专利名称：一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种耐高温壳聚糖酶酵母基因工程菌的构建及其生产耐高温壳聚糖 酶的方法。属于微生物基因工程领域。
背景技术：
壳聚糖酶(Chit0SanaSe，EC. 3. 2. 1. 132)是降解壳聚糖的专一性酶，广泛存在于多 种微生物中，目前在细菌(Bacillus、Enterobacter、Myxobacter)、放线菌(Str印tomyces、 Nocardioides)、真 菌(Penicillium、Aspergillus、Rhizopus、Basidiomyce)、病 毒 (Chlorella virus PBCV_1、CVK_2)及植物的组织中均发现壳聚糖酶，但主要存在于细菌和真菌中。近年来国内关于壳聚糖酶的研究主要集中在菌株的筛选、菌株发酵条件的优化以 及酶学性质和分离纯化等方面。在现有的商品化壳聚糖酶中，由于原始的菌株产酶能力低， 纯化率和得率都不高，所以导致成品酶的产量有限且售价高。要实现工业化大规模生产高 酶活的壳聚糖酶，除了筛选高酶活的菌株外，还可通过分子生物学手段对现有的壳聚糖酶 基因进行诱变改造，实现其高水平的表达。现在商品化的壳聚糖酶在热稳定性等方面仍不足以适应工业化的要求，例如在许 多工业应用中，常是在高温条件下使用壳聚糖酶，这就对壳聚糖酶的热稳定性提出较高的 要求，但很多壳聚糖酶在温度超过40°C时，酶活降低很快。因此，迫切需要研制出一种廉价、 高效、耐高温的壳聚糖酶来解决工业的发展需求和现有的壳聚糖酶热稳定性之间的矛盾。
发明内容
本发明的目的是提出一种运用基因工程手段寻找偏爱密码改变的耐高温壳聚糖 酶基因，使其适合在毕赤酵母中高效稳定的表达，及制备该耐高温壳聚糖酶的方法。一、耐高温壳聚糖酶基因的合成GenBank accession number AY1903M所示的壳聚糖酶的氨基酸序列中，存在一 个N糖基化位点，和多个氧糖基化位点。毕赤酵母作为真核表达系统，具有糖基化翻译后修 饰功能，可使蛋白质的热稳定性得到提高。在氨基酸序列的不改变的前据下，对原始壳聚 糖酶的核苷酸序利用DNAW0RKS工具进行了优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码 组成。优化后的核酸序列hbcsn与原始csn序列(GenBank accession number AY190324) 相比，有147个核苷酸发生了变化，核苷酸的同源性为77%，同时为了使壳聚糖酶在毕赤酵 母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的壳聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的17个 氨基酸。然后根据优化后的序列设计引物，利用套叠PCR的方法合成该基因。设计的引物 长度为48-5^p，相邻两引物之间有20bp左右的重叠序列，Tm值为58-62°C，所有的引物均 在invitrogen公司合成。将所有的引物加入反应体系中，进行PCR扩增。PCR扩增的条件 为98°C 30s, 58°C 30s 72°C lmin，共 25 个循环，最后 72°C 7min。050U二 一 二 二 二 二…二 二二二二 三二 - 二 Ξ二 二 二 二 。寸9 LLLoxluBvgwIaaLvaLVCJvoaLVoowislvomDVowoovwoaLLUol03寸csoqqI—(SJj33y33DK}LLOUXV30m}wc:§33vnLLLo§§3w8v3vomnL 0 Cwo一二 Ξ二 三Il 二 一一 一一 二 二二一一二 ΞΙΙ 二 二 二三三S。§§s§13w3:mLwmo§lox3001vmLovmvyvDolv390 § Cwo三二二一二一 I Ξ 二 二 二 二 三三三三 二二二 Ξ二 一一 § LLW§vllv3vllw31093WSJlxovsmxLVXXomc)xlv33w30iv§sgusoqll τ—I寸 iv3vaL0v3XO0wau0w:mLaL3v3DVSV8vws￡0§101vx333:}v3 scoCwo三 二 二 二Ξ 三二 三二 =--三二 三===二 二 二 09COSBW3v330WEovw:nDlxvaLVOW8wmLLLmLLc5m§ivo οΓΟ§φ Ι2ε aLVCJwyovoosvimDJLVCmLUowowoliOVooaLCJwaLmxIOSoCN62 §二二 二 …一 Ξ 二 二 三三二 Ξ 二 一-三Zr二 二三 二οοε LLVlw!301VOQ!lDvaDluv§luowoWLLaLvamowuxDDIDW￥o55csl§3qq 62 3999vomOmOVo。wo3iD91owamxxnL3w3w:O9§3voDOX3vo0 us。=二 二 二 二 三二 ΞΞ二 = 二 二…三 二 二 二 二 二 。寸 2 109w3§IaLvoaLVo3wloimLowl8IDOV3x3w〕wl30voaLVoloLLVoIsusoqq1-4 Llv。mLVJLW8vm達woammL3slLLlvyJL§:mlvc_)vo§ 0 i三三二 二 二三二 二 二 二 =三二三三二 二 = 二 = 081—ιS一§2swv。5moowmu3mLuvaLLUV130mmuvs§ 3UJJG UI SSLL9vaLU319w§wyvmLV3mLW33vaLL§ww§x:m3 3 §|三|| 三三二 二三ΞΞΞIz三二 二 二 二 二 二 02 1013vmmlDlc)wlo9waDLmLVo§3wlDV3LLV§wx:nLD3s 19 usoqq Ι—ι03。J2alwwswovovwuvimDSV:}￥mLDWovmmu_viCV3S §三三二三三二 = 二三=二 二三二三三--二 = 090vmLLOLWVi8wiv39_v8vlllvw39w9mw0w:mvsw0vi Ssoqq〔6000U月聆懒潞幽) go Sw goi ^^Ml^is^i 〔800s 陔 卜/2iFs^< 69ε 9022 Zo
权利要求
1. 一种耐高温壳聚糖酶的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如下tacaacctacccaacaatttgaagcaaatttacgataagcataagggtaaatgttctaag60gtccttgctaagggattcactaacggtgatgcttctcaaggtaagtctttttcttactgt120ggagatattcctggtgctattttcatttcttcttcaaaaggttacacaaacatggatatt180gattgtgatggagctaacaactcagctggtaagtgcgctaacgatccatctggtcaaggt240gaaactgcttttaagtctgatgttaagaagtttggtatttctgacttggatgctaatatt300catccatacgttgtttttggtaacgaagatcattctccaaagtttaagccacaatctcat360ggtatgcaaccattgtctgttatggctgtagtttgtaacggtcaattacattacggaatt420tggggtgatactaatggtggtgtttctactggtgaggcatcaatttccttggctgatttg480tgttttccaaacgaacacttagatggtaaccatggacatgatcctaacgaCgttttgttt540attggtttcacttcaaaggatgctgttccaggtgctactgccaagtggaaggctaagaac600gctaaggaattcgaagattctataaagtctattggtgacaagttggttgctggtttgaag660gcttaa666 ο
2.一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌(is 115/HBCSN，简称为HBCSN，其保藏号为CCTCC No :M 2010206。
3.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于摇瓶生产步骤为将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在-30°C培养46-48小时，离心， 再把菌体转入到BMMY中，进行诱导表达，每M小时向培养基中加入100%甲醇至甲醇的终 浓度为1 %，诱导六天，离心发酵液，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。
4.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于发酵罐生产步骤为1)、种子培养基的制备为将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在 28 0C -30°C 培养 46-48 小时；2)、接种按5%(种子培养基的体积/发酵罐中初始培养基的体积)的比例把种子培 养基接入发酵罐中，发酵罐中的初始培养基为BMGY ；3)、第一阶段为菌体生长阶段，发酵参数为温度^°C，pH5.8，通风量为0. 5vvm,搅拌 速度250-700转/分，溶氧量30%，自接种开始10-14小时后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此 时流加50%甘油(W/V)混合物，当菌体密度OD6tltl = 300-320时停加甘油混合物，准备转入 第二阶段，50%甘油(W/V)混合物成分为每升50%甘油混合物中含有12mLPTMl微量元素 混合物；PTMl微量元素混合物组分为五水硫酸铜6. 0，碘化钠0. 08, 一水硫酸锰3. 0, 二水 钼酸钠0. 2，硼酸0. 02，氯化钴0. 5，氯化锌20，七水硫酸亚铁65，生物素0. 2，浓硫酸9. 2，以 上单位均为g/L ；4)第二阶段为诱导阶段，发酵参数为温度25°C，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度 680-700转/分，溶氧量30%，当停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有 12mL PTM1)进行诱导，诱导144-146小时左右；5)离心去除菌体，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。
全文摘要
本发明提供了一种编码重组的耐高温壳聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株Gs115/HBCSN及其生产耐高温壳聚糖酶的方法。本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性，对原始的Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶基因(GenBankTM accession number AY190324)进行了优化，优化后的核酸序列与原始核酸序列的同源性为77％。本发明中重组的毕赤酵母生产的壳聚糖酶以可溶的形式分泌到胞外，表达量高达3mg/mL，酶活可达25000U/mL。该壳聚糖酶在毕赤酵母中糖基化修饰后具有极好的耐热性，具体表现为在80℃处理120min，90℃处理40min，100℃处理20min后各自的残余活性分别为56％，87％，87％。本发明提供的耐高温壳聚糖酶特别适合大规模工业化降解壳聚糖，减少环境污染。
文档编号C12N15/56GK102051369SQ20101050742
公开日2011年5月11日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者余晓岚, 陈小梅, 马立新 申请人:湖北大学