专利名称：鸡低氧适应性分子遗传标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于鸡遗传(分子)标记辅助选择技术领域，具体涉及一种鸡低氧适应的 遗传标记及其应用。
背景技术：
藏鸡是我国青藏高原特有的原始小型地方鸡种，是世界上适应高原时间最长、适 应能力最强的家鸡品种，已首批列入我国受保护的畜禽品种资源名录。与低地鸡种相比，藏 鸡的遗传基础颇具特色，即使将其引进到低海拔地区饲养和繁殖数代后，种蛋在高海拔孵 化性能仍远高于低地鸡(张浩，吴常信，强巴央宗，马雪英，唐晓惠，普布.高海拔孵化鸡胚 死亡曲线分析.中国农业大学学报，2005，10 (4) 109-114)。低地鸡在模拟4000m以上高海 拔条件下孵化时，孵化率接近零(Visschedijk A H J. Effects of barometric pressure and abnormal gasmixtures on gaseous exchange by the avian embryo. Am. Zool,1980, 20 =469-476)。13. 0%氧浓度模拟孵化结果显示，藏鸡孵化率能达到35. 0%，而低地鸡品种 (寿光鸡，隐性白羽肉鸡)只有3.0% (张浩等.小型蛋鸡及其杂交种蛋高海拔孵化性能研 究.中国农业科学，2006,39:1507-1510)。这说明藏鸡在长期适应高海拔低氧环境的过程 中，机体从遗传基础上启动或加速了许多基因的活动，调整了氧气运输功能和能量代谢，在 体内合成并贮存了一系列抵抗低氧的活性物质，是研究低氧分子机制的绝好模型。很久以来低氧适应一直是国内外生物学和医学研究的重要热点之一，但至今人 们对高原动物(包括人)的低氧适应分子遗传机理还很不清楚。研究者曾关注血红蛋白 Ιδ ^^Φ WiSjSti^'b (Monge, C and Leon-Velarde F. Physiological adaptation to highaltitude :oxygen transport in mammals and birds.Physiol Rev,1991, 71 (4) :1135-1172)，发现了一些高山动物的特异突变(Lutfullah G, Ali SA, and Abbasi AA. Molecular mechanism of high altitude respiration :primary structure of a minor hemoglobin component from Tufted duck(Aythya fuligula, Anseriformes). Biochem Bioph Res Co, 2005,326 (1) 123-130. Gou X, Li N, Lian L, Yan D, Zhang H, Wei Z, and Wu C. Hypoxic adaptation of hemoglobin in Tibetan chick embryo Highoxygen-affinity mutation and selective expression. Comp BiochemPhysiol, B, 2007，147 (2) :147-155)，但近年来的研究表明低氧适应最重要的生理机制是血管因子调节 的血液流动(Erzurum SCiFhosh S，Janocha AJjXu W, Bauer S，Bryan NS, Tejero J，Hemann CiHille R，Strehr DJiFeelisch M，and Beall CM. Higher blood flow and circulatingNO products offset high-altitude hypoxia among Tibetans.PNAS,2007，104 (45) 17593-17598)。NO是重要的血管因子，具有调节血流和血管阻力的作用(Williams几， Cartland D， Hussain A， Egginton S.Adifferential role for nitric oxide in two forms of physiologicalangiogenesis in mouse. J Physiol，2006，570 (3) :445_454)。在 低氧的诱导下，动物产生NO增加，活化含血红素的鸟苷酸环化酶，使血管平滑肌和血小板 中的cGMP水平增加，促进血管平滑肌松弛(Garthwaite J, Charles Si, Chess-Williams2/6页
R.Endothelium-derivedrelaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests as intercellar message in brain. Natrue, 1988,336 :385),维持组织毛细血管 持久性扩张，减小外周阻力，加速血液循环，改善组织获氧能力。高原藏族人(Erzurum SC, Fhosh S，Janocha AJ,Xu W,Bauer S，Bryan NS，Tejero J，Hemann C，Hille R，Strehr DJ, Feelisch M，and Beall CM. Higher blood flow and circulating NO products offset high-altitudehypoxia among Tibetans. PNAS，2007，104 (45) :17593_17598)、高原印地安 A (Beall CM. Tibetan and Andean patterns of adaptation tohigh-altitude hypoxia. Hum Biol，2000，72(l) :201_28)、高原鼠兔(吴天一.我国高原医学研究进展，高原医学杂 志，2005，15(1) :1_8)、藏绵羊(Koizumi T，Ruan Z，Sakai A，Ishizaki T，Matsumoto T， Saitou M，Matauzaki T，Kubo K，Wang Z，Chen Q，Wang X. Contribution of nitricoxide to adaptation of Tibetan sheep to high altitude. Respir PhysiolNeurobiol, 2004, 140(2) 189-196)等高山本土动物的体内有较高的NO产生量，有利于动物对高原低氧环境 的适应。NO在体内由一氧化氮合酶(NOS)催化产生，NOS有3种同功酶，其中诱导 型NOS(iNOS)受低氧诱导因子I(HIF-I)诱导表达，发挥扩张血管的作用(Smenza GL. Surviving ischemia adaptiveresponses mediated by hypoxia-inducible factor. J Clin Invest, 2000,106(7) :809_812)。Lin 等克隆 了鸡巨噬细胞 iNOS 基因的 cDNA， 长约 4. 5kb，编码 1136 个 AA(Lin AW, Chang CC, McCormick CC. Molecularcloning and expression of an avian macrophage nitric-oxide synthasecDNA and the analysis of the genomic 5' -flanking region. J Biol Chem，1996，271 (20) :11911_11919)。本发明 提供了藏鸡iNOS基因SNP分子遗传标记与其高原低氧适应的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一个鸡低氧适应性相关联的分子遗传标记，通过该遗传标 记可以预测鸡的低氧适应性，从而用于鸡的辅助育种。本发明是通过下列技术方案实现鸡低氧适应性分子遗传标记，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 1所示，该序列位 于鸡iNOS基因的5，侧翼序列，第70bp处有1个A70-C70的碱基突变，记为A70C，导致Bsm I-RFLP多态性。研究表明，A70C突变与低氧适应性相关联，CC型突变表现出更高的低氧适 应性。应理解，任何包含SEQ ID No. 1序列中A70C位点的特异性序列，都可以用于检测低 氧适应性，从而本发明分子遗传标记还包括SEQ ID No. 1中至少包含第70位碱基的特异性 片段。本领域技术人员很容易根据本发明的分子遗传标记设计出用于扩增该分子标记 的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过PCR扩增得到 所述遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过Bsm I-RFLP多态性进行检测。因 而，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以 及含有所述引物或探针的试剂盒。本发明还提供一种鸡低氧适应性分子遗传标记方法(PCR-RFLP标记)，其用SEQ ID No.2和3所示的引物以样品鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增，用Bsm I酶切PCR产物，并进行凝胶电泳检测，当70bp处的碱基都为A时，Bsm I识别该位点，记为AA型 (84bp+68bp，平原型)；当70bp处的碱基突变为C时，Bsm I识别该位点消失，记为CC型 (152bp)；杂合型记为 AC 型(152bp+84bp+68bp)。本发明进一步提供一种耐低氧鸡的选育方法，其通过检测样品鸡基因组DNA中的 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的第70位碱基，筛选出该碱基为C的鸡。具体地可以用SEQ ID No. 2和3所示的引物以样品鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化克隆测 序，来鉴定SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的第70位碱基，或者用Bsm I酶切PCR产物，并进 行凝胶电泳检测，当70bp处的碱基都为A时，Bsm I识别该位点，记为AA型(84bp+68bp，平 原型)；当70bp处的碱基突变为C时，Bsm I识别该位点消失，记为CC型(152bp)；杂合型 记为 AC 型(152bp+84bp+68bp)。本发明分子遗传标记与鸡低氧适应性相关联，通过该遗传标记可以筛选低氧适应 性较强的鸡种，从而用于鸡的辅助育种。
图1 鸡iNOS基因5，侧翼区扩增结果；琼脂糖胶浓度为2%;图中泳道M为DL2000 Marker ；泳道1_10为低地鸡中的扩增片段，泳道11_20为藏鸡中的扩增片段；片段大小均 为 152bp。图2:鸡iNOS基因Bsm I-RFLP检测结果；琼脂糖胶浓度为4 % ；图中泳道M为 DL2000 Marker ；泳道1-9为低地鸡Bsm I-RFLP电泳结果，泳道10-18为藏鸡Bsm I-RFLP 电泳结果。AA基因型，84bp和68bp ；AC基因型，152bp、84bp和68bp ；CC基因型，152bp。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1鸡iNOS基因片段的获得及SNP位点筛选选择高原地方鸡品种“藏鸡”和低地鸡“隐性白羽肉鸡”、“寿光鸡”、“北京油鸡”和 “丝羽乌骨鸡”等为试验材料(均购自中国农业大学实验种鸡场)，根据鸡iNOS基因的5’侧 翼序列(GeneBank登录号:U46503. 1)设计以下引物正向引物F 5, ACAACTTTTTAGATGTTTTCAA 3 ‘反向引物R 5 ‘ CTATGTTAAGATTCTCTATGCT 3 ‘用上述引物在藏鸡、隐性白肉鸡、寿光鸡、北京油鸡和丝羽乌骨鸡基因组DNA进 行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 50 μ L，其中 IOXPCRBuffer 5 μ L, 10mml/L dNTP mix 4μ L, 5pmol/ μ L 的引物各 2 μ L，TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L，DNA 模板 2 μ L (DNA 约 IOOng)，加 dd H2O至50 μ L。PCR反应条件为第1步95°C变性5min ；第2步95°C变性30s ；第3步50°C 复性30s ；第4步72°C延伸Imin ；重复第2至第4步36个循环，之后再72°C延伸7min，最 后降温至4°C保持。对上述4个鸡种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化、测序。上述扩增片段603bp(SEQ ID No. 6)，序 列经DNAMAN软件进行序列比对，其中位于该片段383处(位于5’侧翼-1422bp处)有A/ C碱基突变(“藏鸡”为C，其它鸡种为A)，该突变引起Bsm I酶切位点(GAATGCN)多态性。实施例2鸡iNOS基因5，侧翼区多态性PCR-RFLP检测方法的建立为了快速方便的检测鸡iNOS基因5’侧翼区多态性，针对实施例1中发现的SNP 位点设计新的扩增引物，引物序列为正向引物F 5 ‘ AACAGAGACCTGAGTTTTCTATA 3 ‘，反向引物R 5, TTCTTACATTTAGGACACTTTCA 3 ‘。用该引物对藏鸡和隐性白羽肉鸡、寿光鸡、北京油鸡、丝羽乌骨鸡等基因组DNA进 行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 50 μ L，其中 10XPCR Buffer 5 μ L, 10mml/L dNTP mix 4μ L, 5pmol/ μ L 的引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L, DNA 模板 2 μ L (DNA 约 IOOng)， 加dd H2O至50 μ L。PCR反应条件为第1步95°C变性5min ；第2步95°C变性30s ；第3步 50°C复性30s ；第4步72°C延伸30s ；重复第2至第4步36个循环，之后再72°C延伸7min， 最后降温至4°C保持。PCR扩增产物用浓度为2%的琼脂糖胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观 察，可见到片段大小为152bp的清晰条带(见图2)。该PCR产物用Bsm I内切酶酶切，反应 体系为10 X Buffer 1. 5 μ L，Bsm I 酶 0. 5 μ L (10U/μ L)，PCR 产物 7 μ L，力口 ddH20 至 15μ L。 37°C反应4-6h。然后，酶切产物在4%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中 观察(见图3)。当70bp处的碱基都为A时，Bsm I识别该位点，记为AA型(84bp+68bp，平 原型)；当70bp处的碱基突变为C时，Bsm I识别该位点消失，记为CC型(152bp，高原型)； 杂合型记为AC型(152bp+84bp+68bp)。建立了该SNP位点多态性检测的PCR-RFLP技术。实施例3本发明筛选的遗传标记在不同鸡群体中的多态性检测采用实施例2中建立的PCR-RFLP技术，对林芝藏鸡(采自平均海拔2900m的林芝 地区)、拉萨藏鸡(采自平均海拔3650m的拉萨市)、山南藏鸡(采自平均海拔3600m的山南 地区)、日喀则藏鸡(采自平均海拔3850m的日喀则地区)、尼西藏鸡(采自平均海拔3300m 的云南迪庆州)以及北京藏鸡(从西藏林芝地区引进，并饲养在北京第4代的群体)、白来 航鸡、矮小隐性白鸡、寿光鸡、丝羽乌骨鸡、北京油鸡(后6个群体均购自北京中国农业大学 实验种鸡场)等群体检测鸡iNOS基因5，上游-1422bp的PCR-Bsm I-RFLP多态性分布频 率，检测方法用实施例2所述的方法进行，检测结果如表1所示。表1鸡iNOS基因5'调控区的SNP多态性分布品种海拔N基因型频率(％)基因频率(％)(m)AAACCCAC林芝藏鸡29006021.751.626.747.552.5拉萨藏鸡36504012.552.535.038.861.2山南藏鸡36004020.042.537.541.358.7曰喀则藏鸡38504012.535.052.530.070.0尼西藏鸡33002213.650.036.438.661.4北京藏鸡5824.148.327.648.351.7寿光鸡4082.512.55.088.811.2北京油鸡3086.710.03.391.78.3丝羽乌骨鸡30100001000白来航鸡30100001000矮小鸡30100001000藏鸡的高原型突变等位基因C频率高于低地鸡群，不同地区的藏鸡群频率也存在 差别，其中日喀则藏鸡C频率最高，为70. 0% ；其次为尼西藏鸡和拉萨藏鸡，分别为61. 4% 和61.2%。林芝海拔较低，该地区藏鸡C等位基因频率也较低，为52.5%。不同地区藏鸡 的突变等位基因C频率可能与海拔有一定的关系，5个地区藏鸡C频率与海拔相关分析发 现，相关系数0. 8115，相关显著检验P值为0. 0954。结果表明突变CC型可能为藏鸡高原适 应性基因型。实施例4本发明筛选的遗传标记与低氧孵化率的关联分析及应用低氧适应性是一个复杂的性状，可能包括分子、细胞、组织、器官和整体各水平的 变化，影响鸡在高海拔环境的生长、繁殖和生产性能。低氧孵化是鸡是否能适应高原环境的 关键阶段，藏鸡在高原低氧条件下仍保持高的孵化率，本发明选择孵化率这一典型的低氧 反应敏感性状进行本发明遗传标记的效应分析。收集饲养在中国农业大学种鸡场的藏鸡种蛋，采用低氧模拟孵化机(吴常信，张 浩，苟潇.国家实用新型专利，全自动低氧模拟孵化机，专利号ZI 2004 20066829.3)，设 定氧气浓度为13.0% (相当于4000米海拔)进行低氧孵化，其余条件正常(温度37.8°C; 湿度60% ；每2小时翻蛋一次)。低氧孵化期间不开箱照蛋，保证氧浓度稳定，21天后逐一 打开死胚蛋壳鉴别死亡日龄，并采集所有死胚和活雏的组织样品。提取个体总DNA，采用实 施例2中建立的PCR-RFLP技术，鉴定13. 0%低氧孵化的藏鸡死胚和活雏的iNOS基因5’侧 翼区PCR-Bsm I-RFLP多态基因型。检测结果见表2所示。藏鸡活雏比死胚AA基因型频率 低，CC基因型频率高，而杂合基因型频率相近；卡方分析显示活雏和死胚基因型分布频率 差异显著(P <0.05)，活雏的突变等位基因C的频率升高。结果说明，藏鸡iNOS基因5’侧 翼区的该SNP与低氧适应性相关联。北京饲养的藏鸡来源于3000m左右的藏鸡群体，该SNP 的基因型分布可能已经平衡在3000m海拔左右的水平。低氧模拟孵化氧浓度为13.0%，相 当于4000m左右海拔的氧分压，这样的低氧对于该藏鸡群体可能会打破原来平衡，使有利 突变基因频率增加。表2藏鸡低氧孵化活雏和死胚间iNOS基因SNP多态分布.
类别N二倍型频率％单倍型频率％AAACCCA C北京藏鸡5824.148.327.648.3 51.7藏鸡活雏3815.847.436.839.5 60.5藏鸡死胚3426.552.920.652.9 47.权利要求
鸡低氧适应性分子遗传标记，该遗传标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或该序列中至少包含第70位碱基的特异性片段。
2.用于扩增权利要求1所述分子遗传标记的引物或鉴定权利要求1所述分子遗传标记 的探针。
3.含有权利要求1所述引物或探针的试剂盒。
4.权利要求1所述的分子遗传标记、权利要求2所述引物或探针在耐低氧鸡选育中的应用。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的鸡为藏鸡。
6.耐低氧鸡选育方法，其特征在于，通过检测样品鸡基因组DNA中的SEQID No. 1所示 核苷酸序列的第70位碱基，筛选出该碱基为C的鸡。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用SEQID No. 2和3所示的引物以样品鸡基 因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化克隆测序，来鉴定SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列的第70位碱基。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用SEQID No. 2和3所示的引物以样品鸡基 因组DNA为模板进行PCR扩增，用Bsm I酶切PCR产物，并进行凝胶电泳检测。
9.鸡低氧适应性分子遗传标记方法，其特征在于用SEQID No. 2和3所示的引物以样 品鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增，用Bsm I酶切PCR产物，并进行凝胶电泳检测。
全文摘要
本发明提供了一种鸡低氧适应性分子遗传标记，该遗传标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或该序列中至少包含第70位碱基的特异性片段。研究表明，A70C突变与低氧适应性相关联，CC型突变表现出更高的低氧适应性。通过该遗传标记可以筛选低氧适应性较强的鸡种，用于鸡的辅助育种。
文档编号C12N15/11GK101967477SQ20101050345
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者张 浩, 彭俊飞, 苟文钰, 鲍海港 申请人:中国农业大学