专利名称：包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶反应的应用的制作方法
技术领域：
本发明属包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的应用领域，特别是涉及一种包裹 纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。
背景技术：
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种在体外模拟自然DNA 复制的核酸扩增技术。该技术由K. Mullis于1985年发明，他本人也因此于1995年获得了 诺贝尔化学奖。PCR技术模拟了体内DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构 成即在高温(95°C )下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低 温(37 55°C)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部 分双链；在Taq DNA聚合酶的最适温度(72°C )下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸 为原料，沿模板以5’ 一 3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次 解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，PCR产物 得以2n的指数形式迅速扩增，经过25 30个循环后，理论上可使基因扩增IO9倍以上。短短几十年，PCR技术因其特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、 可定量模板数等优点，在生物科学众多领域的应用日趋广泛。在分子生物学研究中，PCR是 必备的基础技术之一；在医学临床诊断方面，实时定量PCR技术已应用于乙肝病毒、HIV病 毒的检测；应用PCR技术还可检测正在繁殖的病原体或处于潜伏期的病原体，尤其对于目 前尚不能在体外培养或难以培养的病原体，其检测结果对临床诊断有重要的参考价值；PCR 技术在法医鉴定、古生物学研究等方面也有不可替代的作用。尽管PCR技术已经日益成为一个成熟的技术，但实际操作中，进行PCR扩增仍旧存 在一些需要改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题。最突出的问题就是PCR扩增 存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的DNA链式扩增反应，机制非常复杂，在 链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成 二聚体等引起的扩增等等。科学家们从不同的角度来尝试解决这个问题，如从模板、引物、 Mg2+浓度、退火温度等角度改善其特异性，或者将增效剂如甲酰胺、甘油、二甲基亚砜，甜菜 碱、氯化四甲基铵等引入PCR体系。但是在实际应用过程中，有些效果却不尽如人意，甚至 会抑制PCR的扩增过程。经对现有技术文献的检索发现，美国专利US PATENT 5，646，019公开了“一种利于 引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB， single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB 蛋白只结合单链DNA，但不结合双 链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了 PCR扩增的优化。由 于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒 非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严 格贮存于-20°C，并且其生物活性保持期限较短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在 聚合酶链式反应中的应用，扩增效果显著，成本低廉，应用广泛。本发明的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。具体步骤包括(1)按照常规方法制备PCR反应体系，包括合适用量的DNA聚合酶、引物、模板、 dNTP、PCR缓冲液等；(2)进行PCR反应；第一次扩增完成后对产物进行检测；(3)制备再扩增体系体系组成与上述第一次扩增相同，但模版为稀释1000倍的上述第一次扩增产物， 引物序列不变；加入包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物进行扩增；所述扩增程序与第一 次扩增条件相同。所述步骤(1)或(2)均为常规方法。所述步骤⑵PCR产物检测可以采用多种检测方法，如对扩增后的DNA样品进行琼 脂糖凝胶电泳检测，或对扩增后样品进行毛细管电泳检测，或在实时定量PCR仪上进行实 时定量检测PCR的实时扩增过程。树状大分子是一类树枝状结构的高度单分散的合成性大分子，它的几何形状和化 学结构精确可控。它具有非常精确的核、内部空间和表面功能基团。它的分子量随着代数 的增加而精确的增加，在代数增加至4代时，整个分子呈球形结构。这类分子具有精确的表 面功能团，很容易进行修饰和改性。适合的树枝状聚合物实例见Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 1990,29(2)第 138-175 页所述。所述的树状大分子是聚酰胺-胺型或聚丙烯亚胺型dendrimer。其中聚酰胺-胺 型聚合物是以乙二胺或丁二胺为核生长的。随着代数的增加，树状大分子的末端氨基基团 呈指数增长，即末端氨基基团数=2(f +2)。本发明优选的是基于乙二胺核的聚酰胺-胺型 (PAMAM)dendrimer。所述基于乙二胺核的聚酰胺-胺型树状大分子的代数以3. 0到8. 0(G3 G8)为 佳，优选聚合度5. O(G5)的聚酰胺-胺型dendrimer。目前其制备方法是公知的，具体制法
(Macromolecules, 1986,19, 2466 ；Tomalia, D. A. ；Frechet, J. M. J. Dendrimers andOther Dendritic Polymers. New York, John Wiley & Sons Ltd,2001)。所述包裹纳米金颗粒的 PAMAM dendrimer 复合物(PAMAM dendrimer entrapped goldnanoparticles，Au DENPs)为水溶液，可以自制纳米金颗粒与第五代dendrimer (G5. NH2) 一定摩尔比的样品，目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献(Soft Matter, 2007，3，71-74 Journal of Physical Chemistry C，2010，114，50-56)，优选的 Au/G5. NH2 摩尔比为 25 1,50 1,75 1,100 1。图 1 为 Au/G5. NH2 摩尔比为 50 1 的 Au DENPs 复合物分子动力学模拟结构图。所述Au DENPs复合物表面氨基可以部分或全部连接上各种修饰官能基团，优选 来自下列基团的修饰基团乙酰基和羟基。末端基团的修饰方法是公知的(Soft Matter, 2007，3，71-74)，可以通过使dendrimer表面氨基全部或部分与合适的反应剂反应来获得。Au DENPs合成过程及末端氨基的修饰反应见图2。在实际应用中，将有效量的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物作为添加剂加入 到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。 针对Au DENPs复合物纳米金颗粒与dendrimer摩尔比不同，末端端基不同，聚合酶链式反 应体系不同，产生优化作用的所需添加的该复合物有效用量范围是不同的。本领域技术人 员可以方便地通过下述方法来实验得出有效用量针对不同聚合酶链式反应体系，不同端基和Au/dendrimer摩尔比的树状大分子 复合物产生优化作用的有效用量范围通过以下方法进行确定通过对该种Au DENPs复合 物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达 到优化目的的范围为所需该Au DENPs复合物的有效用量范围。所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的有效用量为 0. 3ηΜ-1· ΟμΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au G5. NH2摩尔比为 25 l的{(Au°)25-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系 0. 4ηΜ 0. 57ηΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au 65.冊2摩尔比为 50 l的{(Au°)5(l-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系 0. 4ηΜ 0. 49ηΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au G5. NH2摩尔比为 75 l的{(Au°)75-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反应体系0. 39ηΜ 0. 51ηΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为Au G5. NH2摩尔比为 100 l的{(Au°)1(1(1-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR 反应体系 0. 31ηΜ 0. 43ηΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100%末端氨基羟基化的 Au 65.冊2摩尔比为50 l的{(Au°)5(1-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反 应体系 0. 42ηΜ 1. 35ηΜ。所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100%末端氨基乙酰化的 Au/G5.冊2摩尔比为50 1的{(Au°)5Q-G5. NH2}DENPs，有效用量范围为每25yL PCR反应 体系 42. 85nM 0. 96 μ Μ。所述聚合酶链式反应体系可以是那些容易产生非特异性扩增的体系、GC含量高的 扩增体系、模板数为低拷贝(小于IO3)的体系、复杂基因背景体系或包含上述数种因素的 体系。例如，产生非特异性扩增的PCR再扩增体系可以作为一个典型的体系。PCR再扩增 体系是指以第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，进行第二次扩增。当以第一 次扩增的产物稀释1000倍作为第二次扩增的模板，且在常规PCR扩增体系下进行扩增时， 会产生大量的非特异性扩增产物，而如果在该PCR体系中加入适量的特定末端端基的树枝 状聚合物材料，则能够消除这些非特异性扩增，在琼脂糖凝胶电泳图上得到单一的目标产 物；所述聚合酶链式反应体系也可以是扩增大鼠Thy-I基因的扩增体系。所述的PCR体系的一般组成成份见于各种常用分子生物学工具书或各种商业聚 合酶说明书。以Takara公司Ex Taq酶为例，一个PCR扩增反应的组成为
权利要求
一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反 应中的应用，其特征在于具体步骤包括，(1)按照常规方法制备PCR反应体系；(2)进行PCR反应；第一次扩增完成后对产物进行检测；(3)制备再扩增体系体系组成与上述第一次扩增相同，但模版为稀释1000倍的上述第一次扩增产物，引物 序列不变，加入包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物进行扩增；所述扩增与第一次扩增条 件相同。
3.根据权利要求2所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反 应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物中树状 大分子的末端基团为氨基、乙酰基、羟基，或者部分的乙酰基或羟基；树状大分子是代数从 3. 0到8. 0的基于乙二胺核的聚酰胺-胺型dendrimer。
4.根据权利要求2或3所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链 式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物是 Au dendrimer摩尔比为25 1,50 1,75 1,100 1的代数为5. 0的基于乙二胺核 的聚酰胺_胺型dendrimer。
5.根据权利要求2所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反 应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物的有效 用量的确定，通过对该种复合物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链 式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该复合物的有效用量范围。
6.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶 链式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为 Au 65.冊2摩尔比为25 l的{(Au°)25-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反 应体系0. 4nM 0. 57nM。
7.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链 式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为 Au 65.冊2摩尔比为50 l的{(Au°)5(1-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反 应体系0. 4nM 0. 49nM。
8.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链 式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为 Au 65.冊2摩尔比为75 l的{(Au°)75-G5·NH2}DENPs，有效用量范围为每25μL PCR反 应体系 0. 39nM 0. 51nM。
9.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链 式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为 Au 65.朋2摩尔比为100 l的{(Au°)1(1(1-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25μLPCR反 应体系 0. 3 InM 0. 43nM。
10.根据权利要求2或5所述的一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链 式反应中的应用，其特征在于所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100%末端氨基羟基化的Au 65.冊2摩尔比为50 1的{(Au°)5Q-G5.NH2}DENPs，有效用量 范围为每25 μ L PCR反应体系0. 42ηΜ 1. 35ηΜ ；或所述步骤(3)中的包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物为100%末端氨基乙酰化的 八11/65.冊2摩尔比为50 1的{(Au°)5Q-G5.NH2}DENPs，有效用量范围为每25yL PCR反应 体系 42. 85nM 0. 96 μ Μ。
全文摘要
本发明涉及一种包裹纳米金颗粒的树状大分子复合物在聚合酶链式反应中的应用。本发明扩增显著，成本低，应用广泛，添加剂易于保存；在基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片等领域有着潜在而巨大的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101974628SQ201010506888
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者史向阳, 曹雪雁, 陈晶晶 申请人:东华大学