分葡 萄糖 30g/L，酵母膏 6g/L，KH2P043g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，其余为水，ρΗ 7. 0，装液量 250mL 的摇瓶装入50mL的活化培养基，120rpm, 25°C，活化3天。再将活化后的菌株接入发酵培养 基，装液量250mL的摇瓶装入50mL的发酵培养基，接种量10%，125rpm, 23°C，发酵6. 5天。 发酵培养基包含下列组分葡萄糖80g/L，酵母膏6g/L，KH2P043g/L，其余为水，pH7。结果干重:23g/L ；油含量48%，GLA/总油为19%。实施例4 利用ME-L16菌株进行摇瓶发酵。菌种活化将深黄被孢霉菌种ME-L16接于PDA斜面25°C培养5 7天。种子活化培养成熟的深黄被孢霉孢子用无菌水洗下，经6 8层纱布过滤，再用 玻璃珠打散，成均勻的孢子液。摇瓶活化培养基包含下列组分葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L， KH2P043g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，其余为水，ρΗ 7. 0，装液量250mL的摇瓶装入50mL的活化 培养基。接种量为IO6个孢子/mL。培养条件为120rpm，25°C，活化3天。发酵培养将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。装液量为250mL装入50mL的 发酵培养基，接种量为10%，温度25°C，pH7. 0，转速120rpm，周期6 8天。发酵培养基包 含下列组分葡萄糖 100g/L，酵母膏 10g/L，KH2P043g/L, NaN033g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，其 余为水，ρΗ 7.0。发酵结果干重35g/L ；油含量50%，GLA/总油为20%。
权利要求
一种深黄被孢霉，其分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ME L16，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NOM 2010195。
2.权利要求1所述的深黄被孢霉在生产Y-亚麻酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将CCTCCNO =M 2010195接种于含有碳 源、氮源和无机盐的培养基中，在23 30°C、pH5. 5 7. 5条件下，培养发酵5 8天。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、 果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、半乳糖和糖蜜中的任意一种或多种的混合物；所述氮源为 有机含氮化合物或无机含氮化合物，其中，无机含氮化合物为硝酸钾、硝酸铵、硝酸钠和氯 化铵中的任意一种或多种的混合物，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏和 麦芽浸膏中的任意一种或多种的混合物；所述的无机盐为镁盐、钾盐和钠盐中的任意一种 或多种的混合物。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种深黄被孢霉及其在生产γ-亚麻酸中的应用。该菌株分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ME-L16，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM 2010195。利用该深黄被孢霉进行发酵可生产较高浓度的γ-亚麻酸，适合工业化生产γ-亚麻酸。同时建立了一种筛选高产γ-亚麻酸菌株的方法，为进一步筛选高产菌株奠定基础。
文档编号C12N1/14GK101948759SQ20101028124
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者丛蕾蕾, 任路静, 彭超, 纪晓俊, 高振, 黄和, 黎志勇 申请人:南京工业大学